郭 愷，王旭紅 ，郭文華，李洪喆

（1.赤峰市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

新生仔豬腹瀉綜合征的病理損傷關(guān)鍵點為新生仔豬胃腸道黏膜屏障受損、離子通道失去調(diào)控功能及機體能量耗竭，最終消化道防御屏障被打破，病原體侵入引發(fā)混合感染。小檗堿又稱黃連素，是一種從小檗科、罌粟科、毛茛科及蕓香科等植物中提取所得的異喹啉類生物堿，也可通過人工合成獲得[1]。小檗堿具有良好的抗菌活性，對多種病原體有抑制作用，并對霍亂和大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素有抵抗作用。在臨床上小檗堿已被廣泛應(yīng)用于治療胃腸炎和腹瀉，尤其對細菌性腹瀉、腸道寄生蟲感染性腹瀉以及病毒性腹瀉等癥狀具有良好的改善效果[1-7]。

既往的研究認為，小檗堿是通過抑菌作用來治療腹瀉，但這種說法并不全面。因此，為了進一步探討小檗堿治療腹瀉的作用機制，本試驗通過研究復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬生長性能、腹瀉程度、免疫功能及腸黏膜通透性的影響，探討復(fù)方小檗堿舔劑抗腹瀉的作用機理，從而降低新生仔豬的腹瀉發(fā)病率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

復(fù)方小檗堿舔劑由赤峰市動物疫病預(yù)防控制中心實驗室研制，其主要成分為硫酸小檗堿、蒙脫石粉以及硫酸黏桿菌素等。試驗新生仔豬購自內(nèi)蒙古赤峰市某豬場。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

選用1日齡自然分娩杜大長三元雜交仔豬24頭，體重（1.49±0.18）kg左右，隨機分為 3 組，每組 8頭。分別為對照組、黏桿菌素組及復(fù)方小檗堿舔劑組。黏桿菌素組、復(fù)方小檗堿舔劑組分別按照2 mL/kg劑量于第1、7及14天給藥，試驗期21 d。試驗期間，新生仔豬在產(chǎn)床保育箱內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)并進行疫苗免疫。

1.3 樣品采集與測定

1.3.1 新生仔豬生長性能的測定。在試驗開始時測量仔豬初始體重，并在仔豬7、14及21日齡時，于早晨8：00稱重，記錄體重，計算平均日增重及增重速度。

1.3.2 仔豬免疫功能檢測。在第7、14及21天對仔豬進行前腔靜脈采血，血清樣品在-20℃凍存待測。通過檢測仔豬血清免疫球蛋白（IgA、IgG及IgM）含量來評價免疫功能。血清中IgA、IgG及IgM采用免疫透射比濁法進行測定，試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，利用邁瑞B(yǎng)S-800型全自動生化分析儀檢測。

1.3.3 腸黏膜通透性的血清學檢測。二胺氧化酶（DAO）可以作為腸黏膜通透性的標志酶，其活性改變反映仔豬腸黏膜通透性變化。血漿中DAO的含量采用試劑盒測定，試劑盒購于南京建成生物工程有限公司，利用邁瑞B(yǎng)S-800型全自動生化分析儀檢測。

1.3.4 仔豬腹瀉程度的觀察。在第7、14及21天統(tǒng)計腹瀉率與腹瀉頻率。通過計算新生仔豬的腹瀉率與腹瀉頻率來測定仔豬的腹瀉程度。腹瀉相關(guān)計算公式：

腹瀉頻率/%=（腹瀉頭數(shù)×腹瀉天數(shù)）/（總頭數(shù)×試驗天數(shù)）×100；

糞便指數(shù)=糞便評分之和/總頭數(shù)

1.3.5 復(fù)方小檗堿舔劑的臨床療效觀察。通過糞便評分定量反映新生仔豬腹瀉情況（表1）。當新生仔豬糞便評分＞1時記為一個腹瀉日。當新生仔豬糞便評分＞3時，證明腹瀉程度嚴重，判定為發(fā)生臨床腹瀉。試驗全程觀察并記錄新生仔豬腹瀉情況，用腹瀉頻率和糞便指數(shù)等指標反映腹瀉程度。

表1 新生仔豬腹瀉評分標準

以腹瀉評分≥3的哺乳仔豬腹瀉病例為治療對象，選取1～7日齡腹瀉仔豬30頭、8～21日齡腹瀉仔豬60頭，共計90頭，口服藥物進行治療試驗，劑量為4 mL/kg體重，連續(xù)用藥5 d。5 d和10 d后分別統(tǒng)計腹瀉的治愈率及轉(zhuǎn)歸情況。

治愈率/%=恢復(fù)健康頭數(shù)/腹瀉病例總頭數(shù)×100

1.4 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)通過Excel作圖，用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行處理，采用單因子方差法分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬生長性能的影響

2.1.1 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬體重的影響。試驗期內(nèi)新生仔豬體重變化見表2。新生仔豬平均初生重為（1.49±0.18）kg。各組仔豬體重在第 7、14 和 21 天清晨無明顯差異（P>0.05），但復(fù)方小檗堿舔劑組的仔豬體重在一定程度上高于對照組和黏桿菌素組。

表2 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬體重的影響

2.1.2 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬增重速度的影響。新生仔豬體重增速見表3。分為3個時段進行比較，分別為初生～第7天、第8～14天及第15～21天。由表3可知，各組間仔豬增重速度差異不顯著（P>0.05)?？傮w看來，初生至第7天仔豬增重速度為 [（108.52±58.78）g/（頭·d）]，第 8～14 天為[（180.78±61.95）g/（頭·d）]，第 15～21 天為[（270.64±65.83）g/（頭·d）]，各時段各組間差異均不顯著（P>0.05)。但復(fù)方小檗堿舔劑組仔豬的增重速度不僅在一定程度上高于其他各組，還高于總體的平均增速。

表3 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬增重速度的影響 g/(頭·d)

2.2 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬腹瀉程度的影響

由表4可知，與對照組和黏桿菌素組相比，復(fù)方小檗堿舔劑組在第7、14和21天未出現(xiàn)腹瀉仔豬。與對照組相比，黏桿菌素組的腹瀉頻率極顯著降低（P<0.01）。

表4 新生仔豬腹瀉程度的變化

2.3 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬免疫功能的影響

圖1A-C為各組IgA、IgG及IgM含量的變化。在第7、14和21天時，除第7天時IgM的含量與對照組和黏桿菌素組比較無顯著差異外（P>0.05），復(fù)方小檗堿舔劑組的IgA、IgG及IgM含量均顯著高于其余各組（P<0.05）。

圖1 仔豬血清免疫球蛋白含量的變化

2.4 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬腸黏膜通透性的影響

由圖2可知，復(fù)方小檗堿舔劑組DAO活性均低于同一時間點的對照組和黏桿菌素組，且呈現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）。

圖2 仔豬腸道通透性檢測結(jié)果

2.5 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬腹瀉的臨床療效

2.5.1 復(fù)方小檗堿舔劑對腹瀉仔豬的抗腹瀉效果。由表5可知，對于仔豬腹瀉采用黏桿菌素與復(fù)方小檗堿舔劑治療均有效，但是黏桿菌素的臨床療效明顯低于復(fù)方小檗堿舔劑。1～7日齡腹瀉仔豬共治療30頭，其中黏桿菌素組治愈6頭，治愈率為60%，死亡2頭，死亡率為20%；復(fù)方小檗堿舔劑組治愈15頭，治愈率為75%，死亡3頭，死亡率為15%；8～21日齡腹瀉仔豬共治療60頭，其中黏桿菌素組治愈15頭，治愈率為75%，死亡2頭，死亡率為10%；復(fù)方小檗堿舔劑組治愈36頭，治愈率為90%，死亡 1頭，死亡率為2.5%。

表5 復(fù)方小檗堿舔劑對仔豬黃白痢的臨床治療效果

2.5.2 復(fù)方小檗堿舔劑對腹瀉仔豬腹瀉程度的測定結(jié)果。由表6可知，對于腹瀉病豬進行黏桿菌素治療，效果雖較為明顯，但臨床復(fù)發(fā)率很高，糞便指數(shù)變化明顯。復(fù)方小檗堿舔劑治療組療效顯著，腹瀉頻率與黏桿菌素組相比極顯著降低（P<0.01），可見復(fù)發(fā)率得到了抑制。同時，與黏桿菌素組相比，復(fù)方小檗堿舔劑組的糞便指數(shù)極顯著降低（P<0.01），表明復(fù)方小檗堿舔劑對健康仔豬的糞便影響較小。

表6 腹瀉仔豬腹瀉程度的變化

3 討論

3.1 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬增重的影響

通過3次給新生仔豬進行口服應(yīng)用，結(jié)果顯示，復(fù)方小檗堿舔劑和黏桿菌素，在仔豬體重及增重速度方面影響較小，均無顯著性差異，但整體呈現(xiàn)逐漸增加趨勢。小檗堿和硫酸黏桿菌素聯(lián)合應(yīng)用，既有營養(yǎng)又具有抗菌、調(diào)節(jié)臟腑機能及增進食欲等功效，現(xiàn)已常被用作畜禽飼料添加劑，能夠提高動物生產(chǎn)力，減少動物疾病的發(fā)生，同時具備無殘留的優(yōu)點[8-11]。

3.2 復(fù)方小檗堿舔劑對新生仔豬腹瀉程度的影響

小檗堿能夠降低由霍亂毒素引起的腸道水及電解質(zhì)的分泌[12]，并可殺死霍亂弧菌[13]。大腸桿菌的體外研究表明，硫酸小檗堿能夠抑制細菌黏附到黏膜或上皮表面，進而抑制菌毛結(jié)構(gòu)的形成[14]。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對福氏志賀菌Ⅱ型、痢疾志賀菌Ⅰ型、鮑氏志賀菌Ⅰ型和痢疾志賀菌Ⅱ型均有抑制作用[15]。本研究結(jié)果表明，黏桿菌素及復(fù)方小檗堿舔劑均可以有效預(yù)防新生仔豬腹瀉。復(fù)方小檗堿舔劑的主要成分為鹽酸小檗堿、黏桿菌素及蒙脫石，其中小檗堿和黏桿菌素能夠顯著抑制病原菌數(shù)量，而蒙脫石對致病菌有吸附作用，三者聯(lián)合應(yīng)用可進一步發(fā)揮抗菌作用，表明鹽酸小檗堿、黏桿菌素及蒙脫石聯(lián)合應(yīng)用具有較強的預(yù)防腹瀉作用。

3.3 復(fù)方小檗堿舔劑對仔豬免疫功能的影響

免疫球蛋白主要為IgA、IgG和IgM 3種，初乳中免疫球蛋白主要是IgG，可占初乳免疫球蛋白的85%～90%，IgG是仔豬體液免疫的重要標志。隨著仔豬日齡的增加，通過初乳吸收進入仔豬體內(nèi)的母源抗體的作用會逐漸降低，仔豬的小腸逐漸發(fā)育成熟，腸道的黏膜免疫力逐漸增強，仔豬能夠獲得母源抗體的機會逐漸減少[16-18]。小檗堿具有顯著的抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用，同時也具有提高免疫力作用，能夠提高仔豬體內(nèi)免疫球蛋白的含量并穩(wěn)定其水平[19-20]。本研究結(jié)果顯示，復(fù)方小檗堿舔劑對仔豬血清中IgA、IgG及IgM含量影響趨勢基本一致，對照組隨著時間延長呈現(xiàn)下降趨勢，復(fù)方小檗堿舔劑組隨著時間延長呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，而且IgA、IgG及IgM含量高于同一時間的對照組與黏桿菌素組，說明復(fù)方小檗堿舔劑中的小檗堿和蒙脫石發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠有效提高新生仔豬的免疫力。

3.4 復(fù)方小檗堿舔劑對仔豬腸道通透性的影響

血液中DAO的活性可間接反映腸黏膜的完整性及損傷程度，是監(jiān)測腸道屏障功能的關(guān)鍵指標[21]。DAO是哺乳動物小腸黏膜上層絨毛中的細胞內(nèi)酶，其高度酶活性與黏膜細胞的核酸和蛋白合成過程密切相關(guān)。當腸道黏膜受損時，DAO從小腸黏膜釋放到血液中，使其血液中的含量顯著增加[22-23]。此前，大量研究對小檗堿的抗腹瀉機制進行了探討，認為小檗堿主要是通過參與抑制腸道平滑肌運動并延遲腸道排空時間發(fā)揮抗腹瀉作用，其作用機制是通過抑制腸平滑肌細胞膜表面特定的K+通道及依賴Ca2+激活的K+通道的開放，從而減少K+外流。抑制電壓門控Ca2+通道，減少胞內(nèi)Ca2+釋放，減少Ca2+內(nèi)流，影響胃腸道平滑肌的收縮耦聯(lián)[24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)方小檗堿舔劑組的DAO活性均低于同一時間點的對照組和黏桿菌素組，而且呈現(xiàn)出極顯著差異。因此，復(fù)方小檗堿舔劑能夠有效調(diào)控離子通道及離子流向，抑制腸道平滑肌運動，進而發(fā)揮調(diào)控腸黏膜通透性的作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，復(fù)方小檗堿舔劑能夠提高仔豬的生長性能，降低新生仔豬的腹瀉率和腹瀉頻率，提高血清中免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）的含量，并有效地調(diào)控腸黏膜的通透性，治療新生仔豬腹瀉病。提示復(fù)方小檗堿舔劑可以提高新生仔豬免疫功能，調(diào)控腸黏膜的通透性，這可能是其抗腹瀉功效的重要機制之一。