趙麗娜 閆麗雋 范麗君

人乳頭瘤病毒（human papil loma virus，HPV）感染、特別是HPV16 及HPV18 等高危型HPV 感染是宮頸癌發(fā)病的獨立危險因素［1］。微小RNA（microRNA，miR）是一類具有廣泛生物學(xué)作用的非編碼小分子RNA，病毒感染可能通過改變miR 表達的方式進一步引起下游癌基因表達的變化，進而導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［2］。miR-let-7d-5p是一種具有抑癌作用的miR，在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中通過靶向抑制高遷移率族蛋白A1（High mobility group protein A1，HMGA1）表達的方式抑制癌細胞的增殖、遷移、侵襲［3］。張鵬飛在HPV16 陽性的宮頸癌細胞中觀察了miR-let-7d-5p的生物學(xué)作用，結(jié)果證實HPV16 陽性的宮頸癌細胞中miR-let-7d-5p的表達水平顯著降低，過表達miR-let-7d-5p顯著促進癌細胞的凋亡并抑制癌細胞的遷移、侵襲［4］，這一結(jié)果表明miR-let-7d-5p的低表達可能參與高危型HPV 感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的過程。本研究將分析高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達的相關(guān)性及臨床意義，旨在為深入認識高危型HPV 感染導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生發(fā)展的生物學(xué)機制提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020 年4 月至2021 年4 月期間在山西省腫瘤醫(yī)院接受根治性手術(shù)的114 例宮頸癌患者作為研究對象，年齡平均（52.83±9.21）歲，F(xiàn)IGO 分期Ⅰ期48 例、ⅡA 期66 例，鱗癌79 例、腺癌18 例、腺鱗癌17 例。術(shù)后留取宮頸癌組織和癌旁組織（距離病灶邊緣≥5 cm），用于高危型HPV 檢測及基因表達檢測。納入標準：①參照指南［5］，經(jīng)術(shù)后病理診斷為宮頸癌；②參照指南［5］，F(xiàn)IGO 分期Ⅰ～ⅡA期；③按要求留取組織樣本；④臨床病理資料完整。排除標準：①術(shù)前接受過放化療；②合并急慢性感染、免疫系統(tǒng)疾?。虎奂韧衅渌麗盒阅[瘤病史。所有患者及家屬均簽署知情同意書。本研究取得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 高危型HPV 的檢測

取宮頸癌組織，采用基因組DNA 提取試劑盒分離提取基因組DNA，設(shè)計HPV16基因及HPV18基因的特異性引物，分別進行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)程序：95℃5 min 后95℃1 min、55℃30 s、72℃30 s，重復(fù)40 次后得到PCR 產(chǎn)物。在2%瓊脂糖凝膠中對PCR 產(chǎn)物進行電泳，在紫外凝膠成像儀（WD-9413A，濟南童鑫生物科技公司）顯影得到圖像，HPV16基因的PCR 產(chǎn)物長度為152 bp、HPV18基因的PCR 產(chǎn)物長度為471 bp。

1.2.2miR-let-7d-5p、HMGA1表達的檢測

取宮頸癌組織，采用總RNA 提取試劑盒提取RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR 試劑盒對cDNA 中的目的基因miR-let-7d-5p、HMGA1及內(nèi)參基因U6進行擴增，反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL、試劑盒內(nèi)反應(yīng)混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水7.8 μL；反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性3 min 后95℃15 s、特異性退火溫度（miR-let-7d-5p60℃、HMGA162.0℃、β-ɑctin58.0℃）25 s、72℃30 s，重復(fù)40 次后得到PCR 反應(yīng)的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（Cycle threshold，Ct），以U6為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計算HMGA1的mRNA 表達水平。

1.2.3 預(yù)后的隨訪

采用電話回訪、門診復(fù)診等方式進行隨訪，隨訪截止至2022 年3 月31 日，隨訪內(nèi)容包括患者發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及死亡的情況，分別計算累積無進展生存率和累積總生存率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以（±s）表示、兩組間比較采用獨立樣本t檢驗、多組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗；預(yù)后采用K-M 曲線表示，組間比較采用log rank 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織高危型HPV 的PCR 檢測結(jié)果

宮頸癌組織中HPV16及HPV18基因PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1，HPV16基因的PCR 產(chǎn)物長度為152 bp、HPV18基因的PCR 產(chǎn)物長度為471 bp。宮頸癌組織高危型HPV 陽性99 例、陰性15 例，高危型HPV 感染率86.74%。

圖1 宮頸癌組織中HPV16 及HPV18 基因PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of HPV16 and HPV18 gene PCR products in cervical cancer

2.2 宮頸癌組織與癌旁組織中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平的比較

宮頸癌組織中miR-let-7d-5p的相對表達水平低于癌旁組織，HMGA1的mRNA 相對表達水平高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 宮頸癌組織與癌旁組織中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels between cervical cancer and adjacent tissues（±s）

表1 宮頸癌組織與癌旁組織中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels between cervical cancer and adjacent tissues（±s）

組織宮頸癌組織癌旁組織t 值P 值n 114 114 miR-let-7d-p 0.72±0.19 1.00±0.17 11.627 0.000 HMGA1 1.35±0.31 1.00±0.19 10.278 0.000

2.3 高危型HPV 陽性與陰性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平的比較

高危型HPV陽性的宮頸癌組織中miR-let-7d-5p的相對表達水平低于高危型HPV 陰性的宮頸癌組織，HMGA1的mRNA 相對表達水平高于高危型HPV 陰性的宮頸癌組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 高危型HPV 陽性與陰性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels in high-risk HPV positive and negative cervical cancer（±s）

表2 高危型HPV 陽性與陰性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平的比較（±s）Table 2 Comparison of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels in high-risk HPV positive and negative cervical cancer（±s）

高危型HPV陽性陰性t 值P 值n 99 15 miR-let-7d-5p 0.71±0.19 0.84±0.14 2.543 0.012 HMGA1 1.39±0.30 1.13±0.26 3.189 0.002

2.4 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平的相關(guān)性

高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p的表達水平與HMGA1的mRNA 相對表達水平呈負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.428（P＜0.05）。見圖2。

圖2 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平相關(guān)性的散點圖Figure 2 Scatter plot of the correlation between the expression levels of miR-let-7d-5p and HMGA1 in high-risk HPV positive cervical cancer

2.5 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平與臨床病理特征的關(guān)系

不同年齡、病理類型的高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；FIGO 分期ⅡA 期高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p的表達水平低于FIGO 分期Ⅰ期高危型HPV 陽性宮頸癌，HMGA1的mRNA 相對表達水平高于FIGO 分期Ⅰ期高危型HPV 陽性宮頸癌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 3 Relationship between the expression levels of miRlet-7d-5p，HMGA1 and clinicopathological features in highrisk HPV positive cervical cancer（±s）

表3 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）Table 3 Relationship between the expression levels of miRlet-7d-5p，HMGA1 and clinicopathological features in highrisk HPV positive cervical cancer（±s）

特征年齡n t/F 值1.052 P 值0.295 t/F 值0.469 P 值0.469病理類型1.2820.138 0.1090.109 FIGO 分期分類＜55 歲≥55 歲鱗癌腺癌腺鱗癌Ⅰ期ⅡA 期63 51 79 18 17 48 66 miR-let-7d-5p 0.69±0.22 0.74±0.25 0.73±0.20 0.67±0.24 0.68±0.25 0.77±0.22 0.67±0.18 2.4870.015 HMGA1 1.33±0.32 1.38±0.36 1.36±0.35 1.32±0.37 1.31±0.37 1.26±0.34 1.42±0.31 0.0160.016

2.6 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1 表達水平與預(yù)后的關(guān)系

高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p表達≥中位數(shù)的患者累積無進展生存率高于miR-let-7d-5p表達＜中位數(shù)的患者，高危型HPV 陽性宮頸癌中HMGA1表達≥中位數(shù)的患者累積無進展生存率低于HMGA1表達＜中位數(shù)的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；高危型HPV 陽性宮頸癌中不同miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平的患者累積總生存率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3、4。

圖3 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平與無進展生存的K-M 曲線Figure 3 K-M curve of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels and progression free survival in high-risk HPV positive cervical cancer

圖4 高危型HPV 陽性宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1表達水平與總生存的K-M 曲線Figure 4 K-M curve of miR-let-7d-5p and HMGA1 expression levels and overall survival in high-risk HPV positive cervical cancer

3 討論

高危型HPV 感染是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)病的明確危險因素，感染宮頸上皮細胞的HPV 能夠?qū)⒉《净蚪M整合進入宿主細胞并引起細胞內(nèi)多種癌基因表達發(fā)生改變，在此基礎(chǔ)上會發(fā)生上皮內(nèi)瘤變、原位癌及浸潤癌等階梯式改變。

近些年關(guān)于高危型HPV 感染的相關(guān)基礎(chǔ)研究證實，高危型HPV 陽性的宮頸癌細胞株中存在多種miRs、長鏈非編碼RNA、環(huán)狀RNA 等非編碼RNA 表達的變化，可能原因是HPV 的E6、E7 基因整合進入宿主基因的不同位點、引起鄰近非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄的改變，進而造成不同非編碼RNA 表達的上調(diào)或下調(diào)［6-7］。miR-let-7d-5p是目前已知具有抑癌作用的miR，在食管癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中均表現(xiàn)出表達降低的趨勢［8-10］。本研究結(jié)果提示miR-let-7d-5p低表達可能削弱其抑癌作用、進而導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。

目前關(guān)于HPV 感染與miR-let-7d-5p表達之間相互關(guān)系的研究主要停留在細胞實驗階段，國內(nèi)張鵬飛和國外Honegger 等［11］的細胞實驗分別證實HPV16 陽性和HPV18 陽性的的宮頸癌細胞中miR-let-7d-5p的表達降低，提示高危型HPV 感染可能是miR-let-7d-5p表達的上游調(diào)控因素。本研究結(jié)果提示高危型HPV 感染在宮頸癌中可能抑制miR-let-7d-5p的表達，進而削弱miR-let-7d-5p的抑癌作用并促進宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

根據(jù)目前miR-let-7d-5p抑癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究結(jié)果，HMGA1是miR-let-7d-5p的靶基因之一。HMGA1屬于高遷移率族蛋白，在宮頸癌中表達增加且對宮頸癌細胞的增殖、遷移、侵襲均具有促進作用［12-13］。本研究結(jié)果提示高危型HPV 感染可能通過抑制miR-let-7d-5p表達的方式促進HMGA1的表達、增強HMGA1介導(dǎo)的促癌作用。宮頸癌細胞不斷的增殖、遷移、侵襲會造成腫瘤病理進展、FIGO 分期增加，本研究的分析顯示：隨著HPV 陽性宮頸癌的FIGO 分期從Ⅰ期進展至ⅡA 期，局部組織中miR-let-7d-5p的表達降低、HMGA1的表達增加，表明miR-let-7d-5p及HMGA1表達的變化參與了高危型HPV 陽性宮頸癌的病理進展。

最后，本研究還對入組的宮頸癌患者進行了預(yù)后隨訪。高危型HPV 感染不僅是宮頸癌發(fā)病的獨立危險因素，也是預(yù)后不良的影響因素之一［14-15］。本研究對總生存和無進展生存進行了隨訪，結(jié)果顯示高危型HPV 陽性的宮頸癌中miR-let-7d-5p、HMGA1的表達與無進展生存有關(guān)，miR-let-7d-5p表達降低、HMGA1表達增加會造成累積無進展生存率降低，但受限于隨訪時間較短、未觀察到累積總生存率有統(tǒng)計學(xué)差異的結(jié)果。

綜上所述，高危型HPV 感染的宮頸癌中miR-let-7d-5p表達降低、HMGA1表達增加，上述表達變化與FIGO 分期進展、無進展生存率降低有關(guān)。