胡澤斌 于婷 孫彬裕 薄淑英 曲守方 黃杰

按照臨床輸血的要求，ABO 血型的鑒定必須以正、反定型試驗結(jié)果相互參照來確定［1-3］。所謂正定型是指用標(biāo)準(zhǔn)抗A 和抗B 血型定型試劑來測定紅細(xì)胞上的A 抗原和B 抗原；反定型是指用標(biāo)準(zhǔn)A 型細(xì)胞和B 型細(xì)胞來測定血清或血漿中有無相應(yīng)的抗A 和抗B 抗體。ABO 血型正定型用抗A抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）被列為血液篩查類體外診斷試劑，按照藥品中的生物制品進(jìn)行批簽發(fā)管理［4-6］。國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了4 家國產(chǎn)和2 家進(jìn)口抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體），用于臨床ABO 血型正定型鑒定。

中國食品藥品檢定研究院負(fù)責(zé)對抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）進(jìn)行批簽發(fā)工作的具體實施，對該品種按照《中國藥典》［7］進(jìn)行全部檢驗。本研究對4 家國產(chǎn)A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）近5 年來的產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行檢測分析，梳理此品種的質(zhì)量風(fēng)險，為保障血篩診斷試劑批簽發(fā)工作提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

O 型、B 型、A 型、A1型、A2型、A2B 型紅細(xì)胞，由中國食品藥品檢定研究院提供；4 家待檢測試劑抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體），分別來自北京金豪制藥股份有限公司、河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品

抗A 抗B 血型定型試劑效價測定用國家參考品，批號：280020-201702，抗A 參考品為藍(lán)色凍干品，抗B 參考品為黃色凍干品，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.1.3 儀器

澄明度檢測儀（生產(chǎn)廠家：天津市精拓儀器科技有限公司，型號：YB-2型）、離心機(jī)（生產(chǎn)廠家：北京時代北利離心機(jī)有限公司，型號：DT5-3）、久保田離心機(jī)（生產(chǎn)廠家：日本株式會社久保田制作所，型號：KA-2200）、恒溫培養(yǎng)箱（生產(chǎn)廠家：上海一恒科技有限公司，型號：GHP-9080）、秒表（生產(chǎn)廠家：上海金雀表業(yè)有限公司，型號：J9-2 II）、微量移液器（生產(chǎn)廠家：艾本德（上海）國際貿(mào)易有限公司，型號：10～100 μL，100～1 000 μL）。

1.2 方法

按照《中國藥典》2020 版三部生物制品通則中對抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的成品檢定要求，對4 家抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）成品進(jìn)行全部性能指標(biāo)的檢測，包括外觀、特異性、親和力、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測試、穩(wěn)定性試驗。

1.2.1 外觀

取待檢試劑5 支，打開外包裝。采用澄明度儀檢查法，選擇2200 lx 光照度，手持瓶頸部于遮光板邊緣處，輕輕旋轉(zhuǎn)和翻轉(zhuǎn)容器使溶液中可能存在的可見異物懸浮，分別在黑色和白色背景下，在明視距離（待檢試劑至人眼的清晰觀察距離，通常為25 cm）目視檢查20 s。肉眼觀察液體情況。

1.2.2 特異性

取A1、B、O 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成2%紅細(xì)胞懸液使用。將試管排2 行，第1 行每支加待檢試劑0.1 mL，第2 行每支加生理氯化鈉溶液，然后分別加入2%A1、A2B、B、O 型紅細(xì)胞懸液0.1 mL。置18～25℃15 min，1 000 r/min 離心1 min 離心半徑16.5 cm，肉眼觀察結(jié)果。生理氯化鈉溶液做紅細(xì)胞懸液對照。

1.2.3 親和力

取A1、A2、A2B、B 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成配成10%紅細(xì)胞懸液使用。取0.05 mL 待檢試劑置潔凈玻片上，加等體積10%紅細(xì)胞懸液立即混勻，面積直徑要求10 mm2以上，滴入紅細(xì)胞懸液同時，即刻記錄肉眼可見凝集出現(xiàn)時間及3 min 凝塊大小。

1.2.4 效價測定

取A1、A2、A2B 、B 型紅細(xì)胞各3 例，分離紅細(xì)胞后混合，洗3 次后用生理氯化鈉溶液配成2%紅細(xì)胞懸液使用。將試管排成2 行，每行10 支，每支加0.1 mL 生理氯化鈉溶液，將待檢試劑或國家參考品0.1 mL 二倍系列稀釋，加入相應(yīng)的2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL。置18～25℃15 min，1 000 r/min 離心1 min 離心半徑16.5 cm，肉眼觀察結(jié)果。

1.2.5 冷凝集素和不規(guī)則抗體測定

每一待檢試劑排5 行試管，每行13 支，各加待檢試劑0.1 mL，前3 行的前10 管分別加入10 例O型2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL，后3 管分別加入3 例A型或者B 型2%紅細(xì)胞懸液0.1 mL。第1 行置4℃，第2 行置18～25℃，第3 行置37℃，靜置2 h 觀察結(jié)果；第4 和第5 行，前10 管分別加入10 例O型5%紅細(xì)胞懸液0.1 mL，后3 管分別加入3 例A型或者B 型5%紅細(xì)胞懸液0.1 mL；第4 行置18～25℃，第5 行置37℃，靜置2 h 后觀察結(jié)果。

1.2.6 穩(wěn)定性

待檢試劑的有效期為1 年的在37℃加熱7 d，有效期為2 年的在37℃加熱14 d。按上述1.2.1-1.2.5 方法進(jìn)行外觀、特異性、親和力、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測定項目的檢測。

2 結(jié)果

2.1 外觀結(jié)果

對4 家國產(chǎn)抗A 抗B 血型定型試劑共336 批進(jìn)行外觀檢查，抗A 試劑均為透明的藍(lán)色液體，抗B 試劑均為透明的黃色液體，且均無搖不散的沉淀或異物。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的外觀項目檢測結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.2 特異性結(jié)果

對4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行特異性檢查，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2B 紅細(xì)胞均產(chǎn)生凝集，與O 及B 型紅細(xì)胞均不凝集，抗B 試劑與B 紅細(xì)胞均產(chǎn)生凝集，與A1、O 紅細(xì)胞均不凝集，均無溶血和其他不易分辨的現(xiàn)象。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的特異性項目檢測結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.3 親和力結(jié)果

對4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行親和力檢查，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2、A2B 紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集的時間均分別≤15 s、≤30 s、≤45 s，抗B 試劑與B 紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集的時間均≤15 s，且在3 min 內(nèi)凝集塊均達(dá)到1 mm2以上。見表1。4 家企業(yè)的抗A 抗B 血型定型試劑的親和力項目檢測結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

表1 抗A 抗B 血型定型試劑親和力結(jié)果Table 1 Affinity results of anti-A and anti-B blood typing reagents

2.4 效價測定結(jié)果

效價滴度以產(chǎn)生“+”凝集的待檢試劑最高稀釋度計算，不計紅細(xì)胞懸液體積。對4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行效價測定，結(jié)果表明，抗A 試劑與A1、A2、A2B 型紅細(xì)胞的凝集效價均不低于國家參考品的同步測定結(jié)果，抗B試劑與B 型紅細(xì)胞的凝集效價均不低于國家參考品的同步測定結(jié)果。見表2。4家企業(yè)的抗A抗B血型定型試劑的效價測定項目檢測結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

表2 抗A 抗B 血型定型試劑效價測定結(jié)果Table 2 Titer results of anti-A and anti-B blood typing reagents

2.5 冷凝集素和不規(guī)則抗體測定結(jié)果

對4 家企業(yè)共336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑進(jìn)行效價測定，結(jié)果表明，抗A 試劑與2%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3 例B 型紅細(xì)胞在4℃、18～25℃、37℃三個反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血?？笲 試劑與2%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3 例A 型紅細(xì)胞在4℃、18～25℃、37℃三個反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血；抗A 試劑與5%的10 例非血緣性O(shè)型紅細(xì)胞和3 例B 型紅細(xì)胞在18～25℃、37℃兩個反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血?？笲 試劑與5%的10 例非血緣性O(shè) 型紅細(xì)胞和3例A 型紅細(xì)胞在18～25℃、37℃兩個反應(yīng)條件下均不出現(xiàn)凝集反應(yīng)，也不發(fā)生溶血。4 家企業(yè)的抗A抗B 血型定型試劑的冷凝集素和不規(guī)則抗體測定項目檢測結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

2.6 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

4 家企業(yè)336 批次的抗A 抗B 血型定型試劑在37℃加熱7 d 或14 d 后，與4℃保存的試劑相比外觀沒有明顯變化，抗A 試劑仍為透明的藍(lán)色液體，抗B 試劑仍為透明的黃色液體，且均無搖不散的沉淀或異物；與4℃保存的試劑相比特異性沒有變化，抗A 試劑仍與A1、A2B 紅細(xì)胞凝集，與O 及B 型紅細(xì)胞不凝集，抗B 試劑仍與B 紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集，與A1、O 紅細(xì)胞不產(chǎn)生凝集，且均無溶血和其他不易分辨的現(xiàn)象；與4℃保存的試劑相比，加熱后的抗A 抗B血型定型試劑與紅細(xì)胞出現(xiàn)的凝集時間略有0.50～1.50 s 延遲，但仍符合《中國藥典》規(guī)定；與4℃保存的試劑相比，加熱后的抗A 抗B 血型定型試劑的效價測定結(jié)果略低，但仍滿足國家參考品的要求；與4℃保存的試劑相比冷凝集素和不規(guī)則抗體測定結(jié)果沒有變化，全部試管均不出現(xiàn)非特異性凝集反應(yīng)，也未發(fā)生溶血。4 家企業(yè)336 批次的抗A 抗B血型定型試劑的穩(wěn)定性試驗結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定。

3 討論

生物制品批簽發(fā)［8］，是指國家藥品監(jiān)督管理局對獲得上市許可的疫苗類制品、血液制品、用于血源篩查的體外診斷試劑以及國家藥品監(jiān)督管理局規(guī)定的其他生物制品，在每批產(chǎn)品上市銷售前或者進(jìn)口時，經(jīng)指定的批簽發(fā)機(jī)構(gòu)進(jìn)行審核、檢驗，對符合要求的發(fā)給批簽發(fā)證明的活動。未通過批簽發(fā)的產(chǎn)品，不得上市銷售或者進(jìn)口。為規(guī)范生物制品批簽發(fā)行為，保證生物制品安全有效，根據(jù)新制修訂《藥品管理法》和《疫苗管理法》，2020 年12 月11 日國家市場監(jiān)督管理總局令第33 號《生物制品批簽發(fā)管理辦法》公布，本辦法自2021 年3 月1 日起施行。新《生物制品批簽發(fā)管理辦法》進(jìn)一步明確了批簽發(fā)職責(zé)分工和重大質(zhì)量風(fēng)險產(chǎn)品查處程序，明確了批簽發(fā)機(jī)構(gòu)的職責(zé)，強(qiáng)調(diào)對于發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題、缺陷和風(fēng)險及時進(jìn)行調(diào)查評估，采取必要措施處理。

中國食品藥品檢定研究院［9］是負(fù)責(zé)抗A 抗B血型定型試劑（單克隆抗體）的唯一批簽發(fā)機(jī)構(gòu)，一直非常重視該品種的產(chǎn)品質(zhì)量，堅持對每一批試劑進(jìn)行全部檢測項目的質(zhì)量檢定。2018 年以來，中國食品藥品檢定研究院共簽發(fā)了336 批4 家國產(chǎn)抗A 抗B 血型定型試劑，簽發(fā)量達(dá)741 956 800 人份，對試劑成品進(jìn)行了外觀、特異性、親和力、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測試、穩(wěn)定性試驗等6 個項目的檢驗，質(zhì)量全部合格?？傮w來講，北京金豪制藥股份有限公司、河北醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程中心、上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司、長春博德生物技術(shù)有限責(zé)任公司4 家國產(chǎn)抗A抗B 血型定型試劑的質(zhì)量穩(wěn)定。

抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的批簽發(fā)工作主要有三個環(huán)節(jié)：資料審核、產(chǎn)品檢定、出具檢驗報告及批簽發(fā)證明。產(chǎn)品檢定依據(jù)《中國藥典》進(jìn)行全部項目的檢定，包括外觀、特異性、親和力、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測試、穩(wěn)定性試驗共6 個項目。《中國藥典》每5 年進(jìn)行一次修訂，但是針對抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）這個品種，2015 版［10］與2020 版的內(nèi)容沒有發(fā)生任何變化，所以2018 年以來對抗A 抗B 血型定型試劑（單克隆抗體）的產(chǎn)品檢定依據(jù)了相同的技術(shù)指標(biāo)和判定方法。

在6 個檢定項目中，效價是反映不同廠家生產(chǎn)的抗A 抗B 血型定型試劑的靈敏度，是試劑檢出能力的關(guān)鍵評價指標(biāo)，在臨床輸血等ABO 血型鑒定中發(fā)揮重要作用［11-13］，因此，在效價測定中采用了抗A 抗B 血型定型試劑效價測定用國家參考品這樣一把標(biāo)尺來進(jìn)行統(tǒng)一評價［14-15］。《中國藥典》規(guī)定，抗A 抗B 血型定型試劑在半成品檢定中需要進(jìn)行特異性、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測定、無菌檢查以及穩(wěn)定性試驗，半成品的穩(wěn)定性試驗同樣采用37℃加熱7 天（有效期1 年）或14 天（有效期2年）后進(jìn)行特異性、效價測定、冷凝集素和不規(guī)則抗體測定以及無菌檢查，在實際工作中企業(yè)對此反映較多，認(rèn)為半成品已經(jīng)進(jìn)行4 個關(guān)鍵指標(biāo)的檢測，加熱之后再進(jìn)行一遍全部項目檢測，大大延遲了產(chǎn)品的放行，尤其是無菌檢查采用直接接種法需要14 天時間。是否有必要對半成品和成品均進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗，以及半成品加熱后是否必須再進(jìn)行一次無菌檢測，希望引起更多的討論與思考，在下一版藥典修訂時對此進(jìn)一步研判。