陳 虹，趙善超，李克一，古麗米熱·艾合買提，潘存德，肖中琪，陳兵權(quán)

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院/新疆教育廳干旱區(qū)林業(yè)生態(tài)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)重點實驗室，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)天然林保護中心，烏魯木齊 830000)

我國花楸資源豐富，主要分布在東北、華北地區(qū)[1]，作為北方珍貴的觀葉、觀花、觀果、觀形的優(yōu)良樹種，其具有很高的經(jīng)濟、生態(tài)、藥用價值[2-4]。目前有關(guān)花楸屬的研究主要集中在分布特征[5]、生殖生物學(xué)[6-8]、藥用價值[9-10]、扦插育苗與嫁接技術(shù)[11]等方面，且種源試驗研究結(jié)果表明，花楸表型遺傳性狀的變異表現(xiàn)為種間變異大于群體間遺傳變異[12-13]。新疆地區(qū)的天山花楸(SorbustianschanicaRupr)廣泛分布于天山山脈海拔1 400～2 000 m的山坡、林緣、林地內(nèi)[14]。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該樹種多為單株散生，在林地里常以天山云杉(Piceaschrenkianavar.tianschanica)伴生樹種零星出現(xiàn)[15]。因處于從屬地位或相對次要的地位，通常不具備種間競爭優(yōu)勢，導(dǎo)致其再生能力下降，同時種子難以萌發(fā)，造成該樹種在自然狀態(tài)下天然更新極困難，給新疆平原地區(qū)的引種和繁殖、天然更新帶來許多不便。因此，本研究以天山花楸種子為材料，通過分析種子結(jié)構(gòu)、內(nèi)源萌發(fā)抑制物類型的生物學(xué)鑒定入手，深入了解天山花楸種子休眠類型。旨在為天山花楸種子學(xué)研究提供參考，也為天山花楸開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

天山花楸種子于2020年9月采自新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實習(xí)林場(43°16′～43°26′N，86°46′～86°57′E)內(nèi)的野生母株，采回后將種子洗出自然晾干，于4 ℃冰箱保存待用。

1.2 試驗方法

1.2.1種子基本特性及結(jié)構(gòu)觀察

按照林木種子檢驗規(guī)程(GB/T 2772—1999)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進行花楸種子基本特性檢測[16]，用游標(biāo)卡尺測定種子大小、萬分之一電子天平測定種子重量、紅四唑(TTC)測定種子生活力；并用倒置解剖鏡進行花楸種子基本解剖特性觀察；每個處理重復(fù)3次。

1.2.2種皮結(jié)構(gòu)的觀察

以未處理種子種皮為對照，與45 d萌發(fā)種子的種皮置于75%無水乙醇中，經(jīng)逐級脫水后，用HCP-2臨界點干燥儀粘合—IB-v粒子濺射儀噴金—PHILIPS SEM-505掃描電子顯微鏡觀察，并對種皮橫斷面結(jié)構(gòu)進行記錄和拍照，分析變化情況。

1.2.3種子透水性研究

取完整的種子和破皮種子各100粒，稱其質(zhì)量，浸入3倍種子體積的蒸餾水中，25 ℃恒溫條件下進行種子透水性吸脹實驗，前12 h每2 h取出種子后，用濾紙快速吸干表面水分并稱重，隨后每12 h稱重1次，直至質(zhì)量恒定。3次重復(fù)。

吸水率(%)=[(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/干質(zhì)量]×100%。

1.2.4種子中抑制物的測試

參照尹德潔等[17]的方法進行種子抑制物測定，具體方法如下：取種子1 g，經(jīng)充分研磨后，分別用甲醇、去離子水定容至10 mL，于4 ℃振蕩培養(yǎng)箱中浸提36 h后4 ℃、4 000 r/min離心15 min取上清液。并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(56 ℃)對甲醇上清液進行處理，待甲醇揮發(fā)后，用蒸餾水溶解剩余物質(zhì)，定容至10 mL；去離子水上清液直接定容至10 mL。得到濃度為0.1 g/mL的甲醇和去離子水浸提液。以清水為對照，設(shè)計0.01、0.05、0.1 g/mL 共3個實驗濃度，測定白菜種子發(fā)芽率、根長、苗高，并計算內(nèi)源萌發(fā)抑制物活性。每個試驗重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和多重比較、使用Excel軟件進行圖表處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 天山花楸種子基本特性

種子表觀和解剖結(jié)構(gòu)觀察表明(圖1)，成熟的天山花楸種子為紅褐色，性狀呈扁卵形，先端尖，側(cè)向壓扁(腹面)，微彎曲，背面隆起，有光澤，種皮較光滑?？v徑在4.01～4.97 mm之間，橫徑在1.89～2.67 mm之間；種子平均千粒重為5.556 g。種子含水量約為6.47%，種子的生活力為33.3%。表明天山花楸種子屬于小粒種子，且生活力不高。種子由種皮和種胚兩部分構(gòu)成。經(jīng)測量其種皮厚度約為164 nm，由外種皮和內(nèi)種皮組成，外種皮堅硬，兩端較厚，木質(zhì)化程度高，外種皮表面覆有角質(zhì)層；內(nèi)種皮膜質(zhì)半透明，內(nèi)側(cè)呈白色，光滑有光澤(圖1 b)。種胚包括胚芽、胚軸、胚根、子葉四部分，胚發(fā)育完全，為典型的無胚乳種子。胚芽、胚軸、胚根長度約為1.02 mm，子葉為兩片，長度約為3.75 mm，均為乳白色。說明天山花楸具有完整的胚。

2.2 天山花楸種子透水性

通過測定完整種子及破皮種子的天山花楸種子的吸水率可知(圖2)，天山花楸種子的吸水過程分為快速吸水(0～2 h)、緩慢吸水(2～24 h)、近飽和吸水(24～36 h)3個階段。且完整種子與破皮種子的吸水速率曲線變化過程的趨勢基本一致，即快速吸水階段，種子吸水速率急劇上升，隨后種子的吸水速率下降，待近飽和階段，兩者吸水速率基本一致。經(jīng)T檢驗結(jié)果表明，破皮種子與完整種子的吸水速率在快速吸水階段存在極顯著差異(p<0.01)，破皮種子和完整種子的吸水率分別為(61.1±0.45)%和(35.8±0.21)%；而近飽和階段，破皮種子與完整種子的吸水率之間差異不顯著(p<0.05)，破皮種子和完整種子的吸水率為(76.3±1.27)%和(83.5±2.47)%。與破皮種子相比，完整種子的吸水速率緩慢，說明種皮存在透性障礙，種子存在吸水障礙。

注：a為種子外觀及大??；b為內(nèi)、外種皮結(jié)構(gòu)；c為角質(zhì)層；d為胚結(jié)構(gòu)。圖1 天山花楸種子形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)Fig.1 Seed morphology and anatomical structure of Sorbus tianschanica

2.3 天山花楸種皮結(jié)構(gòu)的觀察

運用掃描電鏡技術(shù)，對比未經(jīng)處理的干種子和萌發(fā)后種子的種皮結(jié)構(gòu)(圖3)可知，干種子種皮厚度約為164 nm，且表面覆有一層角質(zhì)層，木栓質(zhì)化嚴(yán)重，細胞呈不規(guī)則排列且排列緊密，部分地方有褶皺。內(nèi)種皮緊貼外種皮，表面較光滑，其細胞呈縱向排列，排列致密。而萌發(fā)后的種皮厚度約為27.3 nm，約為干種子種皮厚度的1/6。種皮由光滑變得粗糙不平，內(nèi)種皮與外種皮之間出現(xiàn)分離，且部分內(nèi)種皮內(nèi)卷。萌發(fā)后的種皮角質(zhì)層基本破裂，部分已完全脫落，外種皮暴露在外，細胞間空隙增大，透性增大，機械阻力減小。說明種皮對天山花楸種子透水透氣性影響很大，外種皮上的角質(zhì)層和堅硬較厚的種皮會影響種子的透性，不利于種子進行水分交換，影響種子萌發(fā)。

2.4 萌發(fā)抑制物對白菜種子萌發(fā)特性的影響

甲醇和水分別浸提花楸種子后進行白菜種子萌發(fā)抑制物測定(表1)可知，花楸種子甲醇和水浸提液下的白菜種子發(fā)芽率、主根長、主苗高組間存在顯著差異(p<0.05)。甲醇和水浸提液濃度為0.01、0.05、0.1 g/mL時，發(fā)芽率比對照分別降低10.4%、13.7%、15.0%和13.6%、15.9%、19.6%。對照白菜主根長和苗高分別為2.12 cm和2.93 cm，而不同濃度甲醇浸提液、水浸提液處理后的主根長為1.43～1.98 cm和1.35～1.84 cm，與對照相比，主根長分別減少了6.6%、11.8%、32.5%和13.2%、25.9%、36.3%；苗高分別為1.76～2.43 cm和1.64～1.88 cm，苗高與對照相比分別減少了17.0%、34.1%、39.9%和35.8%、40.9%、44.0%。綜上表明，花楸種子中含有影響種子萌發(fā)的水溶性內(nèi)源抑制物和醇溶性內(nèi)源抑制物，且隨著浸提液濃度的增加，內(nèi)源抑制物的活性和抑制種子發(fā)芽及幼苗生長的作用增強，同時種子水浸提液下白菜種子的萌發(fā)率、主根長、苗高低于甲醇浸提液處理，這可能是由于花楸種子萌發(fā)抑制物的水中溶解性大于甲醇中的溶解性。

3 討 論

種子的形態(tài)學(xué)特征是種子長期進化過程中對環(huán)境條件的一種適應(yīng)機制，其大小、形狀等對種子的傳播及其幼苗生長策略具有重要影響[18]。本實驗結(jié)果表明，天山花楸種子平均縱徑約4.47 mm，平均橫徑約2.16 mm，平均千粒重為5.556 g，而水榆花楸種子的大小(平均縱徑為6.12 mm，平均橫徑為3.48 mm)，尤其是重量，為天山花楸的4倍以上[19]，說明不同種的花楸種子在形態(tài)特征上有較大差異，且多種植物的研究中發(fā)現(xiàn)，小種子的發(fā)芽率低[20]。此外種子的生活力對于種子能否成活也起到至關(guān)重要的作用，一般情況下，高活力的種子在適宜的條件下發(fā)芽快，出苗整齊。天山花楸種子生活力為33.3%，低于水榆花楸[19](Sorbusalnifolia(Sieb. & Zucc.) K. Koch)和黃山花楸[21](Sorbusamabilis)種子生活力，表明天山花楸種子的活力不高，這是否與種源地的母樹樹勢有關(guān)有待進一步研究。

注：A為干種子種皮整體結(jié)構(gòu)(×50)；B為干種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×400)；C為干種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×1 200)；D為干種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×1 200)；E為干種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×2 400)；F為干種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×2 400)；G為發(fā)芽后種子部分種皮結(jié)構(gòu)(×50)；H為發(fā)芽后種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×1 600)；I為發(fā)芽后種子種皮斷面結(jié)構(gòu)(×3 000)。圖3 掃描電鏡下天山花楸種子種皮結(jié)構(gòu)Fig.3 The seed coat structure of Sorbus tianschanica under SEM

表1 種子浸提液對白菜種子萌發(fā)及幼苗生長影響Table 1 Effects of different concentrations of extracts from the seeds of Sorbus tianschanica on the germination rate and seedling growth of Chinese cabbage seeds

植物為適應(yīng)環(huán)境保持自身繁殖發(fā)展而形成的種子休眠特性對于植物本身具有重要的生態(tài)學(xué)意義[22-23]。很多研究指出，引起植物種子休眠的原因主要與種皮結(jié)構(gòu)[24]、種子抑制物的存在[25]、胚發(fā)育不完全[26]、種子代謝緩慢[27]有關(guān)。通過解剖觀察發(fā)現(xiàn)，天山花楸種子的種胚包括胚芽、胚軸、胚根、子葉四部分，胚發(fā)育完全，表明天山花楸具有完整的胚，不存在生理后熟，這與水榆花楸、單葉蔓荊(VitextrifoliaLinn.var.simplicifoliaCham.)的研究結(jié)果一致[17]。種皮在具有機械束縛作用的同時還具有透性障礙，本研究中，通過掃描電鏡觀察對比無處理干種子和萌發(fā)后種子的種皮結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，干種子的種皮厚度約為164 nm，且種子外種皮表面覆有一層角質(zhì)層，內(nèi)部木栓質(zhì)化程度嚴(yán)重，內(nèi)種皮種子的結(jié)構(gòu)致密，這些限制性條件阻礙了天山花楸種子種胚與外界的水分交換，影響種子的吸脹和萌發(fā)，進而影響天山花楸種子的萌發(fā)。在東北紅豆杉(TaxuscuspidataSieb. et Zucc.)種子[28]、青錢柳(Cyclocaryapaliurus(Batal.) Iljinsk.)種子[29]的研究中，均指出外種皮角質(zhì)化、中種皮有木栓質(zhì)，內(nèi)種皮木非常堅硬等種皮結(jié)構(gòu)是阻礙胚與外界的水分和氣體的交換的影響因素。雖然天山花楸與黃山花楸的種皮結(jié)構(gòu)具有一致性，但天山花楸的種皮厚度(約164 nm)遠大于黃山花楸(約33.75 nm)種皮厚度[21]，進一步證實了不同種的花楸種皮特征具有差異性，可能這也是天山花楸較花楸屬其他種更難萌發(fā)的原因。種子吸水性結(jié)果進一步指出，因致密的種皮結(jié)構(gòu)造成的透性障礙是造成天山花楸種子難以萌發(fā)的原因。這在紫楠(Phoebesheareri(Hemsl.) Gamble)種子[30]、水榆花楸[19]、黃山花楸[21]等相關(guān)研究中也得到相似結(jié)論。同時天山花楸種子甲醇和水浸提液能明顯抑制白菜種子萌發(fā)和生長，說明花楸種子中含有影響種子萌發(fā)的水溶性內(nèi)源抑制物和醇溶性內(nèi)源抑制物，且種子萌發(fā)抑制物的水中溶解性大于甲醇中的溶解性。因此，種子外種皮角質(zhì)化和中種皮有木栓質(zhì)和種子中的內(nèi)源抑制物是造成天山花楸休眠的重要因素，需進一步明確種子中的休眠物質(zhì)成分，為人工繁育提供技術(shù)解決方案。

4 結(jié) 論

天山花楸種子屬于小粒種子，且生活力較低，種皮機械障礙造成的物理休眠和種胚內(nèi)源抑制物是造成天山花楸種子休眠的主要因素。