蘇 秦，余仲昊，徐曲毅，吳偉斌，李 歡，杜蔚安，趙 建，陳 玲，劉 宏，劉 超,,*

（1.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，公安部法醫(yī)病理學(xué)重點實驗室，廣州 510442；2.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515）

溺水是常見的非正常死因之一，而水中尸體的發(fā)現(xiàn)地通常并不是其實際溺水點[1-3]。確定溺水點對于尋找尸源、分析案情和偵破案件至關(guān)重要[4]。目前溺水地點的推斷主要是通過分析溺死尸體的器官組織中是否含有嫌疑地點水樣中的特異性標(biāo)記物來進(jìn)行[5]。這些標(biāo)記物通常需要表現(xiàn)出在溺液中普遍存在且特異分布的特征。目前，硅藻和異物顆粒應(yīng)用最為廣泛。

迄今， 微波消解—真空抽濾—掃描電鏡硅藻檢驗法為識別硅藻形態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，但形態(tài)學(xué)鑒定需要專業(yè)分類學(xué)的支持，且很難獲得完整的豐度信息。此外，當(dāng)水域中缺乏特異性硅藻、種類無分布差異或者某些硅藻因體積較大難以進(jìn)入溺水者的臟器中時，硅藻檢測對于溺水地點的推斷便有局限性[7]。而異物顆粒通常與化工廠、鋼鐵廠、軍工廠等重工業(yè)的排污口有關(guān)，在排放不穩(wěn)定或缺乏工業(yè)排放的情況下，該方法的應(yīng)用亦受到限制。隨著二代測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，通過18S rDNA測序從分子層面獲取包含硅藻在內(nèi)的浮游真核微生物的種群和豐度信息，有助于建立特定水域中浮游真核微生物種群的背景數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而為溺水地點的推斷提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[8]。其中，18S rDNA V4—V5區(qū)段應(yīng)用最多，且其數(shù)據(jù)庫信息也最全、分類效果最好。

本文通過18S rDNA測序，對珠江水域（廣州段）進(jìn)行浮游真核微生物群落的調(diào)查，以解析包括硅藻在內(nèi)的浮游真核微生物在同一水域不同地點的分布特征，同時為建立水中浮游真核微生物種群的背景數(shù)據(jù)庫積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為水中尸體的法醫(yī)遺傳學(xué)分析提供參考。

1 材料和方法

1.1 水樣采集

在珠江廣州段水域隨機(jī)等距離選取4個采樣點（相鄰取水點相距25～30 km，從上游的佛山三江源景觀點附近處至下游的近入?？谔幰来藶閃1、W2、W3、W4），進(jìn)行水樣采集，采樣時間為2021年7月。在距岸邊1 m、水下0.3 m處收集水樣，每個取樣點取3份水樣（每份500 mL）。為避免不同采水點的微生物通過取水器產(chǎn)生交叉污染，每次取水前，用取樣點處的水樣將取水器沖洗3次，取樣結(jié)束后再用純凈水沖洗3次。

1.2 微生物富集

采用HL-6型多聯(lián)真空抽濾儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）處理水樣，將水樣中的浮游微生物富集至0.22 μm孔徑的濾膜上，再將濾膜封裝于無菌離心管中。液氮速凍，-80 °C冰箱中保存。

1.3 DNA提取和PCR擴(kuò)增

根據(jù) E.Z.N.A?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, 美國）說明書抽提水樣浮游微生物群落的總DNA，采用TAReukFWD1F（CCAGCASCYGC- GGTAATTCC）和TAReukREV3R （ACTTTCGTTCT- TGATYRA）引物對18S rDNA的V4—V5區(qū)段進(jìn)行擴(kuò)增，程序如下：95 °C預(yù)變性3 min，27個循環(huán)（95 °C變性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s），72 °C穩(wěn)定延伸10 min，4 °C保存。PCR反應(yīng)體系為20 μL，每個樣本重復(fù)3次。

1.4 建庫與測序

將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后以2%瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences,Union City, CA, USA)純化回收產(chǎn)物，并用Quantus? Fluorometer (Promega, USA)對回 收產(chǎn)物檢測定量。使用NEXTf lexTMRapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientif ic, USA）建 庫，再 以Illumina Miseq PE300平臺測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp， version 0.20.0）軟件對原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，再經(jīng)FLASH（http://www.cbcb.umd.edu/software/f lash，version 1.2.7）軟件拼接序列，最后利用QIIME2軟件進(jìn)行后續(xù)的18S擴(kuò)增子分析，其中使用Deblur去噪并生成特征表，以Silva138數(shù)據(jù)庫（https://www.arbsilva.de/）進(jìn)行注釋分析，使用R語言進(jìn)行韋恩圖分析和作圖。

2 結(jié)果

2.1 Alpha多樣性分析

18S rDNA的測序分析結(jié)果顯示珠江流域（廣州段）水樣中觀測到的分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)（按照97%的相似性閾值）平均為483.73±39.06個。其中，W1的OTU數(shù)目最多（638.33±1.67個），而W4數(shù)目最少（298.33±10.73個）（圖1A）。W1的香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）最高，W2和W3次之，W4最低（圖1B）。這些結(jié)果表明，隨著取水點離入海口越近，被檢測到的浮游真核微生物種類和物種分布的均勻度均降低。

圖1 四個取水點的α多樣性指數(shù)（A：觀測到的OTU數(shù)目；B：Shannon指數(shù)。不同字母表示存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05））Fig.1 Alpha-diversity i ndexes derived from four sampling locations (A: observed OTUs; B: Shannon index, with statistical differences(P＜0.05) being indicated as letters (a, b, c))

2.2 Beta多樣性分析

采用PCoA方法對數(shù)據(jù)降維后進(jìn)行Beta多樣性分析，確定不同取水點的微生物物種的異質(zhì)性。分別采用非加權(quán)的Unifrac距離和Jaccard距離以及加權(quán)的Unifrac距離和Bray Curtis距離進(jìn)行計算。其中，非加權(quán)的方法僅考慮浮游微生物成員在群落中存在與否，而不考慮其豐度高低；加權(quán)的方法需考慮浮游微生物成員的豐度情況。結(jié)果顯示，取水點W4在各種算法中均與另外三個取水點存在顯著差異，這與Alpha多樣性的結(jié)果一致（圖2）。雖然取水點W1、W2和W3在各種算法中也呈現(xiàn)出各自組內(nèi)一致性且與其他取水點存在差異的趨勢，但是W2在非加權(quán)算法中與W3更為接近（圖2A，2C），而在加權(quán)算法中與W1更為接近（圖2B，2D）。這些結(jié)果表明，W4的物種構(gòu)成與另外三組存在顯著差異，而W2的物種構(gòu)成種類與W3接近，但W2的優(yōu)勢物種分布與W1更接近。

圖2 四個取水點的β多樣性指數(shù)Fig.2 Beta-diversity indexes derived from four sampling locations

2.3 取水點的群落組成

對各取水點的樣本進(jìn)行門水平分類群注釋，按12個樣本的豐度排序，每個取水點的3個樣本取均值展示（圖3）。

圖3 門水平上的相對含量分布圖Fig.3 The relative abundance distribution of microplanktons at the phylum level

從序列特征推斷的優(yōu)勢微生物分類群依次為硅藻門、纖毛蟲門、綠藻門、絲足蟲門、隱藻門、皮膽蟲門、囊泡蟲門、褐藻門、壺菌門、甲藻門、隱真菌門和輪蟲動物門等。硅藻門為排序第一的微生物類群，但在不同組別中比例并不相同，從取水點W3的最高比例46.33%到取水點W4的最低比例10.28%，而W1和W2的比例分別為24.25%和21.22%。對取水點W4的門水平群落組成分析的結(jié)果顯示，里面含有較大比例的皮膽蟲門類屬，而這類微生物在其他三個取水點比例極低。結(jié)合Beta多樣性分析的結(jié)果，不同取水點的微生物群落組成存在顯著差異，應(yīng)可為不同地點溺死尸體的鑒別提供可行性。

2.4 硅藻的含量差異

由于硅藻門在門水平為排序第一的優(yōu)勢微生物類群，且其對溺死案例的死因診斷具有重要意義，因此對各取水點的硅藻作屬水平的含量統(tǒng)計。結(jié)果如表1所示，輻環(huán)藻屬為取水點W1、W2和W3的優(yōu)勢硅藻屬，但在W4的含量低，僅占0.69%±0.39%。而骨條藻屬和Bacillariophyceae屬在取水點W4的含量比其他三個取水點高，分別為39.88%±2.65%和15.88%±0.56%。此外，取水點W4還有三個特有硅藻屬，分別為圓篩藻屬、細(xì)柱藻屬和泥生藻屬。取水點W1中有一個特有硅藻屬（脆桿藻屬），而W2和W3中并不存在特有硅藻屬。經(jīng)分析，所有硅藻屬的含量在4個取水點中的含量均存在統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 硅藻屬的相對含量分布Table 1 Relative content distribution of diatoms at the genus level %

2.5 特有物種分析

由于在取水點W2和W3中沒有發(fā)現(xiàn)特有的硅藻屬，因此我們將范圍擴(kuò)大到所有浮游真核微生物物種上。通過韋恩圖發(fā)現(xiàn)，W4中的特有物種最多（98種），其次為W1（27種），而W2和W3的特有物種最少，分別為7種和6種（圖4），這與硅藻屬分析的結(jié)果類似。這些結(jié)果表明當(dāng)分類水平細(xì)化到種水平時，各取水點相應(yīng)的特異物種種類增多。

圖4 特有浮游真核微生物物種在種水平上的韋恩圖分析Fig.4 The analysis of venn diagram about endemic eukaryotic plankton species at the species level

3 討論

3.1 微生物群落組成信息用于溺水地點推斷的可行性

真核生物18s rDNA序列信息可用于物種鑒定，因該序列具有多個可變區(qū)，在不同物種間變化大，從而被廣泛應(yīng)用于分類學(xué)研究[9]。18s rDNA測序可通過提供更廣泛的分類覆蓋范圍來增強對特定水域浮游真核微生物群落的生物學(xué)調(diào)查，其與形態(tài)學(xué)方法相比，對于某些群體而言，分辨率更高[10]。法醫(yī)常通過溺死尸體組織與溺液中浮游微生物（主要是硅藻）種類的一致性分析來推斷溺水地點[11]，有時也依據(jù)溺死尸體隨身衣物、鞋襪等檢材上的微生物群落作推斷[12]。要進(jìn)行這些分析推斷，特定水域的微生物組成背景信息至關(guān)重要。

本研究選取的4個取水點的位置分布于珠江廣州段的上游至下游，根據(jù)α多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)各取水點內(nèi)的OTU數(shù)及Shannon指數(shù)存在一定的差異，OTU數(shù)表明上游具有更多的浮游微生物物種數(shù)，且Shannon指數(shù)表明上游的浮游微生物物種豐度更為均衡。β多樣性分析進(jìn)一步表明各取水點的微生物組成差異顯著，尤其是取水點W4與其他取水點的差異最為明顯。這可能是因為W4的位置位于珠江的下游，靠近入海口，常年經(jīng)受海水倒灌，從而形成了與淡水差異顯著的微生物組成。W1位于佛山三江源景觀點附近，常年接受西南涌、白泥水和流溪河的淡水灌入。W2位于廣州鬧市區(qū)廣州塔附近，其前段水域接受了后航道的流道輸入。W3位于廣州大學(xué)城附近，其前段水域接受了大石水道的流道輸入。這些水域結(jié)構(gòu)的差異可能是造成各取水點微生物組成差異的主要原因之一，而這也為其用于溺水地點的推斷提供了可能性。

3.2 特異微生物種類信息用于溺水地點推斷的可行性

在法醫(yī)工作實踐中，溺死尸體中吸入的溺液量及溺液種類差異大，進(jìn)入肺臟、血液及其他內(nèi)臟器官的微生物數(shù)目差異大[13]。當(dāng)從檢材中分離到的微生物數(shù)量較少時，不能滿足二代測序?qū)z測樣品DNA含量的要求。此外，若樣本中混有人或動物DNA與微生物DNA競爭擴(kuò)增，則還有可能干擾微生物18s rDNA可變區(qū)的擴(kuò)增和檢測，這使得要獲取溺液中的微生物群落及組成就更加困難。此時，可通過特異微生物種類信息來推斷溺水地點，如 在本研究的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)硅藻中的脆桿藻屬為W1取水點處特有，若在珠江流域廣州段中發(fā)現(xiàn)的溺死尸體肺部等臟器中檢測到脆桿藻屬，則可快速確定溺水地點的大致范圍，可為相關(guān)案件的偵破贏得時間。然而這需要建立不同水域的數(shù)據(jù)庫，獲取特異微生物的種類，并設(shè)計特異的擴(kuò)增引物。本研究結(jié)果表明，珠江在不同的取水點有各自特異的微生物，這為后續(xù)的特異微生物擴(kuò)增提供了可行性。此外，在取水點W2和W3中并未找到特異的硅藻屬，這似乎顯示利用常用的硅藻形態(tài)學(xué)觀察推斷溺水地點存在局限性。而細(xì)化到微生物物種水平分析中，盡管特異性物種數(shù)量偏少，但至少提供了特異性微生物種類用于推斷溺水地點的可能性。

3.3 18S rDNA測序用于溺水地點推斷的優(yōu)劣勢

目前常用硅藻形態(tài)學(xué)檢測來進(jìn)行溺死診斷，而其樣本處理過程易使硅藻種類丟失和干擾硅藻實際豐度的測量，因此較難獲取完整的硅藻種類及其豐度信息。此外，本研究發(fā)現(xiàn)有些采水點缺乏特異的硅藻屬，使得硅藻形態(tài)學(xué)檢測較難用于溺水地點推斷。18S rDNA測序可在不損害樣本信息的前提下，便捷、快速、高通量地獲取器官組織和溺液中包含硅藻在內(nèi)的浮游真核微生物在種水平上的豐度構(gòu)成比例，得到更豐富的物種信息，再進(jìn)一步與嫌疑溺水地點樣本進(jìn)行匹配比對，可使得溺水地點推斷具有可行性。此外，18S rDNA可鑒定出更多的物種，其中的硅藻物種可與形態(tài)學(xué)檢測相互驗證。當(dāng)然，目前缺乏檢測水域的18S rDNA數(shù)據(jù)庫，所以仍有大量的基礎(chǔ)性工作有待進(jìn)行。

4 總結(jié)

本研究通過對珠江廣州段水域隨機(jī)等距離選取4個采水點進(jìn)行18S rDNA二代測序，檢測浮游真核微生物群落并分析特異微生物物種，為推斷潛在的溺水地點提供了一種新方法。在未來的法醫(yī)實踐中，可嘗試通過二代測序建立不同水域的微生物數(shù)據(jù)庫，使用生物信息學(xué)方法輔助溺水地點的推斷。