陳婷婷 程浩艷 李 震 金保勝 陳煒睿 黃 蕊 王文霞** 鄭俊霞**

（1）廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510006；2）河南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，洛陽 471000）

在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，利用納米技術(shù)構(gòu)建靶向納米藥物遞送系統(tǒng)可改善傳統(tǒng)藥物溶解性和傳遞效率，延長(zhǎng)藥物半衰期，提高其生物利用度及降低不良反應(yīng)，有望解決臨床治療中出現(xiàn)的耐藥性問題［1］。近年來，基于納米顆粒的靶向藥物載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域越來越多地受到關(guān)注和青睞［2］，如脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)、線粒體、具有大平面尺寸和比表面積的過渡金屬硫族化合物和過渡金屬碳化物等二維材料。然而，新型納米藥物載體的有效性、安全性、藥代動(dòng)力學(xué)等成藥性特征仍需深入和系統(tǒng)的研究。此外，納米載體藥物在未來大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用中仍存在一些“瓶頸”問題，如納米載體載藥量低、載體材料制備復(fù)雜、批次間可控性較差、生產(chǎn)成本高昂、具有潛在的系統(tǒng)毒性和免疫原性等，很大程度上限制了其臨床應(yīng)用［3-4］。

Fig.1 Number of publications regarding the self-assembled carrier-free nanodrugs reported in recent 10 years(web of science,2022.04.07)圖1 近10年自組裝無載體納米藥物文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量(web of science,2022.04.07)

為了實(shí)現(xiàn)更高的療效，無載體納米藥物的概念被提出。這種策略是基于藥物分子的自組裝作用形成的納米結(jié)構(gòu)，其載藥量高達(dá)100%［5］。相比于傳統(tǒng)納米藥物遞送系統(tǒng)，自組裝無載體納米藥物遞送系統(tǒng)還具有如下獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：制備方法簡(jiǎn)單靈活、藥物負(fù)載能力和傳遞效率高、血液循環(huán)半衰期長(zhǎng)、避免載體帶來的相關(guān)毒性及免疫原等副作用［6］。近年來，無載體納米藥物廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、抗炎和抗氧化等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［7］，從近10年相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)量（圖1）可以看出，無載體納米藥物越來越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。因此，本文主要系統(tǒng)地綜述無載體納米藥物的自組裝機(jī)理、制備方法及其在抗腫瘤、抗菌、抗炎、抗氧化等方面的應(yīng)用，重點(diǎn)指出目前無載體納米藥物在應(yīng)用過程中存在的主要問題，并展望未來相關(guān)的主要研究方向，為無載體納米藥物在醫(yī)藥治療領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供重要的借鑒。

1 無載體納米藥物自組裝作用力

自組裝是基本結(jié)構(gòu)單元（分子、納米材料、微米物質(zhì)等）自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)的一種技術(shù)。目前，無載體納米藥物主要通過氫鍵、π-π 堆積、疏水作用、靜電作用和范德華力等非共價(jià)鍵的弱作用力自組裝形成。

1.1 氫鍵

氫鍵是無載體納米藥物自組裝很重要的一種非共價(jià)鍵驅(qū)動(dòng)作用力。氫鍵主要存在于H原子和電負(fù)性的原子（如O、F 和N）之間，是一種比較弱的作用力，強(qiáng)度為10～40 kJ/mol［8-9］。Le 等［9］使用瞬時(shí)納米沉淀法通過紫杉醇（paclitaxel，PTX）、單寧酸（tannic acid，TA） 及聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）之間的氫鍵作用自組裝制備出平均粒徑為54 nm 的紫杉醇/單寧酸/聚乙烯基吡咯烷酮納米藥物（PTX-NP）（圖2），單寧酸可以抑制腫瘤細(xì)胞中P糖蛋白的表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞耐藥性。pH 響應(yīng)型的PTX-NP 能夠在胃腸道靶向釋放，口服給藥后相對(duì)生物利用度為25.6%，在乳腺癌異種移植小鼠模型中具有顯著的腫瘤抑制效果。分子動(dòng)力學(xué)模擬研究表明，PVP的羰基與TA 中的鄰苯三酚或兒茶酚部分形成氫鍵，PTX 的羥基或氧原子與TA 形成氫鍵。與PVP 相比，TA與PTX之間的氫鍵作用力更強(qiáng)，但是TA與PVP之間的氫鍵作用對(duì)形成穩(wěn)定的無載體納米藥物PTX-NP具有重要作用。

Fig.2 Self-assembly mechanism diagram of PTX-NP［9］圖2 PTX-NP的自組裝機(jī)理圖［9］

1.2 π-π堆積

π-π 堆積是有機(jī)納米藥物自組裝的重要驅(qū)動(dòng)力之一。π-π 堆積是指芳香環(huán)之間有吸引力的非共價(jià)相互作用，是一種與氫鍵同樣重要的非共價(jià)鍵相互作用，其強(qiáng)度在1～50 kJ/mol之間，可以促進(jìn)含有π共軛基團(tuán)的定向生長(zhǎng)［10］。因此，芳香族化合物的芳香環(huán)可以通過邊對(duì)面（T 形）、偏移堆疊或者面對(duì)面相互堆積驅(qū)動(dòng)自組裝形成納米藥物［11］。Zhu等［12］通過鐵死亡誘導(dǎo)劑erastin 和光敏劑二氫卟吩e6（chlorin，Ce6）之間的π-π堆積和氫鍵作用力自組裝成無載體納米藥物Ce6-erastin，Ce6-erastin 能被腫瘤細(xì)胞高效攝取。一方面鐵死亡過程中脂質(zhì)過氧化物和活性氧（ROS）的過量蓄積破壞氧化還原穩(wěn)態(tài)，另一方面鐵死亡過程中芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的分子氧可補(bǔ)充光動(dòng)力治療（PDT）過程中氧氣的消耗，進(jìn)一步提高PDT的療效，因此，Ce6-erastin介導(dǎo)的誘導(dǎo)鐵死亡聯(lián)合PDT可以有效抑制腫瘤細(xì)胞活性，具有顯著的抗腫瘤效果。研究表明，可以通過調(diào)控π-π 相互作用自組裝制備不同形狀的無載體納米藥物。Hu 等［13］將 親 水 聚 乙 二 醇（polyethylene glycol，PEG） 和還原性響應(yīng)喜樹堿前藥單體（CPTM）通過可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合反應(yīng)制備出聚前藥兩性分子PEG-b-PCPTM，然后通過調(diào)控PEG-b-PCPTM 自組裝過程中有機(jī)溶劑的組成和加水速度，高效可控制備出具有4種不同結(jié)構(gòu)的納米藥物（球形、花狀復(fù)合囊泡、光滑盤狀和錯(cuò)列堆積片層結(jié)構(gòu)）。研究表明，4 種結(jié)構(gòu)納米藥物具有不同的降解速率、藥物釋放速率和腫瘤細(xì)胞毒性。此外，不同形貌自組裝納米藥物也表現(xiàn)出不同的生物效應(yīng)。

1.3 疏水作用

疏水作用是疏水藥物自組裝形成納米粒子的主要驅(qū)動(dòng)力。由于疏水分子不能與水分子充分相互作用，它們傾向于在水溶液中以最小化表面積的形式聚集，從而降低總能量，提高納米結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［14］。近年來，許多研究學(xué)者通過疏水作用將疏水性藥物和親水性藥物自組裝成無載體納米藥物。Cao 等［15］通過疏水作用將疏水的酚類抗氧化劑琥珀丁醇（succinobucol，SCB）與三嵌段聚合物泊洛沙姆P188 自組裝成球形納米顆粒，該納米粒子提高了SCB 的口服生物利用度，并顯著降低乳腺癌細(xì)胞VCAM-1 的表達(dá)，抑制乳腺癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。Huang 等［16］通過疏水作用將親水性抗癌藥伊立替康（irinotecan，Ⅰr）和疏水性抗癌藥苯丁酸氮芥（chlorambucil，Cb）自組裝形成球形Ⅰr-Cb納米藥物，該自組裝無載體納米藥物在血液中的滯留時(shí)間更長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞對(duì)藥物的高效攝取，藥物進(jìn)入細(xì)胞后親水性和疏水性單體藥物之間的酯鍵水解，釋放出游離的Ⅰr 和Cb，發(fā)揮優(yōu)異的抗癌活性。目前由疏水作用驅(qū)動(dòng)形成的自組裝無載體納米藥物多為球形納米粒子，但也有少數(shù)為其他結(jié)構(gòu)。Liang等［17］將兩個(gè)疏性水性的抗癌藥物喜樹堿分子（camptothecin，CPT）和兩個(gè)親水性的抗癌藥物氟尿苷分子（floxuridine，F(xiàn)UDR）通過可水解的酯鍵偶聯(lián)到季戊四醇骨架上，通過疏水作用自組裝合成一種具有高度對(duì)稱性的Janus結(jié)構(gòu)喜樹堿-氟尿苷共軛化合物（JCFC NCs）。該JCFC 共軛化合物在極性溶劑中可自組裝形成具有類似脂質(zhì)體雙層膜結(jié)構(gòu)的納米膠囊。JCFC 納米膠囊的載藥量高達(dá)60%以上，穩(wěn)定性較高且可避免藥物分子的泄漏。與游離的FUDR 及CPT 相比，JCFC 納米膠囊可高效富集到達(dá)腫瘤部位，在酸性微環(huán)境和酯酶的作用下，釋放出摩爾比為1∶1的氟尿苷/喜樹堿具有顯著的協(xié)同抗腫瘤效果。

1.4 其他非共價(jià)作用力

除了氫鍵、π-π 相互作用和疏水作用，靜電作用和范德華力也是驅(qū)動(dòng)自組裝制備無載體納米藥物的非共價(jià)作用力。靜電作用發(fā)生在含有帶電基團(tuán)的藥物之間，帶電基團(tuán)之間的相互作用力與電荷量成正比，與基團(tuán)電荷中心距離成反比［18-19］。對(duì)于帶電基團(tuán)的藥物，通過改變藥物比例可以改變靜電作用活化能，從而獲得具有不同粒徑的無載體納米藥物。Xiao 等［19］通過阿霉素（doxorubicin，DOX）上的—NH2+和光敏劑脫鎂葉綠酸 A（pyropheophorbide a，PhA）上的—COO-之間的靜電作用自組裝制備了無載體納米粒子DOX-PhA NPs，用于光/化療聯(lián)合治療癌癥。通過調(diào)控DOX和PhA 的比例，可以制備得到不同粒徑的DOXPhA NPs。在弱相互作用力中，范德華力屬于短程作用力，它比化學(xué)鍵或共價(jià)鍵弱得多，能量在1～4 kJ/mol 之間［20］。雖然范德華力很少被視為控制自組裝的主要驅(qū)動(dòng)力，但它可以用來調(diào)整納米粒子的大小、分子晶體構(gòu)象和穩(wěn)定性［20］。

無載體納米藥物也可以由兩種或兩種以上的非共價(jià)作用自組裝而成。Zhang 等［21］通過吉非替尼（gefitinib，GEF）和三肽酪絲纈肽（tyroservatide，YSV）之間的氫鍵和π-π堆積作用自組裝制備無載體納米藥物GEF-YSV NPs，與GEF、YSV 和GEF/YSV 混合藥物相比，GEF-YSV NPs 的細(xì)胞內(nèi)化作用增強(qiáng)，可顯著抑制癌細(xì)胞增殖。Zhou等［22］通過π-π堆積和氫鍵將喜樹堿-20（S）-甘氨酸（CPT-NH2）自組裝成納米纖維，該納米藥物可以有效穿透癌細(xì)胞的細(xì)胞膜，最大限度地提高療效。Wang 等［23］利用大黃素（rhein，Rhe）和DOX 分子之間的氫鍵、π-π 作用和疏水作用通過反溶劑沉淀法自組裝制備RHE/DOX NPs（RD NPs）。與單獨(dú)用藥相比，RD NPs 對(duì)4T1 細(xì)胞表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性，通過調(diào)控NF-κB1和MMP-9的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和生長(zhǎng)。

綜上所述，無載體納米藥物主要通過氫鍵、π-π 堆積、疏水作用、靜電作用以及范德華力等非共價(jià)作用自組裝而成。分子間的非共價(jià)作用力取決于藥物分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一般來說，具有以下結(jié)構(gòu)特征的分子可能會(huì)通過自組裝形成無載體納米藥物：a.大量的芳香結(jié)構(gòu)（驅(qū)動(dòng)π-π堆積相互作用）；b.各種離子基團(tuán)（驅(qū)動(dòng)靜電作用）；c.豐富的氧原子和氮原子（驅(qū)動(dòng)氫鍵）［3］。

2 無載體納米藥物的自組裝制備方法

無載體納米藥物的自組裝方法包括體內(nèi)自組裝法和體外自組裝法。與體外自組裝法相比，體內(nèi)自組裝法制備的無載體納米藥物具有更高的載藥量，在血液中的循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)，具有更優(yōu)異的細(xì)胞攝取率［7］。

2.1 體外自組裝法

無載體納米藥物的體外自組裝法包括自上而下法、反溶劑沉淀法和模板輔助沉淀法。

2.1.1 自上而下法

無載體納米藥物的自上而下制備方法主要包括高壓均質(zhì)法和介質(zhì)研磨法。高壓均質(zhì)法是指在高壓條件下，利用沖擊力、剪切力和空腔作用來減小藥物的粒徑，制備粒徑分布較窄的納米藥物［7］。Fan等［24］通過高壓均質(zhì)法制備了平均粒徑為（125.6±2.2）nm 的雷公藤紅素-牛血清白蛋白納米藥物（celastrol-BSA-NPs）。celastrol-BSA-NPs 的載藥量高達(dá)（13.88±0.12）%，釋放時(shí)間最長(zhǎng)可達(dá)168 h。與游離的雷公藤紅素相比，celastrol-BSA-NPs在水溶液中的溶解度更高，細(xì)胞攝取率更高，通過腸道屏障的能力更強(qiáng)，在治療飲食誘導(dǎo)的肥胖癥方面表現(xiàn)出更好的生物利用度和體內(nèi)療效。該方法具有操作簡(jiǎn)單和可規(guī)?；a(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，但是存在設(shè)備成本高、均質(zhì)循環(huán)次數(shù)多、均質(zhì)化前藥物需經(jīng)過高速攪拌和分散預(yù)處理等缺點(diǎn)［25］。介質(zhì)研磨法是將藥物與研磨介質(zhì)置于研磨室中，通過機(jī)器的運(yùn)轉(zhuǎn)帶動(dòng)藥物顆粒之間以及藥物顆粒與研磨介質(zhì)、器壁間的撞擊，而達(dá)到納米級(jí)別［26］。如Tanaka等［27］通過在磨漿中加入適量的分散劑Pluronic F-68，將難溶性藥物阿苯達(dá)唑和達(dá)那唑分別研磨為納米顆粒。分散的納米顆粒通過凍干從漿液中提取出來，得到粒徑分別為185和102 nm的納米顆粒。介質(zhì)研磨法雖然操作簡(jiǎn)單、可大規(guī)模生產(chǎn)，但是磨床可能因?yàn)楦g而污染產(chǎn)品，延長(zhǎng)制備周期。因此，研磨介質(zhì)磨損和研磨表面可能對(duì)產(chǎn)品帶來的污染限制了其在高純度納米藥物制備領(lǐng)域的應(yīng)用。研究表明，通過與其他方法結(jié)合，可以解決介質(zhì)研磨法存在的缺點(diǎn)。Patel等［28］通過超聲波輔助介質(zhì)研磨法制備得到小粒徑低污染的非諾貝特納米藥物，提高了藥物懸浮液的穩(wěn)定性。

2.1.2 反溶劑沉淀法

反溶劑沉淀法通常是將疏水性藥物或者兩親化合物溶解在合適的有機(jī)溶劑中，然后與大量反溶劑（如去離子水）混合，使溶液過飽和，進(jìn)而析出藥物并通過非共價(jià)作用力自組裝為無載體納米藥物（圖3）。反溶劑沉淀法具有操作簡(jiǎn)單、環(huán)境友好、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。通過改變反溶劑沉淀法關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)參數(shù)可以調(diào)控?zé)o載體納米藥物的形貌和尺寸，使無載體納米藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間更長(zhǎng)，具有更優(yōu)異的細(xì)胞攝取率［7］。如Chen 等［29］以10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）乙醇溶液和DOX水溶液為主要實(shí)驗(yàn)藥物原料，通過調(diào)控DOX/HCPT 摩爾濃度和HCPT 乙醇溶液的注射速率，可以制備形貌和粒徑可控的無載體納米藥物HCPT/DOX，當(dāng)DOX/HCPT 摩爾濃度為4∶1 時(shí)，得到形貌均一、粒徑為231.6 nm的球形無載體納米藥物。

Fig.3 Schematic illustration for the synthesis of carrier-free nanodrugs by reverse solvent precipitation［6］圖3 反溶劑沉淀法制備無載體納米藥物的示意圖［6］

雖然反溶劑沉淀法操作簡(jiǎn)便、成本低廉，不需要昂貴的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，但是，在反溶劑沉淀法自組裝過程中，無載體納米藥物的形貌和尺寸非常容易受到藥物濃度、溶劑類型和攪拌速率等關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)因素的影響［6］。因此，此方法制備無載體納米藥物仍然面臨很多“瓶頸”，如制備的無載體納米藥物產(chǎn)率較低、 重復(fù)性較差且粒徑較大（100～500 nm）等［30-31］。

2.1.3 模板輔助沉淀法

模板輔助沉淀法在反溶劑沉淀法的基礎(chǔ)上，通過使用模板來實(shí)現(xiàn)對(duì)無載體納米藥物顆粒尺寸的控制，可以解決反溶劑沉淀法所面臨的瓶頸問題。模板輔助沉淀法可分為陽極氧化鋁（AAO）模板輔助法［32］和冰模板輔助法［33］，此方法首先將預(yù)處理的模板在藥物溶液中浸泡，使藥物溶液通過毛細(xì)管力擴(kuò)散到模板的孔或縫隙，然后使溶劑揮發(fā)，藥物前體進(jìn)行自組裝，最后去除模板得到無載體納米藥物。通過模板輔助法制備的無載體納米藥物的粒徑受到藥物濃度和模板孔徑的影響，當(dāng)實(shí)驗(yàn)藥物的濃度較高時(shí)，模板中藥物的濃度也較高，因此自組裝制備的無載體納米藥物的粒徑就越大［7］。然而，當(dāng)實(shí)驗(yàn)藥物濃度升高到一定的閾值時(shí)，無載體納米藥物的粒徑主要受模板孔徑大小的影響。如Zhang等［32］通過調(diào)控AAO 模板尺寸制備出粒徑分布為10～100 nm 的無載體納米藥物替尼泊苷VM-26 PND，首次合成了粒徑小于20 nm的無載體納米藥物（圖4），突破了反溶劑沉淀法無法制備粒徑較小的無載體納米藥物的瓶頸。此外，該方法也應(yīng)用于多種實(shí)驗(yàn)藥物自組裝制備無載體納米藥物，如紫杉醇（paclitaxel，PTX）、他莫昔芬（tamoxifen，TMF）、卡莫司?。╟armustine，BCNU）、甲氨蝶呤 （methotrexate， MTX） 和 6- 巰 基 嘌 呤（6-mercaptopurine，6-MP）等［32］。

Fig.4 Schematic diagram of preparation of carrier-free nanodrugs by AAO template assisted precipitation method［32］圖4 利用AAO模板輔助沉淀法制備無載體納米藥物的步驟示意圖［32］

但是，AAO模板輔助法使用的AAO模板價(jià)格昂貴、前處理程序冗雜、殘存的微量模板可能污染藥物，且去除AAO 模板使用的強(qiáng)酸或強(qiáng)堿可能會(huì)破壞納米藥物的結(jié)構(gòu)。近年來，研究表明使用冰模板輔助法制備無載體納米藥物具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如Zhang 等［33］開發(fā)一種低成本、環(huán)境友好的冰模板輔助法制備具有高純度和生物相容性的無載體納米藥物姜黃素（Cur PDNs），將溶解在四氫呋喃中的姜黃素滴在冰模板上，有機(jī)溶劑揮發(fā)后，姜黃素滲透到冰晶體中，冰模板在-20℃反應(yīng)24 h使實(shí)驗(yàn)藥物自組裝為純姜黃素納米藥物。最后，通過融化、冷凍干燥或超聲分散在去離子水中等方法提取純姜黃素納米藥物。通過調(diào)控冰模板晶界形狀和通道尺寸可以制備得到不同形貌和粒徑的無載體納米藥物。與AAO 模板輔助法相比，冰模板輔助法成本低廉、操作簡(jiǎn)便、模板易得且制備的無載體納米藥物產(chǎn)率較高。

2.2 體內(nèi)自組裝法

體內(nèi)自組裝是指通過靜脈注射的外源性小分子響應(yīng)于特定位點(diǎn)發(fā)生自組裝，原位形成具有特定診斷和治療功能的高度有序納米藥物，其廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷和治療等領(lǐng)域［34-35］。不同于納米材料的被動(dòng)靶向，體內(nèi)自組裝納米藥物具有獨(dú)特的靶向方式，即小分子藥物的自組裝對(duì)病理位點(diǎn)具有選擇性，可避免非靶向藥物遞送帶來潛在副作用的風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)刺激來源的不同，用于體內(nèi)自組裝的刺激可分為內(nèi)源性刺激和外源性刺激。內(nèi)源性刺激包括多種過表達(dá)的酶、pH值和氧化還原環(huán)境等［36］。與正常器官不同，腫瘤部位過表達(dá)的酶、酸性環(huán)境和氧化還原條件等可作為觸發(fā)因素引發(fā)小分子藥物自組裝。在這些生理信號(hào)的刺激下，藥物前體被切割或共軛以改變其化學(xué)結(jié)構(gòu)和組裝性質(zhì)，從而使所得的分子進(jìn)一步自組裝成所需的納米藥物［37］。如圖5所示，Cong 等［34］利用腫瘤微環(huán)境pH 來調(diào)控體內(nèi)自組裝行為，將由pH 敏感單元順烏頭酸酐（CAA）修飾的治療肽和細(xì)胞穿膜肽通過硫醇-烯點(diǎn)擊反應(yīng)與主鏈β-硫代酸酯偶聯(lián)，開發(fā)出了一種pH響應(yīng)型多肽聚合物，CAA 可以使多肽聚合物在中性水溶液中水解為穩(wěn)定的單鏈狀態(tài)。多肽聚合物單鏈尺寸較小，可以滲透到腫瘤深處；而當(dāng)多肽聚合物到達(dá)腫瘤中的弱酸微環(huán)境中時(shí)，CAA 將響應(yīng)脫除并引起多肽聚合物自組裝為納米顆粒。此納米顆?？梢酝ㄟ^內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，同時(shí)CAA 的完全水解也使治療肽的治療活性恢復(fù)，從而有效殺死癌細(xì)胞。Wu 等［38］設(shè)計(jì)一種堿性磷酸酶（ALP）可激活的近紅外探針ⅠR775-Phe Phe-Tyr（H2PO3）-OH（1P）。研究表明，1P在腫瘤微環(huán)境中堿性磷酸酶的作用下去磷酸化，生成疏水性的產(chǎn)物ⅠR775-Phe-Phe-Tyr-OH（1），其被腫瘤細(xì)胞攝取后自組裝成納米顆粒（1-NPs）。1-NPs 使光聲成像信號(hào)增大6.4倍，可用于精準(zhǔn)診斷探針相對(duì)應(yīng)的癌癥。

Fig.5 Schematic illustration for the self-assembly and permeation of PT-K-CAA in tumor microenvironment［34］圖5 PT-K-CAA在腫瘤微環(huán)境中的自組裝及滲透過程示意圖［34］

外源性刺激一般指外部物理刺激，如溫度和化學(xué)反應(yīng)等。Liu 等［39］合成了由多聚（β-硫酯）、功能肽和近紅外分子組成的聚合物偶聯(lián)物（polymerpeptide conjugates，PPCs）。PPCs尺寸較?。ǎ?0 nm），易在腫瘤部位發(fā)生滲透，從而能夠“深入腫瘤內(nèi)部”。在近紅外激光照射下，近紅外分子引起的高溫使熱響應(yīng)性PPCs 在腫瘤內(nèi)自組裝為球形納米顆粒。其在腫瘤內(nèi)積聚并有效進(jìn)入細(xì)胞，通過破壞線粒體膜誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。不同類型的外源性刺激可以協(xié)同靶向癌細(xì)胞。Yao 等［40］利用酶觸發(fā)的超分子自組裝和四嗪（tetrazine，Tz） 與反式環(huán)辛烯（trans-cyclooctene，TCO）之間的生物正交斷鍵反應(yīng)合成了帶有前藥激活開關(guān)Tz 的酶響應(yīng)組裝前體短肽，與Tz 偶聯(lián)的分子在宮頸癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)的磷酸酶作用下去磷酸化并原位自組裝為納米組裝體，使前藥激活開關(guān)Tz 獲得腫瘤靶向性并且大量富集。阿霉素前藥TCO-DOX在腫瘤內(nèi)能被高效激活，注射4 h后，腫瘤內(nèi)活化的DOX濃度比正常細(xì)胞或組織高10倍，顯著提高了癌細(xì)胞的殺傷效果。

綜上所述，介質(zhì)研磨法和高壓均質(zhì)法可用于工業(yè)化生產(chǎn)納米藥物，但過程耗時(shí)、易污染產(chǎn)品；反溶劑沉淀法和模板輔助沉淀法是自組裝制備納米藥物常用的方法，具有綠色環(huán)保、工藝簡(jiǎn)單、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但是目前僅限于實(shí)驗(yàn)室或者理論研究；而體內(nèi)自組裝法制備的納米藥物具有靶向性，可在目標(biāo)位置進(jìn)行自組裝，從而達(dá)到更高的療效。

3 無載體納米藥物的應(yīng)用

3.1 抗腫瘤作用

根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的數(shù)據(jù)，目前癌癥已成為全球第二大死因，每年有近960 萬人死于癌癥［41］?；瘜W(xué)藥物治療（化療）是臨床控制腫瘤惡化的主要手段之一。然而，化療中使用的藥物存在生物相容性差、副作用大、耐藥等缺點(diǎn)，極大地限制了其臨床療效［42］。目前研究表明，將化療藥物以非共價(jià)鍵封裝到納米載體（如納米微球、脂質(zhì)體以及各種類型的聚合物膠束）中可以改善難溶藥物的溶解性，滿足不同給藥途徑，但是，這些納米系統(tǒng)的載藥能力低，藥物釋放緩慢，進(jìn)一步限制了其治療效果［43］。

因此，開發(fā)一種不使用載體的高負(fù)載藥物給藥系統(tǒng)是非常有意義的。自組裝無載體納米藥物是指由一種或幾種活性藥物自驅(qū)動(dòng)形成的納米級(jí)自投遞藥物［44］。由于其具有載藥量高和無載體等優(yōu)點(diǎn)，已被研究者開發(fā)用于治療腫瘤。如Fan 等［45］利用熊果酸（ursolic acid，UA）分子間的靜電和疏水作用通過反溶劑沉淀法自組裝合成單一純納米藥物（UA NPs），通過下調(diào)STAT 3的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄過程，誘導(dǎo)TNF-α 的表達(dá)來殺傷癌細(xì)胞。與游離UA 相比，UA NPs 顯著改善了治療動(dòng)物外周血中CD4+ T 細(xì)胞的數(shù)量，并增強(qiáng)了CD4+/CD8+T細(xì)胞的浸潤(rùn)。除熊果酸外，阿霉素［46］、喜樹堿［47］和紫杉醇［48］等抗癌藥物也被發(fā)現(xiàn)具有自組裝能力，其自組裝形成的納米藥物與游離的純藥物相比，制備簡(jiǎn)單、載藥量超高，且可顯著提高抗癌效果。

由于腫瘤的異質(zhì)性［49］，單藥通常不足以控制腫瘤，因此，多種化療藥物聯(lián)合治療被認(rèn)為是一種更有前景的癌癥治療方式［50］。Xiao等［42］利用雷公藤紅素（celastrol，CST）和DOX 分子間的靜電作用和π-π堆積，通過反溶劑沉淀法將其自組裝形成雷公藤紅素/阿霉素納米藥物（CST/DOX NPs）（圖6a）。通過使用PBS 緩沖溶液（pH=7.4 和5.0）模擬血管中的血流條件和腫瘤酸性微環(huán)境，對(duì)其進(jìn)行體外藥物釋放研究，在pH7.4 PBS中經(jīng)過48 h后僅釋放出48.9%的DOX，但在pH5.0 PBS中48 h后釋放出83.2%的DOX，表明CST/DOX NPs 的體外釋放具有明顯的pH 響應(yīng)性。激光共聚焦顯微鏡分析表明CST/DOX NPs 通過被MCF-7 和MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)化而轉(zhuǎn)化為游離藥物CST 和DOX，從而發(fā)揮抗癌作用。與單藥和CST/DOX 復(fù)合物相比，在CST/DOX NPs 處理下多細(xì)胞球形腫瘤（MCs）的平均直徑從100%降低到11.8%，具有顯著的抗癌效果（圖6b）。此外，腫瘤微環(huán)境具有不同于其他組織的特點(diǎn)，如微酸性（pH=5.6）、谷胱甘肽（GSH）過度表達(dá)、乏氧程度嚴(yán)重以及過氧化氫水平高等［51］。因此，不少研究者通過脂鍵或二硫鍵將兩種化療藥物結(jié)合形成兩親性前藥，隨后自組裝形成納米藥物，可以在腫瘤細(xì)胞內(nèi)部響應(yīng)性轉(zhuǎn)化為具有生物活性的原藥，從而達(dá)到抗腫瘤的效果并降低藥物的全身毒副作用的目的。如Hou等［52］將親水性藥物吉西他濱（gemcitabine，Gem）和疏水性藥物CPT 通過二硫鍵鏈接后得到兩親性Gem-CPT前藥，通過反溶劑沉淀法在水溶液中自組裝形成Gem-CPT NAs。在腫瘤還原性的微環(huán)境下，Gem-CPT NAs 二硫鍵被裂解，釋放出Gem 和CPT分子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。Huang 等［53］通過酯化反應(yīng)將疏水性藥物Cb分別與親水性藥物Gem和Ⅰr 鏈接起來，得到兩親性的綴合物Gem-Cb 和Ⅰr-Cb，由于具有兩親性特征，Gem-Cb 和Ⅰr-Cb 綴合物能在水中組裝形成納米粒子。此外，可以使用反溶劑沉淀法將具有不同摩爾比例的兩種綴合物Gem-Cb和Ⅰr-Cb自組裝制備成具有優(yōu)異抗癌效果的三元納米復(fù)合藥物（圖6c）。該三元納米復(fù)合藥物到達(dá)腫瘤細(xì)胞后酯鍵被水解，釋放出3種具有不同抗癌機(jī)制和非毒性重疊的藥物，從而發(fā)揮藥物的協(xié)同治療作用以提高療效。體外細(xì)胞毒性研究表明，三元納米復(fù)合藥物N4對(duì)人肺癌細(xì)胞A549具有較高的細(xì)胞毒性（圖6d，e）。

此外，通過引入靶向配體也可以提高無載體納米藥物對(duì)癌細(xì)胞的靶向性和降低全身毒性。常用的癌癥治療靶向配體有CD44、葉酸受體或整合素受體等。例如，Jiang 等［54］通過π-π 堆積、疏水和靜電作用將熊果酸和DOX自組裝形成UD NPs，并在表面修飾HER2適配體，提高了對(duì)乳腺癌細(xì)胞的靶向能力，從而達(dá)到更好的抗癌作用。

3.2 抗菌作用

細(xì)菌感染嚴(yán)重威脅著人類的健康，導(dǎo)致各種疾病甚至死亡［55］?？股厥侵委熍R床細(xì)菌感染相關(guān)疾病的主要藥物，然而，抗生素的大量使用使得耐藥菌發(fā)生率急劇增加，給臨床細(xì)菌感染相關(guān)疾病的治療帶來極大挑戰(zhàn)。相關(guān)研究表明，利用納米技術(shù)開發(fā)載藥系統(tǒng)，可以減少抗生素的劑量和使用頻率［56-58］。納米藥物載體具有體積小、比表面積大、基質(zhì)可控釋放、靶向給藥等優(yōu)點(diǎn)，但是，載藥系統(tǒng)使用的無機(jī)輔助劑如二氧化硅、金屬骨架等不能被人體代謝消除［59-60］。因此，合成簡(jiǎn)單、無載體、生物相容性好的自組裝納米藥物在臨床細(xì)菌感染治療中具有重要意義。

Fig.6 Self-assembled carrier-free nanodrugs for cancer therapy[42,53]圖6 自組裝無載體納米藥物用于癌癥治療［42，53］

雷海明等［61-63］基于中藥處方的啟示，研究發(fā)現(xiàn)小檗堿上的季銨離子和苯環(huán)可與其他藥物通過非共價(jià)自組裝成納米粒子，發(fā)揮抗菌作用。比如，該課題組基于中藥活性成分小檗堿（berberine，Ber）和Rhe 之間的π-π 相互作用和靜電作用利用反溶劑沉淀法自組裝制備Ber-Rhe NPs（圖7a）。由于兩種活性成分Ber和Rhe的協(xié)同抑菌作用，Ber-Rhe NPs的抗菌活性顯著增強(qiáng)（圖7b）［61］。該課題組也通過構(gòu)建小檗堿和肉桂酸自組裝納米給藥系統(tǒng)以提高對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性［62］。在自組裝過程中，肉桂酸的羰基可與小檗堿的氮原子形成氫鍵，同時(shí)兩個(gè)分子的芳香環(huán)形成π-π堆積結(jié)構(gòu)。該自組裝納米粒子能自發(fā)地吸附于細(xì)菌表面，滲入細(xì)胞，攻擊多耐藥的金黃色葡萄球菌，從而達(dá)到較強(qiáng)的抑菌效果。Song 等［64］對(duì)小檗堿進(jìn)行烷基化修飾后合成4種衍生物，在抗幽門螺旋桿菌上表現(xiàn)出比小檗堿更強(qiáng)的抗菌活性。隨著小檗堿上修飾的烷基鏈長(zhǎng)度的增加，小檗堿衍生物對(duì)幽門螺旋桿菌的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值逐漸降低。并且，該團(tuán)隊(duì)將這4種烷基化小檗堿衍生 物（berberine derivatives，BDs） 和 鼠 李 糖 脂（rhamnolipid，RHL）通過靜電和疏水作用自組裝制備出BD/RHL NDs（圖7c）［65］。與BDs相比，自組裝的納米粒子對(duì)幽門螺旋桿菌的抑制效果增加了2～8 倍。其中，C10-BD 的MIC為1.56 mg/L，而C10-BD/RHL NDs 的MIC為0.78 mg/L。此 外，C10-BD/RHL NDs可以顯著抑制并破壞幽門螺旋桿菌的生物膜，降低生物膜生物量（圖7d）并殺死分散在生物膜中的大部分幽門螺桿菌，減弱殘留細(xì)菌對(duì)生物表面的再黏附作用，從而防止生物膜的重組。因此，自組裝制備的BD/RHL NDs具備小檗堿衍生物的抗菌活性和鼠李糖脂清除生物膜的作用，在對(duì)抗生物膜及抗菌方面有巨大潛力，并為治療幽門螺桿菌引起的相關(guān)慢性胃病提供了一種有前景的方法。

Fig.7 Self-assembled carrier-free nanomaterials for antibacterial[61,65]圖7 自組裝無載體納米藥物用于抗菌［61，65］

3.3 其他作用

3.3.1 抗炎作用

動(dòng)脈粥樣硬化是動(dòng)脈中的一種慢性炎癥，減少斑塊炎癥對(duì)減少動(dòng)脈粥樣硬化血栓的發(fā)生具有重要意義［66］。Nasr 等［67］首先將透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）與阿托伐他?。╝torvastatin，ATV）結(jié)合得到兩親性聚合物HA-ATV，然后通過反溶劑沉淀法在水溶液中自組裝形成以ATV 為疏水核心的納米藥物（HA-ATV NPs）。與游離ATV 相比，HA-ATV NPs 可以通過HA 和CD44 的相互作用靶向炎癥性動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，從而減輕炎癥反應(yīng)。此外，抗炎藥物偶聯(lián)聚合物可自組裝形成納米藥物，改善水溶性，提高其在炎癥治療中的效果，如迷迭香酸［68］和吲哚美辛（indomethacin，ⅠND）［69］。其中，ⅠND 是一種具有很好療效的抗炎藥物，但其水不溶性和極低的生物利用度嚴(yán)重限制了其臨床轉(zhuǎn)化［70］。為了改善ⅠND的水不溶性，Lin等［69］將PEG通過酰胺鍵共價(jià)連接到兩個(gè)ⅠND藥物分子上，并在水溶液中自組裝形成納米前藥（ⅠND-PEG-ⅠND NPs），此自組裝無載體納米藥物可以實(shí)現(xiàn)炎癥環(huán)境中代謝活躍過表達(dá)的組織蛋白酶B的釋放［71］，可特異性水解酰胺鍵。此外，與游離ⅠND 相比，ⅠND-PEG-ⅠND NPs 顯著降低了對(duì)正常成骨細(xì)胞的毒性，并對(duì)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗炎作用。

3.3.2 抗氧化作用

ROS 是生物體中正常細(xì)胞的代謝物，正常水平的ROS 對(duì)于維持細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和其他細(xì)胞內(nèi)功能至關(guān)重要。然而，過度的ROS 會(huì)破壞氧化還原狀態(tài)并引起氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激會(huì)對(duì)細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致一系列嚴(yán)重疾病，例如眼疾、中風(fēng)、敗血癥、阿爾茨海默病和帕金森病等［72-73］。目前被廣泛用于去除生物體中過量ROS 的抗氧化劑在生理?xiàng)l件下具有穩(wěn)定性低、非特異性和短壽命的缺點(diǎn)［74］。因此，開發(fā)新型無載體納米藥物以有效消除細(xì)胞中過表達(dá)的ROS 并防止細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷具有重要意義。Zhu等［75］使用9-芴基甲氧羰基-色氨酸（Fmoc-Trp）、槲皮素（quercetin，Que）和Fe2+作為構(gòu)建模塊，通過配位和靜電相互作用自組裝形成Fmoc-Trp-Fe2+-Que（FTFQ）NPs。FTFQ NPs很大程度提高了Que 的生物利用度，并通過直接/間接方式降低Aβ 的聚集能力，減小Aβ 寡聚體/纖維誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，用于阿爾茨海默病的協(xié)同治療。Zheng 等［76］在熱處理輔助下通過靜電作用驅(qū)動(dòng)帶負(fù)電荷的透明質(zhì)酸和帶正電荷的米托醌（MitoQ）自組裝制備新型線粒體特異性抗氧化納米藥物（MitoO NPs）。MitoQ NPs在線粒體中亞細(xì)胞的分布比游離MitoQ高2～3倍，可以顯著提高線粒體ROS 清除率，減少眼部ROS 的積累，從而緩解干眼病癥狀。

4 結(jié)論與展望

自組裝無載體納米藥物是近幾年開發(fā)的一種新型藥物，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不斷展示其潛在的應(yīng)用價(jià)值，得到了國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。本文主要從無載體納米藥物自組裝機(jī)理、制備方法及其在抗腫瘤、抗菌、抗氧化等方面的應(yīng)用系統(tǒng)闡述了自組裝無載體納米藥物的研究進(jìn)展。目前，自組裝無載體納米藥物的制備方法主要包括自上而下、反溶劑沉淀法、模板輔助沉淀法和體內(nèi)自組裝法。近年來，科研工作者將其開發(fā)應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、抗炎及抗氧化等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。雖然自組裝無載體納米藥物可以降低毒性，表現(xiàn)出良好的治療效果，但將其應(yīng)用于臨床治療還需要進(jìn)一步地深入研究和開發(fā)利用，未來自組裝無載體納米藥物在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重點(diǎn)研究可以圍繞以下方面展開：

a.進(jìn)一步研究和闡明無載體納米藥物自組裝機(jī)制。目前大多數(shù)研究者通常通過經(jīng)驗(yàn)篩選藥物配方［77］，通過分析藥物分子的結(jié)構(gòu)，推測(cè)能否形成弱相互作用力進(jìn)行自組裝。目前已報(bào)道的自組裝納米藥物數(shù)量非常有限，未來仍需要進(jìn)一步探索藥物自組裝機(jī)制并擴(kuò)展自組裝藥物分子庫。可以通過建立數(shù)據(jù)庫、計(jì)算機(jī)輔助分子結(jié)構(gòu)模擬和單晶衍射等方法詳細(xì)研究和了解藥物分子的空間幾何結(jié)構(gòu)以及藥物分子之間可能存在的弱相互作用，并且借助計(jì)算機(jī)建模來預(yù)測(cè)藥物分子的自組裝行為［78-79］，從而更好地理解分子自組裝機(jī)制，篩選出更多藥物自組裝配方，這對(duì)于新型無載體納米藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)具有非常重要的指導(dǎo)意義。

b.深入研究無載體納米藥物輔料的毒性和在體內(nèi)的代謝途徑，系統(tǒng)探討輔料對(duì)自組裝無載體納米藥物發(fā)揮藥效的動(dòng)力學(xué)影響機(jī)制。在無載體納米藥物的制備過程中，一般會(huì)使用輔料如PEG、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA）等增加納米藥物的穩(wěn)定性［36］，目前，輔料對(duì)納米藥物的緩釋和治療效果影響的相關(guān)研究仍然非常缺乏。

c.防止無載體納米藥物早期滲漏，提高其穩(wěn)定性。無載體納米藥物通常通過弱相互作用力自組裝而成，其納米結(jié)構(gòu)容易受到體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的影響，導(dǎo)致藥物在到達(dá)靶點(diǎn)之前發(fā)生滲漏，具有不穩(wěn)定性［7］。目前已經(jīng)有部分研究學(xué)者試圖通過加入少量的聚乙二醇、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜等［80］來提高其穩(wěn)定性和治療效果。此外，研究表明，可以通過對(duì)藥物分子進(jìn)行修飾，引入在靶點(diǎn)能刺激響應(yīng)性斷裂的鏈接，從而實(shí)現(xiàn)選擇性藥物釋放，但同時(shí)也可能帶來工業(yè)生產(chǎn)處理和穩(wěn)定性問題。因此，自組裝無載體納米藥物的穩(wěn)定性可能會(huì)嚴(yán)重限制其在臨床應(yīng)用的實(shí)際應(yīng)用，應(yīng)該積極探索與其他改性方法相結(jié)合，尋求更優(yōu)的方法提高其穩(wěn)定性，防止無載體納米藥物早期滲漏，從而開發(fā)出能夠應(yīng)用于臨床治療的高效穩(wěn)定無載體納米藥物，這是未來非常重要的研究方向之一。

d.精準(zhǔn)控制無載體納米藥物在應(yīng)用中的粒徑大小和藥物緩釋比例，以期實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。無載體納米藥物粒徑大小決定其生物分布、腫瘤滲透、細(xì)胞內(nèi)化、血漿和組織間隙清除，以及體內(nèi)排泄，所有這些對(duì)癌癥的整體治療效果都有著舉足輕重的影響力。粒徑較小的藥物有利于滲透到腫瘤深處，發(fā)揮更強(qiáng)的腫瘤抑制能力，但其在腫瘤組織處的保留時(shí)間又隨著粒徑增大而增加［7］。因此，非常有必要拓展新的合成方法制備在生物組織不同環(huán)境內(nèi)粒徑可調(diào)的無載體納米藥物，從而實(shí)現(xiàn)更好的治療效果。此外，無載體納米藥物可能有多成分單體藥物組成，深入研究并精準(zhǔn)控制不同藥物的緩釋比例，可以為其臨床治療發(fā)揮更好作用提供科學(xué)指導(dǎo)。

e.實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)中，由于藥物濃度較高，難以保證納米顆粒的理化性質(zhì)與實(shí)驗(yàn)室制備一致。研究表明，冷凍干燥是保證無載體納米藥物貯存穩(wěn)定性的良好選擇［81］，但冷凍干燥配方中顆粒的再分散性和膠體穩(wěn)定性仍然是一個(gè)難題。因此，在未來的研究中，無載體納米藥物的制備技術(shù)應(yīng)滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，其重現(xiàn)性、濃縮性、無菌性、凍干性和存儲(chǔ)性等技術(shù)細(xì)節(jié)需要高度重視。