張?chǎng)┗?，夏林波，鄧仕任，吳佳妮，孫璐，邊星

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

小陷胸湯出自東漢名醫(yī)張仲景所著的《傷寒論》，全方由半夏、黃連、瓜蔞三味藥組成。該方具有很高的臨床價(jià)值，古時(shí)多用于治療邪熱內(nèi)陷、痰熱互結(jié)于心下所導(dǎo)致的小結(jié)胸病，現(xiàn)代小陷胸湯的治療范圍不斷擴(kuò)大，被廣泛應(yīng)用在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、代謝及泌尿系統(tǒng)等系統(tǒng)性疾病的治療[1-2]。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于小陷胸湯的研究及其指標(biāo)性成分含量測(cè)定的報(bào)道并不多見(jiàn)。腺苷是半夏中含量較高的核苷類成分，具有抗病毒、抗腫瘤、改善細(xì)胞代謝等多種生物活性，是判斷半夏藥材質(zhì)量?jī)?yōu)劣的重要依據(jù)[3-4]；黃連的主要成分為生物堿類成分，小檗堿和巴馬汀為黃連中生物堿類的代表性成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用[5]；葫蘆素B屬于四環(huán)三萜類化合物，是瓜蔞中的指標(biāo)性成分，具有保肝、抗炎、抗腫瘤等多種生物活性[6-7]?？梢?jiàn)，上述4種成分具有抗炎、抗腫瘤、改善糖脂代謝、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性，是小陷胸湯的特征藥效成分。本文采用UPLC波長(zhǎng)切換法構(gòu)建了小陷胸湯中4種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定方法，為小陷胸湯的質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支撐和試驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1290 Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；Centrifuge5804 R冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；AL204型電子天平(梅特勒托利多公司)；KQ2200型超聲清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；Milli-Q Academic超純水儀(密里博公司)。

1.2 試藥 腺苷、鹽酸巴馬汀、鹽酸小檗堿、葫蘆素B等4種對(duì)照品，均購(gòu)自四川省維克奇生物科技有限公司，純度均大于98%(批號(hào)分別為：wkq19022111、wkq19042309、wkq17112710、wkq18030205)。乙腈為色譜純(Tedia，美國(guó))；水為超純水，其余試劑均為分析純。黃連、瓜蔞、清半夏等3種中藥飲片，均購(gòu)自大連陽(yáng)光大藥房，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)張建奎教授分別鑒定為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)的干燥根莖，天南星科植半夏[Pinelliaternate(Thunb.) Breit.]的干燥塊莖經(jīng)過(guò)白礬溶液浸泡后所得的炮制品，葫蘆科植物栝樓(TrichmantheskiriloxviiMaxim.)的干燥成熟果實(shí)。

小陷胸湯藥液，依照《傷寒論》記載，先取瓜蔞飲片20 g，加水1 200 mL，小火煎煮，煎至藥液體積為600 mL時(shí)，濾去藥渣，再加入黃連飲片6 g和清半夏飲片12 g，繼續(xù)煎煮，煎至剩400 mL藥液時(shí)，濾除藥渣，即得。平行制備3份，得1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)小陷胸湯藥液。藥材信息及自制的小陷胸湯藥液信息分別見(jiàn)表1、表2。

表1 藥材信息

2 試驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 固定相：Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm，安捷倫科技有限公司)。流動(dòng)相：A相為0.1%甲酸-水，B相為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件：0～6 min，B：5%→8%；6～9 min，B：8%→35%；9～12 min，B：35%→50%。檢測(cè)波長(zhǎng)：0～10 min，262 nm；10～12 min，234 nm。柱溫：46 ℃，流速：0.6 mL·min-1。進(jìn)樣量：3 μL。各色譜峰分離度均大于1.5，以小檗堿峰計(jì)算理論塔板數(shù)不小于14 500。

表2 小陷胸湯藥液信息

2.2 供試品溶液的制備 取小陷胸湯藥液1 mL，4 ℃時(shí)14 000 r·min-1離心15 min，取上清，即得。

2.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 取4種標(biāo)準(zhǔn)品腺苷2.00 mg、鹽酸巴馬汀8.80 mg、鹽酸小檗堿18.0 mg、葫蘆素B 1.20 mg，精密稱定，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解后稀釋至刻度，制成濃度分別為0.40、1.76、3.60、0.24 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。將上述4種對(duì)照品儲(chǔ)備液等量混合，制成每1 mL分別含腺苷0.10 mg、巴馬汀0.44 mg、小檗堿0.90 mg和葫蘆素B 0.06 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。4 ℃保存?zhèn)溆?，用前微孔濾膜過(guò)濾。

2.4 線性關(guān)系考察 將“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，制備7個(gè)不同濃度的系列混合對(duì)照品溶液，其中腺苷、巴馬汀、小檗堿、葫蘆素B的濃度分別為0.017～0.17、0.073～0.73、0.15～1.50、0.01～0.10 mg·mL-1，各吸取3 μL，分別注入U(xiǎn)PLC，按“2.1”項(xiàng)下要求進(jìn)行色譜分析。以峰面積Y對(duì)各成分的絕進(jìn)樣量X(μg)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程見(jiàn)表3。

表3 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取1號(hào)小陷胸湯藥液，分別按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成6份樣品溶液。將各樣品溶液依次檢測(cè)，記錄各次峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果各份供試品溶液中腺苷、巴馬汀、小檗堿和葫蘆素B含量分別為0.052、0.26、0.54、0.036 mg·g-1，RSD(n=6)分別為2.29%、2.31%、1.35%、2.53%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液3 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果腺苷、巴馬汀、小檗堿和葫蘆素B峰面積平均值分別為620.0、3 442.3、7 467.3、342.8，RSD(n=6)分別為1.37%、0.91%、0.94%、1.68%，表明儀器具有良好的精密度。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1號(hào)小陷胸湯藥液，按照“2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成樣品溶液，室溫條件下密封放置，在0、4、16、24、32、36 h分別進(jìn)樣3 μL進(jìn)行分析，記錄峰面積。腺苷、巴馬汀、小檗堿和葫蘆素B峰面積RSD(n=6)分別為1.12%、0.85%、0.94%、1.88%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的小陷胸湯(1號(hào)小陷胸湯藥液，腺苷、巴馬汀、小檗堿和葫蘆素B含量分別為0.052、0.26、0.54、0.036 mg·mL-1)6份，每份精密量取1.00 mL，置2 mL容量瓶中，分別精密加入0.60 mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，稀釋至刻度，搖勻，制備供試品溶液，進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收率試驗(yàn)(n=6)

2.9 實(shí)際樣品測(cè)定 分別取3批次制備的小陷胸湯藥液，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣3 μL進(jìn)行色譜分析，采用外標(biāo)法用峰面積計(jì)算每個(gè)樣品中腺苷、巴馬汀、小檗堿和葫蘆素B等4種成分的含量，結(jié)果見(jiàn)圖1、表5所示。

1.腺苷;2.巴馬汀;3.小檗堿;4.葫蘆素B圖1 小陷胸湯供試品(A)與混合對(duì)照品(B)UPLC色譜圖

表5 含量測(cè)定結(jié)果(mg·g-1, n=3)

3 討論

3.1 本試驗(yàn)采用UPLC波長(zhǎng)切換法測(cè)定小陷胸湯中4種指標(biāo)性成分的含量，與普通HPLC相比，使用UPLC系統(tǒng)可以顯著縮短分析時(shí)間，減少溶劑消耗，提高分離度和靈敏度。目前對(duì)于小陷胸湯質(zhì)量控制的研究，同時(shí)測(cè)定小陷胸湯中多種指標(biāo)性成分含量的報(bào)道較少，多以單一組分小檗堿或總皂苷、總生物堿的含量為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。小陷胸湯成分復(fù)雜，不同指標(biāo)性成分的最大吸收波長(zhǎng)并不相同，采用單一波長(zhǎng)無(wú)法保證每個(gè)成分都有最大吸收，為提高檢測(cè)的靈敏度，本試驗(yàn)采用波長(zhǎng)切換法進(jìn)行檢測(cè)。

3.2 待測(cè)的4種指標(biāo)性成分有不同的吸收波長(zhǎng)[8-11]，對(duì)4種成分進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示，腺苷和葫蘆素B分別在262 nm和234 nm處有最大吸收，巴馬汀和小檗堿均在波長(zhǎng)265、340 nm附近有較強(qiáng)的吸收峰，綜合考慮后，選用262 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)可以同時(shí)測(cè)定腺苷、小檗堿、巴馬汀3種成分，葫蘆素B的測(cè)定波長(zhǎng)則選用234 nm。

3.3 為了評(píng)價(jià)經(jīng)典方劑小陷胸湯的質(zhì)量，本試驗(yàn)采用傳統(tǒng)煎煮法進(jìn)行提取。最終檢測(cè)結(jié)果顯示，3批小陷胸湯中4種指標(biāo)成分的含量基本穩(wěn)定，說(shuō)明傳統(tǒng)煎煮法具有一定的科學(xué)性和穩(wěn)定性。同時(shí)我們也看到，不同批次間葫蘆素B含量的穩(wěn)定性，較其他3種成分要差，其原因可能是由于傳統(tǒng)煎煮法采用水提取，而葫蘆素B為脂溶性成分，因此不易提取完全，由此產(chǎn)生了一定的批次間差異。在下一步的研究中，計(jì)劃進(jìn)一步優(yōu)化提取方法，以提高葫蘆素B含量的穩(wěn)定性[12]。

3.4 本文基于UPLC波長(zhǎng)切換法建立的含量測(cè)定方法可同時(shí)測(cè)定小陷胸湯中腺苷、巴馬汀、小檗堿、葫蘆素B等4種指標(biāo)性成分的含量，該方法簡(jiǎn)便高效、穩(wěn)定準(zhǔn)確，有望為小陷胸湯的質(zhì)量控制提供相關(guān)科學(xué)依據(jù)。