李曉蓉，蘇思榮，張銀霞，張振海，田 蕾，羅成科，李培富

（1. 寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)作物研究所，寧夏 永寧 750105）

2014—2019 年，寧夏回族自治區(qū)水稻種植面積穩(wěn)定在7.33 萬hm2，總產(chǎn)量穩(wěn)定在60 萬t 左右[1]。水稻生長(zhǎng)發(fā)育過程中會(huì)遭遇病蟲害，病蟲害的發(fā)生直接影響水稻產(chǎn)量及品質(zhì)，尤其由稻瘟菌（Magnaprthe grisea）引發(fā)的稻瘟病是最具有殺傷力的水稻病害，造成全球水稻產(chǎn)量平均每年減少10%～30%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)40%～50%，甚至絕產(chǎn)[2-3]。其中，穗頸瘟對(duì)水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的威脅最大。穗頸瘟發(fā)生在水稻穗頸處，感染時(shí)期一般在水稻抽穗破口前，在抽穗后稻瘟菌侵入穗部形成褐色小點(diǎn)，后期逐漸擴(kuò)展到整個(gè)穗頸，使穗頸壞死，阻斷養(yǎng)分和水分的輸送，從而形成癟粒或白穗，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量，甚至?xí)斐山^收[4]。長(zhǎng)期的生產(chǎn)實(shí)踐表明，在眾多的防治措施中，選育和推廣抗病品種是防治該病流行最經(jīng)濟(jì)、有效的手段[5-6]。對(duì)作物品種培育而言，抗病基因的發(fā)掘與利用是提高抗病能力的基礎(chǔ)和核心。

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，定位并克隆抗稻瘟病基因是開展抗病育種的重要前期工作。至今，已克隆的抗稻瘟病基因39 個(gè)，包括Pib、Pita、Pi2、Pi36、Pi37等，大多數(shù)分布在水稻第1、6、11 染色體上[7-12]。其中，Pib是首個(gè)被克隆的抗稻瘟病基因［13］，位于水稻第2 染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域，與Pita基因有43.2%的相似性[14]；Pita基因位于水稻第12 染色體靠近著絲點(diǎn)的區(qū)域［15］。Pib和Pita是抗稻瘟病的主效基因，在我國(guó)很多稻區(qū)表現(xiàn)出高水平的稻瘟病抗性。王軍等［16］研究發(fā)現(xiàn)，Pita、Pib基因與穗頸瘟抗性呈正相關(guān)，同時(shí)聚合Pita和Pib在一定程度上能夠進(jìn)一步提高江蘇省粳稻的穗頸瘟抗性。李忠楠等[17]、王遠(yuǎn)平[18]研究也發(fā)現(xiàn)，Pita基因與穗頸瘟抗性呈顯著正相關(guān)。范方軍等［19］研究發(fā)現(xiàn)，含Pita或Pib基因水稻材料的穗頸瘟抗性水平無4級(jí)高感，而其他抗性基因組合材料的穗頸瘟抗性水平一般都存在4 級(jí)高感。然而，Pita和Pib基因在寧夏回族自治區(qū)水稻種質(zhì)資源中的分布及與穗頸瘟抗性的關(guān)系尚不明確。為此，以85份寧夏回族自治區(qū)當(dāng)?shù)氐乃痉N質(zhì)資源和引進(jìn)的水稻種質(zhì)資源為試驗(yàn)材料，對(duì)其稻瘟病抗性進(jìn)行鑒定，分析Pita、Pib基因及其組合的分布，并探討Pita、Pib基因及其組合與穗頸瘟抗性的關(guān)系，明確這2 個(gè)基因在水稻抗頸瘟病方面的價(jià)值，為通過分子標(biāo)記輔助選擇培育抗穗頸瘟水稻新品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為85份水稻種質(zhì)資源，包括寧夏回族自治區(qū)當(dāng)?shù)氐乃痉N質(zhì)資源（48 份）和引進(jìn)的水稻種質(zhì)資源（37 份，在寧夏回族自治區(qū)已種植超過7 a）。編號(hào)1—85 對(duì)應(yīng)的種質(zhì)分別為寧粳41 號(hào)、有芒大琥板稻、2013-409、SD-4、SD-2、84-275、寧粳29 號(hào)、寧粳40 號(hào)、黑蘭稻、葉盛白皮大稻、小紅板稻、大琥板稻、白皮小稻、寧資218、2013-1120、黑香米、優(yōu)引3 號(hào)、寧粳16 號(hào)、寧粳25 號(hào)、寧粳47 號(hào)、寧稻216、寧香稻1 號(hào)、寧香稻2 號(hào)、花育2 號(hào)、花94、花117、鑒1346、89XW-216、2009XZ-588、2007XZ-181、2012-131、寧大62、寧粳7 號(hào)、寧粳14 號(hào)、寧粳15號(hào)、寧粳27號(hào)、寧粳32號(hào)、寧粳36號(hào)、寧粳37號(hào)、寧粳43 號(hào)、寧粳44 號(hào)、寧香稻3 號(hào)、毛毛稻、寧粳5號(hào)、小糯稻、小琥板稻、寧香優(yōu)2 號(hào)、農(nóng)科843、沈稻121、花119、沈農(nóng)389、節(jié)11、鑒17、京寧2 號(hào)、京寧6號(hào)、京寧7 號(hào)、通親08-4042、優(yōu)育41、寧資460、楊和白皮稻、空育131、龍粳21、龍粳31、龍粳36、春優(yōu)1號(hào)、通98-56、通系929、吉粳108、鹽豐47、香粳2號(hào)、松遼6號(hào)、松遼7號(hào)、秋田小町、富源4號(hào)、地谷、梅谷、圣稻13、圣稻14、圣稻15、圣稻16、圣稻17、圣香稻2572、降糖稻、LDC355、寧粳42號(hào)。

供試菌株為在寧夏回族自治區(qū)水稻種植區(qū)（賀蘭、平羅、青銅峽、中衛(wèi)、銀川）采集的稻瘟病病原菌，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)鑒定后得到具有致病性強(qiáng)且致病率高的稻瘟病菌（寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保實(shí)驗(yàn)室李文強(qiáng)老師饋贈(zèng)）。

供試培養(yǎng)基為PDA 和稻谷粉培養(yǎng)基。PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂40.5 g/L。稻谷粉培養(yǎng)基：磨碎稻谷20 g/L、酵母粉20 g/L、瓊脂15 g/L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 水稻種質(zhì)資源的種植及稻瘟病菌菌株的培養(yǎng) 2019 年4 月將85 份水稻種質(zhì)資源種植在寧夏大學(xué)實(shí)驗(yàn)基地（38.28°N、106.24°E）。每個(gè)材料種2行，每行10 株，株距10 cm，行距26 cm，每隔2 行種1 行誘發(fā)材料楊和白皮稻，四周種植誘發(fā)材料楊和白皮稻。將供試菌株接種在PDA 培養(yǎng)基上，編號(hào)并記錄接種日期，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行24 h光照培養(yǎng)。培養(yǎng)約14 d 使菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，將其轉(zhuǎn)接到稻谷粉培養(yǎng)基上置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行12 h光照、12 h黑暗交替培養(yǎng)，讓其充分產(chǎn)孢。然后配制稻瘟病菌孢子懸浮液：用滅菌水清洗所有培養(yǎng)皿中孢子，經(jīng)3層滅菌紗布過濾，然后將孢子濃度調(diào)整至2×105個(gè)/mL備用，在接種前向懸浮液中加入1～2滴吐溫-20以保證液體的黏附性，注意孢子懸浮液需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性鑒定 采用人工接種和自然誘發(fā)相結(jié)合的方法進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。在分蘗初期和盛期調(diào)查3 次葉瘟，在抽穗期及黃熟期調(diào)查2 次穗頸瘟。葉瘟的調(diào)查：在每個(gè)小區(qū)以發(fā)病最重的10 株的平均發(fā)病等級(jí)作為該品種的抗性級(jí)別；穗頸瘟的調(diào)查：在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)抽查10株，記錄發(fā)病率和病級(jí)。葉瘟和穗頸瘟的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程》[20]。然后按照國(guó)際水稻所（IRRI）稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)供試水稻種質(zhì)資源的稻瘟病抗性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（稻瘟病綜合指數(shù)=葉瘟病級(jí)平均指數(shù)×25%+水稻發(fā)病率群體抗性級(jí)別×25%+穗頸瘟的損失率×50%）[20]。綜合指數(shù)越高，越易感病。具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Classification criteria for comprehensive evaluation of rice blast resistance

1.2.3 水稻種質(zhì)資源Pita和Pib基因的分子檢測(cè)

在分蘗期，每份水稻種質(zhì)資源隨機(jī)選取1株，采集葉片并編號(hào)。采用SDS 法提取葉片總DNA，并用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 的質(zhì)量和濃度，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。Pita和Pib基因SNP 標(biāo)記引物序列參考文獻(xiàn)[21-22]，詳見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系（20μL）:10×Buffer（含Mg2+）2.0μL，2.5 mmol/L dNTP 0.4μL，上、下游引物（2 μmol/L）各1.0 μL，Taq酶0.2 μL，DNA 2.0 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)足20 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃5 min；95 ℃30 s，58.2 ℃30 s，72 ℃1 min，36 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，然后在紫外燈下拍照并記錄結(jié)果。

表2 稻瘟病抗性基因分子標(biāo)記引物序列Tab.2 Primer sequence of molecular markers of rice blast resistance genes

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2019 進(jìn)行處理和制圖，采用DPS軟件進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性鑒定

2.1.1 穗頸瘟和葉瘟抗性鑒定 對(duì)85 份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行穗頸瘟和葉瘟抗性鑒定，發(fā)現(xiàn)85份水稻種質(zhì)資源對(duì)葉瘟和穗頸瘟的抗性存在明顯差異（圖1和表3）。對(duì)葉瘟表現(xiàn)為高抗、抗、中抗、中感、感、高感的水稻種質(zhì)資源分別有28、23、15、11、7、1 份，分別 占 總 數(shù) 的32.94%、27.06%、17.65%、12.94%、8.23%、1.18%?？梢娍谷~瘟的水稻種質(zhì)資源有66份，抗病率為77.65%。對(duì)穗頸瘟表現(xiàn)為高抗、抗、中抗、中感、感、高感的水稻種質(zhì)資源分別有16、1、23、21、13、11 份，分 別 占 總 數(shù) 的18.82%、1.18%、27.06%、24.71%、15.29%、12.94%?？梢娍顾腩i瘟的水稻種質(zhì)資源有40份，抗病率為47.06%。

圖1 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源葉瘟和穗頸瘟抗性鑒定Fig.1 Identification of leaf and neck blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.1.2 稻瘟病綜合抗性評(píng)價(jià) 對(duì)85 份水稻種質(zhì)資源進(jìn)行稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)不同水稻種質(zhì)資源稻瘟病綜合抗性存在明顯差異（表3）。85份水稻種質(zhì)資源中，對(duì)稻瘟病表現(xiàn)為抗、中抗、中感、感、高感的水稻種質(zhì)資源分別有33、23、11、7、11 份，分別占總數(shù)的38.82%、27.06%、12.94%、8.24%、12.94%?？梢姶蟛糠郑?6 份）水稻種質(zhì)資源對(duì)稻瘟病表現(xiàn)為抗（33 份）和中抗（23 份），抗病材料多于感病材料，綜合抗病率為65.88%。

表3 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源葉瘟、穗頸瘟及綜合抗性評(píng)價(jià)Tab.3 Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

續(xù)表3 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源葉瘟、穗頸瘟及綜合抗性評(píng)價(jià)Tab.3（Continued） Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

續(xù)表3 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源葉瘟、穗頸瘟及綜合抗性評(píng)價(jià)Tab.3（Continued） Comprehensive evaluation of rice blast resistance of Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.2 寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源Pita和Pib基因的分子檢測(cè)

圖3 Pib基因在部分寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中的分子檢測(cè)Fig.3 The molecular detection of Pib gene in some Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

利用Pita和Pib基因分子標(biāo)記對(duì)供試水稻種質(zhì)資源進(jìn)行分子檢測(cè)（圖2—3、表4）。結(jié)果表明，85份水稻種質(zhì)資源中有59份含有Pita基因，占總數(shù)的69.41%；有26 份不含Pita基因，占總數(shù)的30.59%。85 份水稻種質(zhì)資源中也有59 份含有Pib基因，占總數(shù)的69.41%。85 份水稻種質(zhì)資源中有42 份同時(shí)含有Pita和Pib基因，占總數(shù)的49.41%；有34 份含有其中1 個(gè)基因，占總數(shù)的40.00%，其中只含有Pita、Pib基因的各有17 份；有9 份既不含有Pita基因 也不含有Pib基因，占總數(shù)的10.59%。

圖2 Pita基因在部分寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中的分子檢測(cè)Fig.2 The molecular detection of Pita gene in some Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

表4 Pita和Pib在寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中的分布Tab.4 Distribution of Pita and Pib genes in Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

續(xù)表4 Pita和Pib在寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中的分布Tab.4（Continued） Distribution of Pita and Pib genes in Ningxia Hui Autonomous Region and imported rice germplasm resources

2.3 Pita、Pib基因與穗頸瘟抗性的關(guān)系

結(jié)合水稻種質(zhì)資源的穗頸瘟抗性鑒定結(jié)果和Pita、Pib基因的檢測(cè)情況，發(fā)現(xiàn)基因組合為Pita+/Pib+的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為40.47%，基因組合為Pita+/Pib-的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為70.59%，基因組合為Pita-/Pib+的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為47.06%，而基因組合為Pita-/Pib-的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為33.33%（表5）。可見攜帶Pib、Pita基因的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率高于不攜帶Pita和Pib基因的水稻種質(zhì)資源；另外，只攜帶Pita基因的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率高于只含Pib基因的水稻種質(zhì)資源。對(duì)寧夏水稻種質(zhì)資源穗頸瘟抗性與其攜帶的抗性基因進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)Pib基因與穗頸瘟抗性沒有顯著的相關(guān)性（r=0.453，P＞0.05），Pita基因與穗頸瘟抗性有顯著的相關(guān)性（r=0.481，P＜0.05）。

表5 不同Pita、Pib基因組合的穗頸瘟抗性Tab.5 Neck blast resistance of different combinations of Pita and Pib genes

2.4 Pib、Pita基因與稻瘟病綜合抗性的關(guān)系

由表6 可知，基因組合為Pita+/Pib+的水稻種質(zhì)資源中抗稻瘟病的有29 份，抗病率為69.05%；基因組合為Pita+/Pib-的水稻種質(zhì)資源中抗稻瘟病的有14 份，抗病率高達(dá)82.35%；基因組合為Pita-/Pib+的水稻種質(zhì)資源中抗稻瘟病的有9 份，抗病率為52.94%；基因組合為Pita-/Pib-的水稻種質(zhì)資源中抗稻瘟病的有4 份，抗病率為44.44%。可見只攜帶Pita或Pib基因及同時(shí)攜帶Pita和Pib基因的水稻種質(zhì)資源稻瘟病綜合抗病率均明顯高于不攜帶Pita和Pib基因的水稻種質(zhì)資源，綜合抗病率表現(xiàn)為Pita+/Pib-＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。說 明Pita和Pib基因可以明顯提高稻瘟病抗性，且Pita基因的抗性效果明顯好于Pib基因。

表6 不同Pita、Pib基因組合的稻瘟病綜合抗性Tab.6 Comprehensive resistance of different combinations of Pita and Pib genes to rice blast

3 結(jié)論與討論

利用抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種已有很多報(bào)道，且在水稻抗性育種中已普遍應(yīng)用。王東元等[23]對(duì)遼寧省和天津市兩地栽培的107份粳稻材料進(jìn)行抗稻瘟病特異性檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Pib基因分布較廣泛，分布頻率為50%，而Pita基因分布較少，分布頻率為38%；豈長(zhǎng)燕等［24］對(duì)抗稻瘟病基因Pib、Pita、Pi5、Pi25和Pi54在我國(guó)水稻微核心種質(zhì)中的分布情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Pita和Pib基因的頻率分別為15.69%和7.84%。本研究發(fā)現(xiàn)，85 份寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中攜帶Pita、Pib基因的種質(zhì)均占總數(shù)的69.41%。

陳濤等[25]通過對(duì)618 份粳稻新品系進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，穗 頸 瘟 抗 性 表 現(xiàn) 為Pita+/Pib+＞Pita+/Pib-＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。本研究在明確Pita和Pib基因在水稻種質(zhì)資源分布的前提下，進(jìn)一步從基因組合方向探究其在稻瘟病抗病育種中的利用價(jià)值。對(duì)85 份寧夏回族自治區(qū)及引進(jìn)水稻種質(zhì)資源中的4種不同基因組合和稻瘟病綜合抗病性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)有42份水稻種質(zhì)資源同時(shí)含有Pita和Pib基因，有34 份水稻種質(zhì)資源只含有其中1個(gè)基因，9份水稻種質(zhì)資源既不含有Pita基因也不含有Pib基因?；蚪M合為Pita+/Pib+的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為40.47%，對(duì)稻瘟病的綜合抗病率為69.05%；基因組合為Pita+/Pib-的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為70.59%，對(duì)稻瘟病的綜合抗病率為82.35%；基因組合為Pita-/Pib+的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為47.06%，對(duì)稻瘟病的綜合抗病率為52.94%；基因組合為Pita-/Pib-的水稻種質(zhì)資源對(duì)穗頸瘟的抗病率為33.33%，對(duì)稻瘟病的綜合抗病率為44.44%。不同基因組合對(duì)穗頸瘟的抗性表現(xiàn)為Pita+/Pib-＞Pita-/Pib+＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib-，對(duì)稻瘟病的綜合抗性表現(xiàn)為Pita+/Pib-＞Pita+/Pib+＞Pita-/Pib+＞Pita-/Pib-。表明水稻種質(zhì)資源中只含有Pita或Pib基因?qū)λ腩i瘟的抗病率都較高，而當(dāng)Pita和Pib基因聚合于同一材料時(shí)，穗頸瘟抗病率不升反降，說明Pita與Pib聚合有一定的負(fù)效應(yīng)，這與李耀棟等[26]的研究結(jié)果類似，而與王軍等［16］、陳濤等[25]的研究結(jié)果相反。因此，繼續(xù)深入挖掘與稻瘟病相關(guān)的抗性基因，對(duì)進(jìn)一步提高水稻稻瘟病抗性水平具有重要意義。

孫立亭等[27]利用分子標(biāo)記檢測(cè)703 份江蘇省水稻材料所攜帶的5 個(gè)抗病基因，并分析抗病基因的不同聚合方式與稻瘟病抗性是否存在一定的相關(guān)性，結(jié)果表明，抗稻瘟病基因數(shù)與稻瘟病抗病率呈正相關(guān)。王軍等[28]利用分子標(biāo)記檢測(cè)江蘇省部分水稻品系中的Pita和Pib基因，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因與水稻穗頸瘟的抗病性呈正相關(guān)，同時(shí)攜帶這2 個(gè)基因可以大大提高穗頸瘟的抗病性。本研究發(fā)現(xiàn)，Pib基因與穗頸瘟抗性沒有顯著的相關(guān)性，Pita基因與穗頸瘟抗性有顯著的相關(guān)性，這與王遠(yuǎn)平[18]的研究結(jié)果相同，與王軍等[28]的研究結(jié)果不完全相同。

綜上，Pita基因可以用于寧夏回族自治區(qū)水稻抗穗頸瘟育種，同時(shí)在生產(chǎn)上Pita基因也可以和Pib基因相結(jié)合，用于抗稻瘟病的基因聚合育種。