張濤，周思旋，唐遠江，陶小艷，盧昱希，趙宇，史開志，李婷，楊粵黔

(貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005)

植物內(nèi)生菌是指生活在健康植物組織內(nèi)并不引起明顯病害癥狀的一類菌，包括真菌、細菌、放線菌和卵菌，幾乎在所有植物組織中都存在[1]。在與植物長期共存中內(nèi)生菌會產(chǎn)生與宿主植物類似的生理活性次級代謝產(chǎn)物，在很大程度上豐富了人類藥用寶庫[2]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中，藥用植物內(nèi)生菌不僅可提高宿主自身抗性，還可用來開發(fā)動物飼料或添加劑，或開發(fā)獸藥等[3]。目前，藥用植物內(nèi)生菌的研究主要集中在其次級代謝產(chǎn)物上，對其內(nèi)生菌的分離主要通過體外培養(yǎng)法純化得到，由于部分菌株無法在人工培養(yǎng)基上生長[4，5]，即使使用多種培養(yǎng)基對菌株進行分離，也無法保證寄生于植物體內(nèi)全部的內(nèi)生菌都能被分離出來。高通量測序技術(shù)為全面分析植物組織中微生物多樣性提供了便利，可準確反映植物內(nèi)生微生物的種類組成和比例，已廣泛應用于微生物多樣性及群落分析等研究[6]。

黔中金蕎麥(Fagopyrum dibotrysQian Zhong)是貴州省畜牧獸醫(yī)研究所以貴州黔中地區(qū)野生金蕎麥為原始材料馴化而成的牧草新品種[7]，是一種高蛋白牧草，具有產(chǎn)量高、適口性好、營養(yǎng)價值高等特點[8，9]。同時，也是一種價值高的中草藥，含苷類、萜類以及黃酮類等多種化學成分，具有清熱解毒、活血化瘀、健脾利濕等功效。目前，黔中金蕎麥以藥飼兼用、綠色無污染的優(yōu)質(zhì)飼草資源被廣泛應用在仔豬和肉雞等畜禽飼料中作為減抗替抗飼料添加制品[10，11]。本研究以黔中金蕎麥為研究對象，采用高通量測序技術(shù)對其內(nèi)生菌16S rDNA V3－V4 和ITS1 區(qū)擴增系列進行分析，揭示黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的組成和豐度，為進一步對黔中金蕎麥資源的可持續(xù)利用及其內(nèi)生菌優(yōu)質(zhì)菌株開發(fā)提供可靠菌種來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2021年7月分別采集貴州省黔西市(27°4′0″N，105°49′4 E，海拔1 330 m)、貴州省貴陽市龍洞堡(26°31′49″N，106°47′26″E，海拔1 100 m)、花溪區(qū)麥坪鎮(zhèn)(26°25′49″N， 106°20′26″E，海拔1 100 m)3 個地點的新鮮健康黔中金蕎麥樣本各4 株，所有植株均為整株采挖，采集對應植株根際土壤，迅速帶回實驗室，24 h 內(nèi)進行處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本表面消毒 將不同地區(qū)新鮮健康的黔中金蕎麥沖洗干凈并晾干，根、莖剪成0.5～1.0 cm 的小段，葉片剪成0.5 cm × 0.5 cm 小方塊。組織塊表面消毒:0.1%吐溫表面活化3～5 min，無菌水沖洗3 次；75%乙醇浸泡3 min，無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干表面水分；再用70%乙醇＋3% H2O2混合液消毒，根莖5～7 min，葉1～2 min，無菌水沖洗3 次，無菌濾紙吸干，置于50 mL 無菌離心管中，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因組DNA 提取及PCR 擴增 采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)方法對樣本的基因組DNA 進行提取，利用瓊脂糖凝膠電泳對DNA 進行檢測，取適量于離心管中，無菌水稀釋至1 ng/μL。利用16S rRNA V3－V4 區(qū)引物341F(5′－CCTAYGGGRBGCASCAG－ 3′)、 806R (5′ － GGACTACNNGGGTATCTAAT－3′)對內(nèi)生細菌進行PCR 擴增，反應體系:2×Phusion master mix 15 μL，引物(2 μmol/L)各1.5 μL，DNA 模板10 μL，ddH2O 2 μL；擴增程序:98℃1 min；98℃10 s，50℃30 s，72℃30 s，共30 個循環(huán)；72℃10 min。利用ITS1-1F 區(qū)引物ITS1-1F-F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)、 ITS1-1F-R ( 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)對內(nèi)生真菌進行PCR 擴增。反應體系:5×FastpfuBuffer 4 μL，引物(5 μmol/L)各0.8 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，DNA 聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補加至20 μL；擴增程序:95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共30 個循環(huán)；72℃10 min。采用TruSeq?DNA PCRFree Sample Preparation Kit 構(gòu)建文庫，經(jīng)Qubit 和Q－PCR 定量和文庫檢測合格后，使用NovaSeq 6000 上機測序。高通量測序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。

1.2.3 測序數(shù)據(jù)處理與分析 將測試得到的原始數(shù)據(jù)進行拆分、拼接、過濾及校正后得到優(yōu)化序列。再經(jīng)去除嵌合體序列，得到最終的有效數(shù)據(jù)。

利用UPARSE 對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，默認以97%的一致性將序列聚類成為分類操作單元( operational taxonomic units，OTUs)，選取出現(xiàn)頻率最高的序列作為OTUs 代表序列，采用Mothur 方法與SILVA138 中SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋分析?；贠TUs 聚類結(jié)果，利用Qiime 軟件進行樣本復雜度分析(alpha diversity)，計算Observed species、Chao 1、Shannon、Simpson 及ACE 指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物OTUs分析

經(jīng)Illumina NovaSeq 測序，內(nèi)生細菌按照97%相似性進行聚類注釋得到OTUs 1 675 條；內(nèi)生真菌注釋得到OTUs 2 045 條。各樣品序列統(tǒng)計結(jié)果見表1。莖葉、根及根際土壤間細菌共有OTUs為87 個，特有OTUs 分別為12、38 個和1 213 個；莖葉、根及根際土壤中真菌共有OTUs 為233 個，特有OTUs 分別為358、141 個和812 個(圖1)。

表1 各樣品序列統(tǒng)計

圖1 細菌(左)和真菌(右)OTUs 分布韋恩圖

2.2 Alpha 多樣性分析

由圖2 可知，隨著測序深度的增加，所有樣本OTUs 數(shù)量先增加后逐漸趨于平緩，說明樣本量充足，測序數(shù)據(jù)合理，能夠較好地反映黔中金蕎麥內(nèi)生菌菌群信息。Chao 1 和ACE 指數(shù)用來估計群落中生物豐富度；Simpson 和Shannon 指數(shù)用來描述物種均勻度和多樣性。由表2 可知，黔中金蕎麥莖葉內(nèi)生細菌Chao1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為117.01、130.14、0.37、1.13，均低于根部；而真菌的Chao 1 指數(shù)、ACE 指數(shù)、Simpson 指數(shù)、Shannon 指數(shù)分別為652.71、656.73、0.92、5.30，均高于根部。表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細菌群落豐富度及多樣性低于根部，真菌的豐富度及多樣性則比根部的高。根際土壤微生物的Alpha 多樣性各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部，說明土壤中微生物種類最為復雜、數(shù)量最多。根據(jù)Observed species 指數(shù)直觀觀測到的細菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥根>黔中金蕎麥莖葉，真菌物種數(shù)目為根際土壤>黔中金蕎麥莖葉>黔中金蕎麥根。

圖2 樣本中細菌(左)和真菌(右)稀釋曲線圖

表2 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物的Alpha 多樣性指數(shù)

2.3 內(nèi)生菌群落結(jié)構(gòu)組成

由表3 可知，黔中金蕎麥莖葉和根中內(nèi)生細菌群落在門水平上主要為藍藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，其在莖葉中的相對豐度分別為75.23%、14.07%、5.35%、4.94%，在根中的相對豐度分別為63. 83%、34.01%、0.64%、0.30%。根際土壤中主要有變形菌門、放線菌門和厚壁菌門，相對豐度分別為36.12%、13.52%、1.41%。真菌群落門水平要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，在莖葉中的相對豐度分別為67.45% 和23.07%，在根中的相對豐度分別為35.77%和33.53%，根際土壤中的相對豐度分別為37.10%和14.12%。

表3 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物門水平相對豐度(%)

由表4 可知，在屬水平上，黔中金蕎麥莖葉中內(nèi)生細菌有變形菌門未知屬(unidentified＿Chloroplast)、藍藻菌門未知屬(unidentified＿Mitochondria)、痤瘡丙酸桿菌(Cutibacterium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)，相對豐度均大于3%，其中變形菌門未知屬相對豐度最高，占所有菌屬的75.23%，被鑒定出來的優(yōu)勢屬為痤瘡丙酸桿菌(5.03%)。黔中金蕎麥根中內(nèi)生細菌有變形菌門未知屬(unidentified＿Chloroplast)、藍藻菌門未知屬(unidentified＿Mitochondria)和Ellin6067 屬，相對豐度分別為63.82%、32.48%和3.08%。根際土壤中內(nèi)生細菌主要有赫黃嗜鹽囊菌屬(Haliangium)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Dongia屬、芽單胞菌屬(Gemmatimonas)、Ellin6067 屬、MND1 屬，相對豐度均大于1%，其中赫黃嗜鹽囊菌屬相對豐度最高，占所有菌屬的2.96%。黔中金蕎麥莖葉真菌群落屬水平上主要為枝孢菌屬(Cladosporium)、腥擲抱菌屬(Tilletiopsis)、間座殼屬(Diaporthe)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)，其中枝孢菌屬相對豐度最高，占所有菌屬的16.10%，為莖葉中的優(yōu)勢菌屬。黔中金蕎麥根內(nèi)生真菌群落屬水平上主要有灰球菌屬(Bovista)、斜蓋傘屬(Clitopilus)、織球殼菌(Plectosphaerella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝鼻菌屬(Cladorrhinum)，其中灰球菌屬相對豐度最高，占所有菌屬的17.67%，為根中的優(yōu)勢菌屬。根際土壤真菌群落屬水平主要有鐮孢菌屬(Fusarium)、織球殼菌(Plectosphaerella)、赤霉菌屬(Gibberella)、刺盤孢屬(Colletotrichum)、枝孢菌屬(Cladosporium)、斜蓋傘屬(Clitopilus)，其中鐮孢菌屬相對豐度最高，占所有菌屬的21.09%，為根際土壤中的優(yōu)勢菌屬。

表4 黔中金蕎麥內(nèi)生菌及根際土壤微生物屬水平相對豐度(%)

3 討論與結(jié)論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，高通量測序技術(shù)因其具有免培養(yǎng)、信息量大等優(yōu)點，已廣泛應用于環(huán)境微生物、腸道微生物、植物內(nèi)生菌等微生物多樣性及群落分析研究中[12－14]。高通量測序技術(shù)不僅能獲得植物內(nèi)生菌菌群結(jié)構(gòu)情況，用于分析組織內(nèi)部生態(tài)水平與環(huán)境因子間的關(guān)系，還可篩選得到具有生物防治、發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)良及能進行藥材道地性鑒別的優(yōu)質(zhì)菌株。魏玉潔等[15]通過高通量測序技術(shù)分析新疆產(chǎn)區(qū)葡萄果實、葉片及土壤微生物多樣性，得到包括5 個菌門、237 個真菌菌屬和8 個菌門、314 個細菌菌屬，為葡萄酒相關(guān)微生物多樣性及葡萄種植產(chǎn)區(qū)提供理論支持。靳松等[16]利用Illumina MiSeq 高通量測序技術(shù)從石蟬草組織樣本中分離得到167 個OTUs，歸屬于11 個門、26 個綱、48 個目、82 個科和104 個屬，其中以變形菌門為優(yōu)勢菌群(62.48% ～93.24%)，同時發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細菌與石蟬草的抗炎抗腫瘤等活性有關(guān)。吳媛等[17]利用高通量測序技術(shù)結(jié)合高效液相色譜在朝鮮淫羊藿葉片中分離得到686 種內(nèi)生真菌，歸屬于451 個屬，其中橫斷孢屬、念珠菌屬、線黑粉酵母屬等菌屬與黃酮類化學成分呈正相關(guān)。宋昭昭等[18]從巨菌草分離得到1 株可用于生物防治的內(nèi)生菌菌株JK7－2，并通過Illumina MiSeq 高通量測序分析得到該菌株有349 個與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因，為相關(guān)次級代謝產(chǎn)物的生物合成機制研究提供參考依據(jù)。郭偉強等[19]采用宏基因測序技術(shù)分析得出野生及栽培人參內(nèi)生細菌主要有變形菌門、硬壁菌門及放線菌門，其中類芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬在野生人參和栽培人參內(nèi)生細菌中均為優(yōu)勢種群。

本研究表明黔中金蕎麥莖葉的內(nèi)生細菌群落豐富度及多樣性低于根部，真菌的豐富度及多樣性則比根部高。根際土壤各指數(shù)均高于黔中金蕎麥莖葉和根部，微生物種類最為復雜、數(shù)量最多。可見植物內(nèi)生真菌具有一定的器官組織特異性。從內(nèi)生菌群落組成來看，黔中金蕎麥內(nèi)生細菌在門水平主要為藍藻菌門(Cyanobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)和厚壁菌門(Firmicutes)，真菌門水平上主要包括子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，與其他植物內(nèi)生菌研究結(jié)果[20]一致，說明植物內(nèi)生菌在較大分類級別單元存在相似性；根際土壤細菌、真菌群落均較黔中金蕎麥組織豐富，目前普遍認為植物內(nèi)生菌主要來源于根際土壤，微生物由土壤進入根，隨著蒸騰作用、營養(yǎng)運輸?shù)角o葉。

隨著對藥用植物內(nèi)生菌研究的不斷深入，挖掘與植物生長代謝相關(guān)的益生菌，篩選具有抗菌活性的菌株，可為解決藥用植物資源緊缺、充分利用其藥用資源提供新思路。黔中金蕎麥內(nèi)生細菌和真菌具有一定的多樣性，下一步將對黔中金蕎麥內(nèi)生菌進行分離培養(yǎng)，對可培養(yǎng)菌株進行多樣性分析，篩選具有生物活性的優(yōu)勢菌株，為進一步對黔中金蕎麥內(nèi)生菌的開發(fā)利用和資源保護提供理論依據(jù)。