劉宗正，鄒 明，檀學(xué)進，曹 瑞，肖 娜，宋修瑜，劉迎春

（1.青島市畜牧獸醫(yī)研究所，山東 青島 266100；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；3.青島瑞爾唯特生物技術(shù)有限公司，山東 青島 266114；4.青島派如環(huán)境科技有限公司，山東 青島 266200）

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告要求自2020 年1月1 日起， 退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種，標志著我國養(yǎng)殖業(yè)進入飼料端“無抗、禁抗”的時代，這對飼料品質(zhì)的要求更加嚴格。近年來，飼料中添加菌制劑、酶制劑成為一種流行的趨勢，被認為是替抗的優(yōu)先產(chǎn)品，在動物生產(chǎn)養(yǎng)殖過程中得到了廣泛應(yīng)用［1-2］。

里岔黑豬一般采用傳統(tǒng)的散養(yǎng)模式， 較差的生活環(huán)境導(dǎo)致疾病頻發(fā)［3］。 為解決里岔黑豬健康養(yǎng)殖和飼喂的關(guān)鍵問題， 引入菌酶協(xié)同技術(shù)提高里岔黑豬的健康水平。過往的研究發(fā)現(xiàn)，酶的廣泛應(yīng)用，可以提高動物的飼料消化水平，促進動物腸道健康， 提高動物免疫水平， 提高動物的抗病性，進而提高生產(chǎn)性能［4-5］。 菌酶協(xié)同技術(shù)在使用過程中無毒副作用，成為畜牧業(yè)生態(tài)、綠色發(fā)展的保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的益生菌為購自山東寶來利來生物工程股份有限公司的肽菌素727， 酶制劑為購自建明（中國）科技有限公司的PS 酶；IgM 和IgG 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗設(shè)計

該試驗在青島膠河源農(nóng)產(chǎn)有限公司里岔黑豬養(yǎng)殖基地進行。 選取80 頭28 日齡體重為（6.72±0.12）kg 的健康里岔黑豬斷奶仔豬（公母仔豬各40頭），隨機分為對照組（基礎(chǔ)日糧）、益生菌組（添加1‰的益生菌）、酶制劑組（添加1‰的酶制劑）、菌酶協(xié)同組（添加1‰的益生菌和1‰的酶制劑），每組20 頭。 試驗期為35 d，預(yù)飼期為7 d，正飼期為28 d，對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，其他組飼喂添加益生菌或酶制劑的日糧。 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。 試驗期間保持各組舍內(nèi)溫濕度、采食飲水方式等飼養(yǎng)管理方法一致， 并跟蹤記錄各組里岔黑豬的生長性能和健康情況。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長性能測定

試驗期間記錄各組仔豬的每日投料量和余料量，稱量試驗初末的試驗豬體重，并計算平均日增重（ADG）、平均采食量（ADFI）和料重比（F/G），計算公式如下：平均日增重=（試驗?zāi)┲?試驗初重）/飼養(yǎng)天數(shù)；平均采食量=（每日投料量之和-每日余料量之和）/總頭數(shù)；料重比=總耗料/總增重。

1.3.2 健康狀況測評

試驗期間觀察并記錄試驗豬的健康狀況，對于腹瀉豬只的情況，采用4 級評分法進行判定。 0分為無腹瀉 （正常糞便），1 分為輕度腹瀉 （軟糞便），2 分為中度腹瀉（稀糞便），3 分為重度腹瀉（液體糞便）； 腹瀉指數(shù)=觀察記錄得分之和/總天數(shù)。

1.3.3 血清免疫指標測定

在試驗開始和結(jié)束時分別從各組中隨機選取6 頭健康狀況良好、 體重接近的仔豬進行采血，共采集24 頭，血清保存于-20 ℃低溫冰箱。 按照試劑盒說明書操作流程檢測血清中的IgM 和IgG 含量。

1.3.4 腸道菌群分析

試驗結(jié)束時采集新鮮糞便，每組采集6 頭，共采集24 頭，待豬排便后立即用無菌采樣器接住糞便，用無菌棉棒蘸取中間約5 g 的糞便，無菌取樣袋封存后立即投入液氮凍存。 樣品由派森諾生物科技有限公司進行16S rDNA 高通量測序， 采用Illumina MiSeq 平臺對群落DNA 片段進行雙端（paired-end）測序。 所獲數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析，得到腸道菌群組成及相對豐度數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA）， 并利用Tukey′s法進行多重比較，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌酶協(xié)同對里岔黑豬斷奶仔豬生長性能的影響

由表2 可知，與對照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組初重?zé)o顯著差異（P>0.05），末重有極顯著（P<0.01）差異。 平均日采食量結(jié)果顯示，與對照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）提高。 平均日增重結(jié)果顯示，酶制劑組和菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）高于對照組；益生菌組與對照組無顯著（P>0.05）差異。 料重比結(jié)果顯示，酶制劑組、菌酶協(xié)同組顯著（P<0.05）低于對照組，益生菌組與對照組相比無顯著（P>0.05）差異。 益生菌組、 菌酶協(xié)同組腹瀉指數(shù)極顯著（P<0.01）降低，酶制劑組差異不顯著（P>0.05）。

表2 不同菌酶條件下斷奶仔豬生長性能指標情況

2.2 菌酶協(xié)同對里岔黑豬斷奶仔豬血清免疫指標的影響

由表3 可知， 與對照組相比菌酶協(xié)同組極顯著（P＜0.01）提高了斷奶仔豬血清IgG、IgM 含量；與對照組相比，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組斷奶仔豬血清IgM 含量極顯著（P<0.01）增高。

表3 不同菌酶條件下斷奶仔豬血清免疫指標情況 單位：μg/mL

2.3 菌酶協(xié)同對里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群的影響

2.3.1 斷奶仔豬腸道菌群豐度等級曲線

由圖1 可知， 在不同處理組的斷奶仔豬腸道菌群豐度等級曲線中， 菌酶協(xié)同組的折線長度最長且折線平緩，說明其群落組成的均勻度最高，物種分布最均勻。

圖1 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群豐度等級曲線

2.3.2 菌酶協(xié)同對斷奶仔豬腸道菌群Alpha 多樣性分析

由表4 可知， 各組樣品的測序覆蓋率（coverage）均超過了99%， 可真實反映各組樣品菌群的多樣性情況。 各組樣品經(jīng)Alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，酶制劑組、益生菌組、菌酶協(xié)同組Chao1 指數(shù)顯著（P＜0.05）高于對照組，說明單獨使用酶制劑、菌制劑或者采用菌酶協(xié)同的飼喂方式均可顯著提高里岔黑豬斷奶仔豬的腸道菌群豐度； 但對Ace 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無顯著（P＞0.05）影響。

表4 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群Alpha 多樣性 單位：%

2.3.3 菌酶協(xié)同對斷奶仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響

斷奶仔豬腸道菌群門水平相對豐度大于0.1%的菌群前五位分別是厚壁菌門（Firmicutes）、擬 桿 菌 門 （Bacteroidetes）、 螺 旋 體 門（Spirochaetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria），其中厚壁菌門是相對豐度最大的優(yōu)勢菌門（見圖2）。 由表5 可知，與對照組相比，菌酶協(xié)同組和益生菌組顯著（P＜0.05）提高了斷奶仔豬腸道菌群擬桿菌門相對豐度。

圖2 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群門水平相對豐度

表5 不同菌酶條件下斷奶仔豬腸道菌群門水平相對豐度 單位：%

3 討論

隨著非洲豬瘟疫情肆虐， 養(yǎng)殖企業(yè)越來越重視動物保健，尤其是在飼料中禁止添加抗生素后，益生菌等其他飼料添加劑的使用， 成為了養(yǎng)殖業(yè)替抗方案的共識， 也成為了行業(yè)中研究的熱點與重點［6］。 菌酶協(xié)同技術(shù)在替代抗生素方面效果顯著，促進了生豬養(yǎng)殖的健康發(fā)展。 張茂華等［7］研究發(fā)現(xiàn)，菌酶協(xié)同可有效提高育肥豬的平均日增重，張艷萍等［8］通過在飼糧中添加了益生菌等添加劑，使育肥豬的日增重提高了6.55%、料重比降低3.09%、腹瀉率降低54.39%，與傳統(tǒng)的飼喂方式相比，飼養(yǎng)效率進一步提高。菌酶協(xié)同不僅應(yīng)用于生豬養(yǎng)殖，孔令勇等［9］在櫻桃谷鴨的飼養(yǎng)中應(yīng)用，結(jié)果顯示櫻桃谷鴨日增重得到提高， 料重比和淘汰率明顯降低。在斷奶仔豬的應(yīng)用中，陳文輝等［10］研究結(jié)果證實，菌酶協(xié)同可顯著提高平均日增重，并降低單位增重飼料消耗量。 在研究菌酶協(xié)同應(yīng)用于提高飼料利用效率的同時， 許多研究也集中在其對畜禽生長性能的影響。羅佳捷等［11］研究表明，菌酶協(xié)同在改善肥育豬生長性能方面與抗生素作用接近。 該試驗結(jié)果表明，與對照組相比，菌酶協(xié)同提高了平均日增重， 降低了料重比和腹瀉率，表明菌酶協(xié)同飼喂里岔黑豬斷奶仔豬，使其生長性能和健康狀況得到改善；并且酶制劑的應(yīng)用可提高飼料消化率，而益生菌的應(yīng)用則可以在腸道內(nèi)促進腸絨毛的健康，進一步提高飼料養(yǎng)分吸收、保持腸道菌群穩(wěn)定， 改善仔豬的生長性能及健康狀況。

血清免疫球蛋白IgM 和IgG 水平是反映動物機體免疫能力的重要指標， 當細菌或病毒入侵機體的時候，免疫球蛋白起到防御作用，是動物機體重要的免疫組成部分。研究表明，小分子肽進入機體后通過刺激機體分泌特異性酶， 從而引起免疫應(yīng)答， 使動物血清中的免疫球蛋白含量維持在較高水平，從而增強機體的免疫水平［12-13］。Xu 等［14］通過飼喂抗菌肽研究其對健康仔豬和攻毒仔豬的影響， 結(jié)果表明抗菌肽顯著提高了斷奶仔豬的生長性能和機體免疫力， 血清中IgM 和IgG 含量明顯高于對照組。 Ma 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，酶解豆粕應(yīng)用于生豬飼喂試驗中，血清IgM 和IgA 含量明顯提高，具有免疫力水平的作用。 該試驗飼料中添加肽菌素及消化酶制劑可能產(chǎn)生較多肽類物質(zhì)， 使里岔黑豬斷奶仔豬的機體免疫水平得到提高。

腸道健康是影響動物整體健康及生長性能的重要因素， 而腸道菌群的狀況直接反映了動物腸道健康情況［16］。 該研究通過對里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群進行高通量測序， 分析了里岔黑豬斷奶仔豬腸道菌群變化情況， 結(jié)果表明菌酶協(xié)同使用可顯著提高斷奶仔豬腸道菌群的相對豐富度。 通過豐度等級曲線可知，菌酶協(xié)同組折線平緩，群落組成的均勻度越高，物種分布最均勻。單獨使用酶制劑、 菌制劑或者采用菌酶協(xié)同的飼喂方式均可顯著提高里岔黑豬斷奶仔豬的腸道菌群相對豐度， 厚壁菌門 （Firmicutes） 和擬桿菌門（Bacteroidetes） 為腸道菌群中的優(yōu)勢菌。 與對照組相比， 益生菌組和菌酶協(xié)同組的擬桿菌門（Bacteroidetes）含量顯著增加，厚壁菌門與擬桿菌門共同維持著腸道菌群的平衡， 當斷奶仔豬開始攝入飼料后，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，從而導(dǎo)致了擬桿菌門的增多， 而擬桿菌門則與飼料營養(yǎng)代謝有直接關(guān)系；螺旋體門（Spirochaetes）在腸道菌群中含量排在第3 位，而螺旋體門與豬拉痢密切相關(guān)，在該研究中采用益生菌和菌酶協(xié)同處理的里岔黑豬腸道螺旋體門數(shù)量顯著降低， 對里岔黑豬腸道健康起到了積極作用， 但螺旋體門的出現(xiàn)說明里岔黑豬飼養(yǎng)環(huán)境有待提高， 應(yīng)進一步做好里岔黑豬的驅(qū)蟲等工作。在前十名的腸道菌群中，藍細菌門（Cyanobacteria） 的出現(xiàn)可能與采用井水飲水時會出現(xiàn)藍細菌有關(guān)， 而藍細菌過多則會出現(xiàn)里岔黑豬胃腸道出血等問題。綜上所述，菌酶協(xié)同能夠提高斷奶仔豬腸道菌群多樣性， 從而增強腸道屏障體系防御能力，保護仔豬斷奶時的腸道健康，提高斷奶仔豬血清免疫指標。

4 結(jié)論

菌酶協(xié)同飼喂模式可以提高里岔黑豬斷奶仔豬平均日采食量和平均日增重，降低腹瀉指數(shù)，具有提高斷奶仔豬免疫力， 改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。