姚華寧，延 文，賈 珉，陳 超

肺癌是最常見的惡性腫瘤，5年生存率僅為10%～15%[1-3]。肺腺癌具有高度侵襲性，病死率高，預(yù)后差，缺乏有效的預(yù)后標(biāo)志物[4]。因此，探究新的生物學(xué)標(biāo)志物對肺腺癌的治療及預(yù)后意義重大。乳脂球表皮生長因子-8(milk fat globule epidermal growth factor-8, MFG-E8)是一種由巨噬細(xì)胞分泌的糖蛋白。MFG-E8已被證實(shí)是清除凋亡細(xì)胞的重要因子，也是免疫系統(tǒng)中的重要因子[5-7]。近年，有研究表明MFG-E8在多種疾病中發(fā)揮特殊作用。目前，MFG-E8在肺腺癌中的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測MFG-E8蛋白在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)和定位，分析MFG-E8表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為肺腺癌的診斷與治療提供新線索。

1 材料與方法

1.1 臨床資料90例肺腺癌標(biāo)本來自上海芯超生物科技公司組織標(biāo)本庫。其中88例肺腺癌患者獲得隨訪，時(shí)間1～121個(gè)月，68例因癌癥相關(guān)死亡；5年生存率為75.6%。2例失訪，隨訪率為97.8%。

1.2 方法收集腫瘤及癌旁正常肺組織的手術(shù)切除標(biāo)本，與上海國家生物芯片工程中心聯(lián)合制作組織微陣列(TMA)切片，4 μm厚切片，采用免疫組化EnVision兩步法染色。一抗MFG-E8(稀釋比1 ∶50)購自Santa Cruz公司。二抗購自Dako公司。以PBS代替一抗作為陰性對照。具體染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判斷由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立評估組織芯片免疫組化染色結(jié)果。MFG-E8的判讀標(biāo)準(zhǔn)：每張切片均在高倍鏡下(400×)隨機(jī)選取10個(gè)視野，讀取平均細(xì)胞數(shù)。(1)按腫瘤陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分：陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。(2)按陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將上述兩項(xiàng)評分結(jié)果相乘：0～4分為陰性，5～12分為陽性[8]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，生存曲線繪制采用Kaplan-Meier法。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌及癌旁組織中MFG-E8的表達(dá)MFG-E8表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜(圖1)。MFG-E8在癌旁組織和肺腺癌組織中的陽性率分別為14.44%(13/90)、94.44%(85/90)。MFG-E8在肺腺癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常肺組織(P<0.001)。

圖1 MFG-E8的表達(dá)：A.MFG-E8在肺腺癌癌旁組織中呈陰性；B.MFG-E8在肺腺癌組織中呈弱陽性；C.MFG-E8在肺腺癌組織中呈強(qiáng)陽性，EnVision兩步法

2.2 MFG-E8表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計(jì)分析顯示，MFG-E8表達(dá)與患者性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期無關(guān)，與腫瘤大小呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。

表1 MFG-E8表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 MFG-E8表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系將90例肺腺癌患者癌組織和癌旁組織的MFG-E8表達(dá)進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示：MFG-E8高表達(dá)組肺腺癌患者的生存率明顯低于低表達(dá)組患者(P<0.001)。MFG-E8表達(dá)與肺腺癌患者生存率呈負(fù)相關(guān)(圖2)。

圖2 MFG-E8表達(dá)與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

MFG-E8又稱乳凝集素，通過橋接凋亡細(xì)胞和吞噬細(xì)胞，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的吞噬，在介導(dǎo)穩(wěn)態(tài)維持、免疫耐受和增強(qiáng)血管生成中發(fā)揮重要作用[9-10]。MFG-E8由2個(gè)重復(fù)的表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域(EGF樣結(jié)構(gòu)域)、2個(gè)重復(fù)的盤素樣結(jié)構(gòu)域(C結(jié)構(gòu)域)和1個(gè)蛋白樣結(jié)構(gòu)域組成。在EGF樣結(jié)構(gòu)域，有一個(gè)整合素結(jié)合基序(integrin-binding motif)，促進(jìn)αvβ3和αvβ5整合素異二聚體的細(xì)胞黏附，并導(dǎo)致整合素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]。研究表明，該蛋白具有多種功能。在腫瘤微環(huán)境中MFG-E8通過協(xié)調(diào)αvβ3信號通路，促進(jìn)黑色素瘤進(jìn)展[11]。MFG-E8在結(jié)直腸癌[12]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[13]、肝細(xì)胞癌[14]、乳腺癌[15-16]中的表達(dá)明顯上調(diào)。MFG-E8基因缺失可預(yù)防小鼠缺氧引起的肺動脈高壓[17]，但是MFG-E8在肺腺癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。

此前有研究報(bào)道，MFG-E8促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤進(jìn)展[13]。Jia等[12]也證實(shí)MFG-E8在人類結(jié)直腸癌中表達(dá)的高水平調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌組織中MFG-E8蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常肺組織，提示MFG-E8高表達(dá)可能促進(jìn)正常肺泡上皮細(xì)胞向肺腺癌的惡性轉(zhuǎn)化，在此過程中發(fā)揮癌基因作用。其機(jī)制可能為癌癥干細(xì)胞能特異性刺激腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞表達(dá)MFG-E8，MFG-E8通過STAT3和Hedgehog信號通路誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞向腫瘤轉(zhuǎn)化以及對抗腫瘤藥物的抵抗。本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)MFG-E8高表達(dá)與腫瘤大小明顯相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期無關(guān)，提示MFG-E8促使腫瘤進(jìn)展。MFG-E8是血管內(nèi)皮生長因子誘導(dǎo)的血管生成的關(guān)鍵，其表達(dá)上調(diào)也可以促進(jìn)腫瘤血管的生長[9-10]，從而促成腫瘤進(jìn)展。有報(bào)道稱MFG-E8蛋白高表達(dá)是黑色素瘤[11]的獨(dú)立不良預(yù)后因素。然而，MFG-E8在肺腺癌中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系至今尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌組織中MFG-E8的表達(dá)明顯高于癌旁組織，MFG-E8高表達(dá)組肺腺癌患者的生存率明顯低于低表達(dá)組患者(P<0.001)，提示MFG-E8可能是肺腺癌的不良預(yù)后潛在標(biāo)志物。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MFG-E8在肺腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤大小和不良預(yù)后相關(guān)，提示MFG-E8可能促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生，是一種新的肺腺癌預(yù)后標(biāo)志物。