劉艷玲，劉 靜，童明瓊，范 娜，王曉玥，孫 婉

(德州學院 醫(yī)藥與護理學院，山東 德州 253023)

慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)是一種典型的具有進行性、不可逆的氣流限制和反復呼吸道癥狀的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，致殘率和病死率很高，全球40歲以上發(fā)病率已高達9-10%[1-2]。COPD并非單一疾病，它不僅損傷肺組織，同時還會損傷包括心臟、骨骼、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的肺外器官和組織，COPD目前已成為全球第三大死因[3-4]。

COPD患者肺部的慢性炎癥反應可導致肺實質(zhì)組織受損，并破壞正常的修復功能和防御機制，導致小氣道纖維化，最終產(chǎn)生氣體陷閉和進行性氣流受限，成為導致氣道阻力增加的主要因素[5-6]。由此可見，COPD與小氣道病變息息相關，盡早干預輕中度COPD患者的小氣道病變，對于延緩病程具有重要意義。研究表明，被診斷為肺癌的患者中40%-70%患有COPD[7]，而COPD患者的肺癌發(fā)病率為16.7‰，且最長見的病理類型是肺鱗狀細胞癌(Lung Squamous Cell Carcinoma，LUSC)[8]。對于吸煙者來說，COPD患者患肺癌的幾率是非COPD患者的4～6倍[9]，并且輕中度COPD患者患肺癌的幾率較重度COPD更高，這可能與輕中度COPD患者存在炎癥和氧化應激增高有關[10]。目前，COPD與肺癌共存機制尚不清楚，如果能夠探尋COPD合并肺癌的預測因子，研究兩者共同的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，可為COPD的預防、治療和肺癌的早期診斷、降低死亡率提供理論依據(jù)。

目前，關于COPD的生物信息學研究還較少，王小樂等通過對COPD患者肺泡巨噬細胞的芯片數(shù)據(jù)集進行生物信息學分析，共獲得43個差異表達基因，且與免疫和炎癥的發(fā)生和發(fā)展有關[11]。谷雨等對COPD 患者肺組織的芯片數(shù)據(jù)進行了生物信息學分析，找到了FGG, FGA, IL-6, SERPINE1和SPP1 5個Hub基因，根據(jù)調(diào)控途徑的進一步分析發(fā)現(xiàn)差異基因表達可能與代謝及細胞生物功能異常有關[12]。

本研究采用生物信息學方法，從GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫中篩選3個COPD芯片數(shù)據(jù)集，挖掘COPD患者小氣道上皮細胞(Small airway epithelium，SAEC)的差異表達基因(Differentially Expressed Genes，DEGs)以及潛在的生物標記物，并通過基因本體(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析預測DEGs的功能及參與的代謝途徑。通過對DEGs進行COPD的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡互作分析，構建PPI(Protein-Protein Interaction)網(wǎng)絡，并使用Cytoscape軟件中的CytoHubba和MCODE篩選子模塊和Hub基因。最后將10個Hub基因通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫驗證其在LUSC樣本中的差異表達情況及差異基因間的相關性，為確定COPD 的分子標記物及COPD與LUSC共存的DEGs奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

使用“COPD”作為關鍵詞，在GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中搜索并選擇了3個芯片數(shù)據(jù)集：GSE11784、GSE11906和GSE20257，均來自于GPL570平臺(Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array，Affymetrix，Inc)。由于芯片數(shù)據(jù)都出自威爾·康奈爾醫(yī)學院遺傳醫(yī)學系實驗室，其中的部分樣本在不同芯片間存在重復，去除重復樣本后，最終GSE11784納入53例正常對照和14例COPD患者，GSE11906納入46例正常對照和15例COPD患者，GSE20257納入22例正常對照和9例COPD患者(見表1)，3個芯片共納入159例樣本，其中包含121例正常對照和38例COPD患者。

表1 GEO數(shù)據(jù)庫COPD芯片數(shù)據(jù)集Table 1 COPD microarray datasets from GEO database

1.2 方法

1.2.1 微陣列數(shù)據(jù)處理

分別對3個數(shù)據(jù)集探針的矩陣文件取log2，然后使用Perl 5.0軟件(http://www.perl.org)對數(shù)據(jù)進行注釋、合并，再通過R軟件(4.0.3版本)的sva和limma包對合并后的數(shù)據(jù)進行批次校正。

1.2.2 DEGs分析

使用R軟件中的Limma包對正常樣本和COPD樣本進行比較，在校正后的P值(AdjP)<0.05的條件下鑒定DEGs。

1.2.3 Go和KEGG 富集分析

使用R軟件中的ClusterProfiter和org.Hs.eg.db包進行GO和KEGG富集分析，以P<0.05定義差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2.4 PPI網(wǎng)絡分析

使用在線網(wǎng)站STRING(http://string-db.org)分析DEGs的相互作用關系，選擇最小交互作用得分>0.4的蛋白質(zhì)對構建PPI網(wǎng)絡。然后分別使用Cytoscape中的MCODE(degreecut≥2，nodescorecut≥0.2，K-core≥2，maxdepth=100)和CytoHubba插件篩選重要的子模塊和Hub基因。

1.2.5 Hub基因在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的顯著性驗證

使用在線網(wǎng)站GEPIA(Gene Expression Profiling Interactive Analysis) (http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)，選擇TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的LUSC樣本(486例)和正常樣本(338例)對Hub基因進行差異性驗證(|Log2FC|>2，p-value<0.05，JitterSize=0.4)。

1.2.6 Hub基因的相關性分析

使用在線網(wǎng)站GEPIA網(wǎng)站，選擇TCGA數(shù)據(jù)庫中的LUSC樣本(486例)和正常樣本(50例)對Hub基因進行差異分析。

2 結果與分析

2.1 COPD患者的DEGs

通過對GSE11784、GSE11906和GSE20257進行RNA水平上正常樣本和COPD樣本分析，共獲得76個 DEGs ，包括 52個上調(diào)基因和24個下調(diào)基因(見表2)，DEGs的火山圖和熱圖(見圖1和圖2)。

圖1 DEGs的火山圖Fig.1 Volcano plot for DEGs注：圖中紅點代表顯著上調(diào)基因，綠點代表顯著下調(diào)基因，黑點代表非顯著表達基因，所有差異表達基因符合矯正后p值<0.05.

圖2 COPD和正常樣本DEGs熱圖Fig.2 Heat map for DEGs between COPD and normal samples注：圖中從紅色到綠色，基因表達水平逐漸下降，所有差異表達基因符合矯正后p值<0.05；N代表正常樣本，T代表腫瘤樣本.

表2 三個GEO數(shù)據(jù)集中的76個DEGsTable 2 A total of 76 DEGs in three GEO datasets

2.2 GO富集分析

通過R軟件的ClusterProfiter和org.Hs.eg.db包進行DEGs的GO 富集分析(見表3)，DEGs主要富集在受體-配體活性、信號受體激活劑活性、四吡咯結合、內(nèi)肽酶活性、血紅素結合和G蛋白偶聯(lián)受體結合等功能上。

表3 COPD差異表達基因的GO富集分析Table 3 GO enrichment analysis of DEGs in COPD samples

2.3 KEGG代謝通路分析

通過R軟件的ClusterProfiter包進行DEGs的KEGG代謝通路分析,結果(見如圖3和表4)，DEGs主要富集在細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝、化學致癌、花生四烯酸代謝和甲狀腺激素合成4條代謝途徑中。

表4 COPD差異表達基因的KEGG代謝通路富集分析Table 4 KEGG pathway analysis of DEGs in COPD samples

圖3 COPD差異表達基因的KEGG代謝通路富集分析Fig.3 KEGG enrichment analysis of DEGs in COPD注：X軸代表差異基因中與該通路相關的基因數(shù)與整個差異基因總數(shù)的比值，Y軸代表KEGG富集通路.

2.4 COPD差異表達基因蛋白質(zhì)網(wǎng)絡互作分析

使用在線網(wǎng)站STRING (http://string-db.org) 對52個上調(diào)基因和24個下調(diào)基因進行COPD的蛋白質(zhì)互作分析，構建PPI網(wǎng)絡(見圖4)，每個基因代表一個節(jié)點，每2個蛋白質(zhì)之間的連線代表一個關系對，總共有36個節(jié)點和51個關系對。

圖4 COPD差異基因的PPI網(wǎng)絡Fig.4 PPI network of DEGs in COPD samples注：圖中圓圈代表基因，連線代表基因間蛋白質(zhì)的相互作用.

使用Cytoscape軟件中的MCODE從PPI網(wǎng)絡中篩選得到2個功能模塊(見圖5)，進一步使用CytoHubba來確定Hub基因(見圖6)，評分前十位的基因分別是SPP1、EGF、CCL2、ALDH3A1、BMP4、SPRR3、KRT6A、BPIFB2、CYP1A1和SPRR1B，且都屬于上調(diào)基因。與圖5比較發(fā)現(xiàn)，這10個基因有7個存在于兩個功能模塊中，因此將這10個基因作為Hub基因做進一步分析對于COPD患病機理及分子

圖5 用MCODE插件從PPI網(wǎng)絡中篩選獲得兩個關鍵功能模塊(A和B)Fig.5 PPI network of two key modules obtained by MCODE in cytoscape(A and B)

圖6 通過PPI網(wǎng)絡篩選10個Hub基因Fig.6 Ten hub genes screened by PPI network注：圖中顏色越深，基因評分越高.

機制具有一定的研究意義。

2.5 Hub基因在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中的差異性驗證

TCGA (The Cancer Genome Atlas)是一個涵蓋33種癌癥及對應正常樣本的數(shù)據(jù)庫，GTEx (Genotype Tissue Expression)數(shù)據(jù)庫僅包含正常人的樣本，通常與TCGA數(shù)據(jù)庫結合使用，以彌補TCGA正常樣本的不足。本研究中，為探尋COPD與LUSC共同的生物標記物，將GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的COPD的10個Hub基因在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫的LUSC樣本中進行差異性驗證?；騍PP1、ALDH3A1、SPRR3、KRT6A和SPRR1B均具有顯著性差異(見圖7)，表明這5個基因是COPD和LUSC共同的DEGs。進一步分析發(fā)現(xiàn)，SPP1和ALDH3A1、SPRR3和KRT6A呈顯著正相關(見圖8)，其它基因間無顯著性關系。

圖7 Hub基因SPP1(a)、ALDH3A1(b)、SPRR3(c)、KRT6A(d)、SPRR1B(e)在TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫中LUSC樣本中的差異性驗證Fig.7 Significance verification of SPP1(a), ALDH3A1(b), SPRR3(c), KRT6A(d), and SPRR1B(e) in LUSC samples in TCGA and GTEx databases

圖8 Hub基因相關性分析Fig.8 Correlation analysis of hub genes注：A:SPP1和ALDH3A1相關性分析，B:KRT6A和SPRR3相關性分析.

3 討 論

COPD是一種常見的以持續(xù)氣流受限為特征的疾病，氣流受限進行性發(fā)展，與氣道和肺臟對有毒顆?；驓怏w的慢性炎性反應增強有關[13]。小氣道管腔狹窄，空氣阻力將成倍增加，周圍氣道阻力增高是小氣道病變的重要病理生理學特征，故當小氣道有炎癥或痰液阻塞，很容易造成閉合、萎陷，COPD病變也多從小氣道開始[14]。

本研究以小氣道上皮細胞為研究對象，篩選3個COPD的GEO芯片數(shù)據(jù)集進行生物信息學分析，獲得了52個上調(diào)基因和24個下調(diào)基因。GO分析發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在受體-配體活性、信號受體激活劑活性、四吡咯結合、內(nèi)肽酶活性、血紅素結合和G蛋白偶聯(lián)受體結合等功能上，KEGG代謝通路主要集中在細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝、化學致癌、花生四烯酸代謝和甲狀腺激素合成4條途徑上。進一步分析發(fā)現(xiàn)參與GO和KEGG代謝通路的DEGs均為上調(diào)基因，這些功能和代謝通路均與COPD發(fā)病機理有密切關系。程序性細胞死亡受體1(PD-1)通過與其配體PD-L1結合，負調(diào)控T淋巴細胞活化及效應功能，參與免疫耐受的維持，從而促進了COPD的發(fā)生和發(fā)展過程[15]。乙酰膽堿受體M3是引起氣道平滑肌收縮的主要受體，激活后發(fā)生構象改變，并進一步激活磷脂酶C，催化二磷酸磷脂酰肌醇水解為三磷酸肌醇，促進鈣離子通道開放，引起氣道平滑肌收縮，氣流阻力增大[16]?；ㄉ南┧崾窃谘仔苑磻杏杉毎ち字诹字窤2催化下產(chǎn)生的，并經(jīng)過酶促反應生成多種代謝物，它們可以通過多種途徑刺激呼吸道中的傷害性感受器，導致炎性細胞聚集而發(fā)生局部效應[17]。由此可見篩選得到的差異表達基因在COPD的發(fā)病機制中占有重要地位，可為后續(xù)研究奠定良好的基礎。

進一步取交互作用得分>0.4的蛋白質(zhì)構建PPI網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)共有36個基因參與到網(wǎng)絡構建中，為獲得關鍵基因，使用Cytoscape軟件中的MCODE和CytoHubba插件對PPI網(wǎng)絡圖進行分析，分別獲得了兩個重要的子模塊和10個Hub基因，比較發(fā)現(xiàn)有7個Hub基因位于子模塊中，其中ALDH3A1和CYP1A1為細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝和化學致癌途徑中的重要基因(見表4)，因此可初步認為篩選得到的Hub基因對于進一步研究COPD患病機理及分子機制具有一定的研究意義。為尋求COPD與LUSC共存的DEGs，將10個Hub基因通過TCGA和GTEx數(shù)據(jù)庫驗證其在LUSC中的差異表達情況，從而確定SPP1、ALDH3A1、SPRR3、KRT6A和SPRR1B為COPD與LUSC共存的DEGs。進一步分析其相關性發(fā)現(xiàn)僅SPP1和ALDH3A1、SPRR3和KRT6A間呈顯著正相關(見圖8)，目前尚未有該基因對間作用機制的相關報道，是否存在共同的調(diào)節(jié)因子還有待進一步研究。

早期研究并沒有發(fā)現(xiàn)SPP1與COPD之間的聯(lián)系[18]，血液分析結果顯示癌癥分期和SPP1表達水平相互矛盾[19]，而最新報道表明SPP1在COPD和肺癌患者中均高表達，并且與肺癌較低的生存率密切相關[20]，這與本研究結果一致，可以初步認為COPD中SPP1的高表達與患肺癌風險增加有關，SPP1可能是一個治療靶點，用于延緩COPD患者肺癌的發(fā)展，提高其生存時間。

ALDH3A1屬于乙醛脫氫酶家族3中的成員A1，在人體的胃、食道和肺中含量較高。通過前列腺腫瘤異種移植的動物實驗發(fā)現(xiàn)ALDH3A1可以促進前列腺腫瘤細胞肺轉移的發(fā)生[21]。ALDH3A1基因表達還與大肝癌早期復發(fā)轉移關系密切，并且該基因表達越高，復發(fā)轉移時間越長[22]。目前關于ALDH3A1對COPD和LUSCD之間的關系還鮮有報道，通過KEGG代謝通路分析我們可以看到ALDH3A1參與了細胞色素P450對外源物質(zhì)的代謝和化學致癌兩個途徑(見表4)。細胞色素P450是人體內(nèi)主要的多環(huán)芳烴代謝酶，參與內(nèi)外源性物質(zhì)的代謝，對于化學致癌物來說，可把無活性的前致癌物激活轉變?yōu)殡娮踊衔铮c DNA或蛋白質(zhì)結合，導致癌變。由于ALDH3A1在COPD和LUSC中均上調(diào)，可以認為高表達的ALDH3A1加速了細胞色素P450對外源物質(zhì)尤其是化學致癌物質(zhì)的代謝，從而促進了COPD和LUSC的發(fā)生和發(fā)展。

SPRRs為一類富含脯氨酸蛋白的基因家族，該家族共有4個成員：SPRR1、SPRR2、SPRR3和SPRR4。它們蛋白產(chǎn)物的中央片段均由串聯(lián)重復的氨基酸(XKXPEPXX(X為任意氨基酸))序列組成：SPRR1、SPRR3和SPRR4為8個，SPRR2為9個。本研究涉及到的Hub基因為SPRR1B和SPRR3。研究表明這兩個基因參與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展。SPRR1B在口腔鱗癌組織中過表達，從而影響細胞增長[23]，它還參與黑色素瘤的轉移[24]，并且是氣道上皮細胞鱗狀細胞分化的早期生物標志物，其表達下調(diào)伴隨細胞的惡性轉化[25]。通過meta和Kaplan-Meier分析，發(fā)現(xiàn)SPRR1B在肺腺癌組織中表達增強，敲除該基因可抑制肺腺癌細胞增殖、遷移和侵襲；此外，通過火山圖發(fā)現(xiàn)肺癌組織中SPRR3的表達水平也明顯增高[26]。同樣，SPRR1B和SPRR3在肺癌H1299細胞系中均過表達[27]。本研究與前人結果一致，SPRR1B和SPRR3在COPD和LUSC中均表達上調(diào)，提示這兩個基因在COPD和LUSC發(fā)生機制的探討中具有潛在的研究價值，建議SPRR家族基因與COPD和肺癌的關系應進一步深入研究。

4 結 論

綜上所述，SPP1、ALDH3A1、SPRR3、KRT6A和SPRR1B可作為COPD 的分子標記物及LUSC的DEGs，尤其是ALDH3A1和SPRR家族基因與COPD和LUSC間的關系及作用機制，有望做進一步深入的研究，為找到COPD和LUSC新的治療靶點提供理論依據(jù)。