王笠成 伍世杰 胡雨婷 曹藝川 程 馨

（成都理工大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，四川 成都 610059）

鈾是現(xiàn)代核工業(yè)過(guò)程中所需要的重要原料，由于其是一種具有化學(xué)毒性和放射性的核素[1]，如果不進(jìn)行治理將引起一系列環(huán)境問(wèn)題[2]，相關(guān)生物也會(huì)受到其放射性照射的危害。鈾在水環(huán)境中的價(jià)態(tài)主要是U（IV）和U（VI），U（VI）溶解性較好，易造成嚴(yán)重的水體污染[3]。

利用微生物對(duì)重金屬污染水體處理具有高效性、高性價(jià)比、低二次影響等優(yōu)點(diǎn)，主要通過(guò)微生物對(duì)水體中鈾的吸附作用，發(fā)生生物還原、礦化等反應(yīng)，改變其物化性質(zhì)，并降低遷移率。該方法關(guān)鍵在于耐性微生物篩選，培養(yǎng)馴化環(huán)境適應(yīng)能力、耐受性、修復(fù)效率高的菌種是微生物處理技術(shù)研究的重點(diǎn)。Chen等[4]選用硫酸鹽還原菌作為處理鈾污染的微生物，研究發(fā)現(xiàn)該種微生物還原鈾時(shí)不僅還原率高的同時(shí)自身生長(zhǎng)會(huì)更好。

因此，該研究選用某鈾水冶廠區(qū)附近的受污染河流為研究對(duì)象，從中篩選、分離出具有高耐受鈾的菌株，并對(duì)其生物學(xué)特性及其分子生物學(xué)鑒定種類進(jìn)行研究，以期望獲得耐性微生物，為微生物在水體鈾污染治理中的研究和應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 篩菌水樣及試劑

篩選耐鈾微生物的水樣來(lái)自宜賓市某鈾水冶廠附近的金沙江河段。在研究區(qū)布置5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)采集兩個(gè)平行樣，放入已經(jīng)滅菌的250mL藍(lán)口玻璃瓶中，同時(shí)放入冰袋保持低溫。帶回實(shí)驗(yàn)室后，放置于冰箱中于4℃保存，并在2d內(nèi)進(jìn)行優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的培養(yǎng)、分離、純化。牛肉膏、蛋白胨、Nacl、瓊脂粉菌均購(gòu)于成都科隆化學(xué)品有限公司；硝酸鈾酰購(gòu)于西安鼎天化工有限公司，純度為分析純及以上。試驗(yàn)用水均為超純水。

1.1.2 培養(yǎng)基配置

NB培養(yǎng)基：按0.3g、1g、0.5g、100mL分別稱取牛肉膏、蛋白胨、Nacl、超純水于250mL錐形瓶中，121℃、0.1MPa下滅菌23min，冷卻后備用。

固體培養(yǎng)基：按0.5g、1g、0.5g、2g、100mL分別稱取牛肉膏、蛋白胨、Nacl、瓊脂粉、超純水于250mL錐形瓶中，121℃、0.1MPa下滅菌23min。稍冷卻后導(dǎo)入平板中待完全凝固，備用。

1.2 耐鈾菌株的篩選及鑒定

1.2.1 耐鈾菌株的篩選

按比例配置150mLNB培養(yǎng)基充分冷卻后加入0.5mL含鈾廢水，置于20℃下150r/min振蕩培養(yǎng)48h。再取0.5mL菌液，加入含60mg/L、70 mg/L、80 mg/L、90mg/L的UO2+的NB培養(yǎng)基中置于20℃下150r/min 振蕩培養(yǎng)48h。利用接種環(huán)蘸取生長(zhǎng)狀況較好、色澤較為單一的菌液，采用平板劃線法進(jìn)行純化培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基上重復(fù)出現(xiàn)單個(gè)菌落為止。

1.2.2 耐鈾菌株的形態(tài)特征觀察及初步鑒定

對(duì)篩選出的耐性菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，觀察菌落表面、邊緣、顏色等生物學(xué)特征。同時(shí)采用革蘭氏染色法對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌進(jìn)行初步鑒定。

1.2.3 耐鈾菌株的分子生物鑒定

該研究采用16S rDNA基因測(cè)序法，委托北京擎科生物科技有限公司成都分公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌特性研究

1.3.1 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定

接種一環(huán)細(xì)菌至150mLNB培養(yǎng)基中，活化18h～24h，再以0.5%（體積比）接種量接種到新鮮的NB培養(yǎng)基中，30℃，150r/min振蕩培養(yǎng)，測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)溶液的OD600值，以時(shí)間為橫軸、OD600值為縱軸繪制細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線。

1.3.2 耐性菌株生長(zhǎng)條件影響試驗(yàn)

pH對(duì)耐性菌株的生長(zhǎng)影響試驗(yàn)：將馴化后的菌株保持接種量一致，接入已經(jīng)滅菌的NB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為5、6、7、8這4個(gè)梯度，在150r/min、30℃下每個(gè)pH進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)度OD600值觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

不同接種量對(duì)耐性菌株的生長(zhǎng)影響試驗(yàn)：將馴化后的菌株接種一環(huán)細(xì)菌至液體培養(yǎng)基中，活化18h～24h，再分別以0.25%、0.5%、1%、2%接種至已滅菌的NB培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)pH一致，在150r/min、30℃下每個(gè)pH進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，分別在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)度OD600值觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)1.3中不同試驗(yàn)中的菌液，如果所測(cè)得結(jié)果過(guò)高，應(yīng)稀釋至0.1～0.9[5]，然后建立相關(guān)稀釋倍數(shù)間的OD600回歸方程。設(shè)菌株培養(yǎng)液不同稀釋倍數(shù)間的OD600值回歸方程為y=ax+b（x為相同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液稀釋后的OD600值，y為相同培養(yǎng)時(shí)間培養(yǎng)液稀釋前的OD600值），通過(guò)解得a、b值后得到不同稀釋倍數(shù)間的OD600值回歸方程。然后將相應(yīng)的OD600值帶入相關(guān)回歸方程后得到同一稀釋倍數(shù)水平上的回歸后所有OD600值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初步鑒定

2.1.1 菌株的形態(tài)學(xué)特征

觀察上述劃線純化得到的菌落的形態(tài)特征如圖1所示，來(lái)進(jìn)行初步鑒定。菌落形狀不規(guī)則，大多成圓形，稍有光澤呈白色，在菌落周圍有白色透明圈。

圖1 劃線純化得到的菌株

鏡檢觀察得出菌體細(xì)胞桿狀，兩端鈍圓，無(wú)莢膜，多呈單個(gè)或鏈狀排列的革蘭氏陽(yáng)性菌[6]，如圖2所示。

圖2 革蘭氏染色鏡檢圖

2.1.2 耐性菌株的基因組電泳圖譜

將對(duì)耐鈾菌株進(jìn)行送樣鑒定后，其基因組電泳圖如圖3所示，可以看出提取的菌株DNA條帶清晰而明亮，說(shuō)明成功提取到耐鈾菌株的DNA，其序列大小在1500bp左右（注：marker從上至下依次為5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）[7]。

圖3 基因組電泳圖

2.1.3 基因序列、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和種屬分析

用ContigExpress拼接測(cè)序結(jié)果，并去除兩端不準(zhǔn)的部分。將拼接好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行比對(duì)。

16S測(cè)序結(jié)果NCBI比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該研究中的耐鈾菌株的16S序列比對(duì)結(jié)果為Bacillus cereus（或同屬），與Bacillus cereus的16S rDNA序列一致性為97%以上。

2.2 菌株生長(zhǎng)影響試驗(yàn)

2.2.1 菌株生長(zhǎng)曲線

通過(guò)分光光度法測(cè)定細(xì)菌不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)液的OD600值，測(cè)得數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線如圖4所示。

表1 菌株不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)液的OD600值

細(xì)菌在適宜的條件下培養(yǎng)經(jīng)歷4個(gè)階段：延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期以及衰亡期。生長(zhǎng)曲線反映了細(xì)菌在培養(yǎng)中所表現(xiàn)出來(lái)的生長(zhǎng)和繁殖的規(guī)律。

由圖4可以看出，0 h～6 h時(shí)間段內(nèi)，OD600值很小且沒(méi)有太大變化，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，屬于延滯期；6 h后開(kāi)始迅速生長(zhǎng)，6h～31h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)細(xì)菌得到豐富的營(yíng)養(yǎng)，細(xì)胞代謝活力最強(qiáng)，合成新細(xì)胞物質(zhì)的速率最快，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛；在31h處進(jìn)入穩(wěn)定期，31h～48h為穩(wěn)定期，此時(shí)溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被大量消耗，細(xì)菌生長(zhǎng)比較穩(wěn)定，但還是有所增長(zhǎng)；48h后OD600值開(kāi)始下降，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。表明此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被耗盡，且積累的有毒的代謝產(chǎn)物抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，死亡率增加。

圖4 細(xì)菌生長(zhǎng)曲線

2.2.2 不同添加量對(duì)菌種影響試驗(yàn)

將不同生長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)液按1.4中方法進(jìn)行試驗(yàn)并處理數(shù)據(jù)[8-9]，其結(jié)果見(jiàn)表2。

將表2中數(shù)據(jù)代入y=ax+b可得培養(yǎng)液相應(yīng)稀釋倍數(shù)間的OD600值回歸方程。由表3可知，隨著菌體生長(zhǎng)時(shí)間的增加，菌體培養(yǎng)液分別被稀釋2倍、5倍、10倍時(shí)，每個(gè)稀釋倍數(shù)由低到高的OD600值回歸方程分別為y=1.8754x-0.3651y=1.0525x+0.4341、y=1.1668x+0.1498。

表2 添加量為0.25%時(shí)菌液不同稀釋倍下OD600值

表3 細(xì)菌不同稀釋倍數(shù)間的OD600值回歸方程

根據(jù)測(cè)定環(huán)境因子對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，將添加量設(shè)置為0.25%、0.5%、1%、2%這4個(gè)梯度，分別對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)并稀釋再測(cè)定OD600。用回歸方程（表3）計(jì)算出同一稀釋倍數(shù)所表現(xiàn)的OD600值，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同添加量下培養(yǎng)液OD600測(cè)定值及回歸值

添加量的大小決定細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的速度，適當(dāng)?shù)募?xì)菌添加量可以縮短細(xì)菌繁殖達(dá)到高峰的時(shí)間，并可減少雜菌生長(zhǎng)的機(jī)會(huì)。如圖5所示，添加量為1%時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)最好、繁殖最快，0.25%時(shí)其次，添加量為0.5%和2%時(shí)差別不大，細(xì)菌能正常生長(zhǎng)但生長(zhǎng)狀況均差于添加量為1%、0.25%的條件。由此可見(jiàn)并不是接種量越大越好，接種量越大，工業(yè)成本越高，同時(shí)隨著細(xì)菌的加入，其代謝產(chǎn)物也越多，對(duì)細(xì)菌的抑制和毒害作用也就越強(qiáng)[10]。

圖5 不同添加量下菌株生長(zhǎng)曲線

2.2.3 不同pH對(duì)菌種影響試驗(yàn)

根據(jù)測(cè)定環(huán)境因子對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)，測(cè)定初始pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響，將pH設(shè)置為5、6、7、8這4個(gè)梯度，分別對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)并測(cè)定OD600。數(shù)據(jù)處理方法與1.4一致，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同pH下培養(yǎng)液的OD600測(cè)定值及回歸值

從圖6中可以看出，pH為5時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，適應(yīng)期延后，整體生長(zhǎng)情況不佳。當(dāng)pH值為3～5時(shí)，U主要以UO22+的形式存在，此時(shí)毒性最強(qiáng)[11]。當(dāng)pH為6時(shí)，前期增長(zhǎng)較快，但從6h就有所下降，生長(zhǎng)情況不穩(wěn)定?？赡苁且?yàn)楫?dāng)pH=6.0時(shí)，鈾主要以UO22+、UO2OH+、（UO2）3（OH）5+兩種陽(yáng)離子形態(tài)存在[12]。當(dāng)pH為7和8時(shí)，細(xì)菌生長(zhǎng)情況良好，當(dāng)pH大于7時(shí)，鈾的化學(xué)形態(tài)主要為碳酸鈾酰配合物，同時(shí)少量的鈾會(huì)形成鈾酰氫氧化物沉淀物質(zhì)。此時(shí)，溶液的毒性降低，減小對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制。

3 結(jié)論

通過(guò)16S rDNA 基因測(cè)序分析鑒定出耐性菌株與已知分類地位的標(biāo)準(zhǔn)菌株Bacillus cereus（ON892078.1）的親緣關(guān)系極近。

根據(jù)對(duì)初始菌種的培養(yǎng)試驗(yàn)，0h～6h為延滯期，細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢；6h～31h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞代謝活力最強(qiáng)，細(xì)菌生長(zhǎng)旺盛；31h～48h為穩(wěn)定期，溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被大量消耗，細(xì)菌生長(zhǎng)比較穩(wěn)定；48h后進(jìn)入衰亡期，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已被耗盡，有毒代謝產(chǎn)物積累，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。

試驗(yàn)中在一定范圍內(nèi)增加菌液添加量可提高細(xì)菌的生長(zhǎng)速度，但接種過(guò)多不僅會(huì)使成本增加，也會(huì)因?yàn)榧?xì)菌的代謝產(chǎn)物增加而對(duì)細(xì)菌的抑制和毒害作用增強(qiáng)。試驗(yàn)得出該優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的最佳接種量為1%。

試驗(yàn)中細(xì)菌在pH為8時(shí)生長(zhǎng)情況最好。pH值不同會(huì)改變鈾在水溶液中的存在形態(tài)，在pH大于7時(shí)鈾的化學(xué)形態(tài)主要為碳酸鈾酰配合物，同時(shí)少量的鈾會(huì)形成鈾酰氫氧化物沉淀物質(zhì)，對(duì)細(xì)菌毒性作用降低。