王琦綜述；蔣敬庭審閱(蘇州大學附屬第三醫(yī)院 腫瘤生物診療中心，江蘇省腫瘤免疫治療工程技術研究中心，蘇州大學細胞治療研究院，江蘇 常州 213003)

免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）及嵌合 抗原受體修飾 T（chimeric antigen receptor T，CAR-T）細胞的基礎及臨床轉化研究是腫瘤研究的熱點之一。ICI治療在多種類型腫瘤中觀察到持續(xù)的應答和顯著的生存優(yōu)勢，但部分患者并未受益[1-2]。CAR-T細胞療法在血液系統(tǒng)腫瘤中取得了顯著療效[3]，但由于在多種實體瘤中的療效欠佳[4]，其臨床應用仍受到一定的阻礙。如何對免疫治療療效進行有效的預測，是亟待解決的問題之一。目前用于預測ICI治療應答的生物標志物主要包括PD-L1的表達、高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性、腫瘤突變負荷、T細胞炎性基因表達譜[5]、腸道微生物群的特定特征[6]等，但在多種類型腫瘤中的預測效果不統(tǒng)一，且整體的預測有效率較低。單細胞測序技術，是在單個細胞水平上對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術。利用單細胞測序技術揭示腫瘤細胞及腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的異質性，對尋找有效的抗腫瘤免疫治療療效預測指標具有重要的價值。本文就近年來單細胞測序獲得的免疫細胞亞群狀態(tài)作為免疫治療療效預測的生物標志物的研究進展進行綜述，旨在為尋找有效的抗腫瘤免疫治療療效預測指標提供新的思路。

1 CD8+T細胞

目前基于單細胞測序技術的研究結果[7]顯示，TME中的免疫細胞具有顯著差異。T細胞在抗腫瘤免疫治療中起重要作用，其中，CD8+T細胞的增殖與ICI治療應答相關。因此，CD8+T細胞在腫瘤監(jiān)測、編輯及控制過程中發(fā)揮重要作用。

1.1 組織浸潤CD8+T細胞

在一項針對接受PD-1單抗帕博利珠單抗（pembrolizumab）或納武單抗（nivolumab）治療晚期黑色素瘤的研究[8]中，發(fā)現(xiàn)40例患者腫瘤組織中高表達PD-1和CTLA-4（PD-1hiCTLA-4hi）的浸潤性CD8+T細胞的比例增加，與治療應答和無進展生存期（PFS）密切相關，并且這部分CD8+T細胞具有耗竭性T細胞的表型。耗竭性腫瘤浸潤性CD8+T細胞的相對豐度預示著對抗PD-1治療的應答，可用于篩選對治療有較高臨床應答的患者。

通過對ICI治療的黑色素瘤患者48個腫瘤組織樣本中的16 291個免疫細胞進行單細胞RNA轉錄組測序（single cell RNA sequencing，scRNA-seq）分析，根據(jù)CD8+T細胞的狀態(tài)分為兩個亞群：高表達與記憶、激活及細胞存活等相關基因（IL-7R、TCF7、REL、FOXP1、FOSL2和STAT4）并且低表達共刺激相關分子的CD8_G亞群，高表達耗竭相關基因（CD38、HAVCR2、ENTPD1、PDCD1、BATF、LAG3、CTLA4和PTPN6）的CD8_B亞群。在對治療有應答的患者中，CD8_G/CD8_B比例＞1。并且發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中TCF7+CD8+T細胞的比例可以預測患者的應答率以及提示更好的預后結果[9]。

對接受抗PD-1治療黑色素瘤患者的研究[10]發(fā)現(xiàn)，利用33例腫瘤組織的scRNA-seq的數(shù)據(jù)分析了CD8+T細胞浸潤程度及促進免疫逃逸的腫瘤細胞的狀態(tài)，設定了一種腫瘤細胞表達的免疫抵抗性程序，該程序與T細胞的排除和免疫逃逸相關。這種免疫抵抗性程序在ICI治療之前就已表達，是原位“冷”TME的一個特征。并且在112例黑色素瘤患者的隊列研究中驗證了在ICI治療前這種免疫抵抗性程序能用來預測患者對抗PD-1治療的臨床療效。

有研究[11]通過結合scRNA-seq及單細胞TCR測序（single cell TCR sequencing，scTCR-seq）技術，追蹤基底細胞癌或鱗狀細胞癌患者抗PD-1治療前后腫瘤組織的TCR克隆及轉錄表型，發(fā)現(xiàn)其克隆性增殖的CD8+CD39+T細胞共表達慢性T細胞活化和耗竭的標志分子。然而，在這種情況下，克隆性增殖的T細胞克隆不是來自預先存在的腫瘤浸潤淋巴細胞，而是來自同一腫瘤中之前未觀察到的新的克隆型。患者對抗PD-1治療的應答依賴于腫瘤招募新的T細胞克隆取代先前存在的耗竭T細胞的內在能力，CD8+CD39+T細胞或許在未來可以成為預測患者免疫治療效果的有效指標。由于腫瘤組織取樣較為困難，如果選擇更容易獲取的外周血樣本，則具有更好的可操作性。

1.2 外周血CD8+T細胞

在一項針對接受帕博利珠單抗治療的Ⅳ期黑色素瘤患者的單細胞測序研究[12]中，通過獲得其治療前后的外周血免疫細胞圖譜，從而確定了外周血循環(huán)耗竭性CD8+T細胞的藥效動力學變化。另外，對ICI治療無應答的患者，不僅僅是由于無法誘導免疫重塑，還與T細胞恢復和腫瘤負荷之間的不平衡相關。通過驗證隊列證實，患者外周血循環(huán)Ki67+PD-1+CD8+T（腫瘤特異性）細胞比例與基線水平處腫瘤負荷的比值越高，提示患者有較好的臨床療效。

在接受抗PD-1治療的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中，也觀察到類似的結果[13]。在免疫治療后，約70%的患者Ki-67+PD-1+CD8+T細胞增加，且這些增殖的CD8+T細胞具有效應樣表型（HLA-DR+、CD38+和 Bcl2lo），表達共刺激分子（CD28、CD27和ICOS），并具有高水平的PD-1和CTLA-4共表達。并且80%對免疫治療應答的患者都出現(xiàn)了PD-1+CD8+T細胞應答，而70%的疾病進展患者存在延遲或缺失的PD-1+CD8+T細胞應答，提示PD-1+CD8+T細胞具有重要的預測意義。

收集接受抗PD-1/PD-L1治療的Ⅲb～Ⅳ期NSCLC患者治療前后的外周血樣本，流式細胞術分離PD-1+CD8+T細胞的TCRβ鏈的CDR3區(qū)進行scTCR-seq。治療前PD-1+CD8+TCR多樣性高的患者具有更好的應答及PFS，治療后PD-1+CD8+TCR克隆性增加的患者具有更長的PFS[14]。因此，外周血PD-1+CD8+T細胞TCR的多樣性和克隆性可作為NSCLC患者對ICI治療應答的重要標志物。

2 CD4+T細胞

抗PD-1治療對經(jīng)典霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin lymphoma，cHL）非常有效，cHL患者的9p24.1染色體上的 CD274（PD-L1）和 PDC1LG2（PD-L2）基因經(jīng)常出現(xiàn)拷貝數(shù)增加。但在cHL這種MHCⅠ陰性的腫瘤中，抗PD-1治療的作用機制仍未明確。通過scTCR-seq檢測CheckMate 205Ⅱ期臨床試驗（NCT02181738）[15]治療的56例抗PD-1治療應答cHL患者對的外周血免疫細胞特征。治療前，TCR受體庫多樣性高的患者及在治療期間有TCR克隆擴增的患者療效最佳。在治療過程中，CD4+T細胞的受體庫多樣性增加，在獲得完全緩解的患者中尤為顯著，說明個體免疫微環(huán)境很大程度上影響ICI治療的療效。

另外，針對接受抗PD-1治療的NSCLC患者[16]，利用scRNA-seq及scTCR-seq技術鑒定了單個外周血T細胞克隆，并監(jiān)測了它們在免疫治療期間的動態(tài)變化。結果發(fā)現(xiàn)，腫瘤相關CD4+T細胞的細胞毒性顯著高于CD8+T細胞，且隨著疾病進展，外周血效應T細胞中的腫瘤相關CD4+T細胞比例迅速降低，提示其具有作為預測標志物的潛力。

在接受抗PD-1/抗CTLA-4治療的黑色素瘤患者[17]中，表達PD-1的CD4+FOXP3-T細胞（4PD-1hi）是一種非傳統(tǒng)型的抑制性T細胞，4PD-1hi在腫瘤內的積累會增加腫瘤負荷?？笴TLA-4治療會引起瘤內和外周血4PD-1hi數(shù)量的增加，并呈劑量依賴性。但抗CTLA-4聯(lián)合抗PD-1治療可以減少這個效應并提高抗腫瘤的活性。4PD-1hi細胞亞群是治療應答的不良預后因素。

目前，依托單細胞技術的CD4+T細胞的免疫治療研究較少，但其在腫瘤免疫中的重要角色會隨著單細胞測序技術的廣泛應用而不斷被挖掘出來，并在預測免疫治療療效方面發(fā)揮不可忽視的作用。

3 B細胞

臨床前研究[18]表明，新輔助ICI治療與輔助治療相比，可提高自發(fā)轉移性乳腺癌小鼠模型的OS率和抗原特異性T細胞應答。在一項新輔助ICI治療（納武單抗vs納武單抗+伊匹單抗）高風險可切除的黑色素瘤的隨機Ⅱ期臨床試驗（NCT02519322）[19]中，聯(lián)合治療的實際有效率高達45%，比單藥的實際有效率25%提高了80%，治療效果得到了大幅度提升，患者OS延長。相對于治療無應答的患者，B細胞信號在對治療有應答的患者中富集。同樣是依托NCT02519322隨機Ⅱ期臨床試驗的一項研究[20]發(fā)現(xiàn)，接受新輔助ICI治療的黑色素瘤的應答者CD20+B細胞和三級淋巴結構（tertiary lymphoid structure，TLS）的密度以及TLS與腫瘤面積的比值均高于無應答者，尤其在治療早期獲得的腫瘤標本中，這樣的現(xiàn)象更為明顯，也說明治療早期腫瘤組織中的免疫細胞浸潤狀態(tài)的預測價值高于治療前的腫瘤組織。應答患者存在顯著的免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈克隆性及B細胞受體（B-cell receptor，BCR）多樣性增加，表明B細胞在抗腫瘤免疫中的活躍性。與T細胞和其他免疫標志物相比，B細胞相關基因（MZB1、JCHAIN和IGLL5）在應答患者中高表達，有望改變B細胞功能的基因標志（FCRL5、IDO1、IFNG和BTLA）在應答患者中富集。在單變量分析中，僅B細胞的信號就能預測患者有無應答，當納入其他免疫細胞浸潤的成分進行多變量分析時，表明B細胞不是單獨發(fā)揮作用，可能與其他免疫細胞亞群協(xié)同作用。

在轉移性黑色素瘤患者臨床樣本中對B細胞抗腫瘤應答的研究[21]發(fā)現(xiàn)，OS率的提高與腫瘤相關CD8+T細胞和CD20+B細胞的同時存在有關，而與其他臨床特征無關。對TLS形成的分子標志物CXCR5、CXCL13及CD20進行免疫熒光染色，顯示TLS在CD8+T細胞和CD20+B細胞同時存在的腫瘤內形成。隨后通過scRNA-seq獲取富含TLS的黑色素瘤的相關基因特征，包括已知的B細胞特異表達基因CD79B，在活化的B細胞中上調表達的基因CCR6，還有其他類型免疫細胞表達的相關基因等，可預測患者在接受ICI治療后的結局。富含B細胞的腫瘤伴有TCF7+幼稚T細胞和/或記憶性T細胞的增加，表明富含B細胞的TLS在黑色素瘤免疫微環(huán)境中發(fā)揮關鍵性作用。

軟組織肉瘤（soft-tissue sarcoma，STS）代表一類包括50多種組織學亞型的腫瘤，不同亞型患者的臨床表現(xiàn)往往不典型，對ICI等療法的應答差異很大。通過對608例STS標本進行基因表達譜分析[22]，根據(jù)TME的不同分為五種肉瘤免疫表型（sarcoma immune classes，SIC）：免疫低（A和B）、免疫高（D和E）以及血管高度形成（C）組。E組的特征是存在豐富的包含T細胞和濾泡DC的TLS及B細胞。SIC和B細胞可以預測STS患者的OS，即使在不同CD8+T細胞及細胞毒性的背景下[表達PDCD1（PD-1）、CD274（PD-L1）或FOXP3]，B細胞仍是最主要的預后因素。

4 髓系細胞

腫瘤浸潤髓系細胞是TME中最主要的抗原提呈細胞，也是腫瘤發(fā)生、發(fā)展及免疫治療過程中的關鍵調節(jié)因子，主要包括巨噬細胞、DC、多形核中性粒細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）和單核細胞。

髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cell，MDSC）是由多種具有抑制功能的細胞構成的群體，主要分為粒細胞樣MDSC（G-MDSC）、單核細胞樣 MDSC（M-MDSC）、多形核 MDSC（PMN-MDSC）等類型，是腫瘤免疫逃逸的關鍵因素。在接受伊匹單抗治療前的黑色素瘤患者外周血中，低水平的M-MDSC預示較長的OS[23]；在接受H3.3K27M特異性腫瘤疫苗治療后的彌漫性中線膠質瘤（diffuse midline glioma，DMG）患者外周血中低水平的MDSC預示較長的OS[24]；在接受抗PD-1治療的NSCLC患者外周血中，較高水平的調節(jié)性T（regulatory T,Treg）細胞和較低水平的PMN-MDSC或M-MDSC預示較長的OS[25]；另外一項研究[26]中，接受抗PD-1治療的NSCLC患者外周血中，無應答患者MDSC的擴增和募集顯著高于應答患者，其中，無應答患者Lox-1+PMNMDSC數(shù)量在抗PD-1治療后增加，說明Lox-1+PMNMDSC可能是NSCLC患者中免疫抑制MDSC，是預測治療無應答的潛在標志物。

通過scRNA-seq在多形膠質母細胞瘤[27]中觀察到了一組獨特的巨噬細胞亞群，表達高水平的CD73，能夠在抗PD-1治療后持續(xù)存在。CD73hi髓系細胞高表達免疫抑制基因以及趨化因子/趨化因子受體基因（CCR5、CCR2、ITGAV/ITGB5和CSF1R）誘導GMB的免疫抑制。高表達CD73hi髓系細胞信號特征的患者比低表達患者具有較短的OS。

此前，已有諸多研究報道血漿IL-8升高與ICI治療的不良結果相關[28]。分析接受抗PD-L1阿特珠單抗（atezolizumab）治療的轉移性尿路上皮癌和轉移性腎細胞癌[29]患者血漿IL-8水平及外周血單個核細胞IL-8基因的表達情況，血漿、外周血單個核細胞、腫瘤組織中高水平的IL-8與療效不佳相關。scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)，無應答患者與應答患者相比，髓系細胞表達更高水平的IL-8，且IL-8的高表達與抗原呈遞機制的下調相關。因此逆轉IL-8介導的髓系炎癥應答，或可改善接受ICI治療的患者預后?；趩渭毎夹g逐漸完善髓系細胞特征圖譜，將獲得更有價值的聯(lián)合治療靶點及預測標志物。

綜上，不同類型的免疫細胞作為免疫治療療效預測標志物的臨床意義見表1。

5 CAR-T細胞

CAR-T細胞療法對血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者有顯著療效，但輸注后CAR-T細胞的命運并不完全清楚。CAR-T細胞被輸入到患者體內后，將暴露在一個動態(tài)的TME中，但TME和不斷變化的腫瘤負荷如何隨輸入時間影響CAR-T細胞的狀態(tài)，還未得到很好的研究。利用TCR測序、整合位點分析和scRNA-seq技術分析輸注制品和輸注后患者血液中的CD8+CAR-T細胞的克隆和基因表達特征[30]。研究對象為Ⅰ期臨床試驗（NCT01865617）中接受CD19-CAR-T細胞治療的復發(fā)難治性急性B淋巴細胞白血?。˙-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）、非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’s lymphoma，NHL）或慢性淋巴細胞性白血?。╟hronic lymphocytic leukemia，CLL）患者。在治療的早、中期，有氧代謝和細胞毒性標志物基因的表達增加。但在治療的后期，隨著腫瘤清除后，靶抗原減少，有氧代謝和細胞毒性標記基因的表達降低，抑制性受體基因的表達增加。通過分析輸注制品和輸注后患者血液中CAR-T細胞的TCR克隆成分，可以追蹤到單個CAR-T細胞的轉錄特征如何影響輸注后的命運，并且輸注制品中CD27+CD8+T比例與CLL患者的臨床療效相關。

B細胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）CAR-T細胞在復發(fā)/難治性多發(fā)性骨髓瘤患者中顯示出良好的療效。在漿細胞白血病中，通過scRNA-seq分析BCMA-4-1BBz CAR-T細胞在輸注前、高峰或緩解期的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)CAR-T細胞在發(fā)育過程中從高度增殖轉變?yōu)楦叨燃毎拘裕⑶褻D19-CAR-T和BCMA-CART細胞具有相似的轉錄特征，尤其是細胞輸注后在體內的高峰期。因此，利用單細胞測序數(shù)據(jù)能解析患者體內CAR-T細胞的增殖及克隆狀態(tài)，并輔助臨床醫(yī)生制定更加合理的治療策略。

推進CAR-T細胞療法進展的一個重要目標是確定臨床療效的預測指標。目前，CAR-T細胞是用患者自身的T細胞產(chǎn)生的“個性化”產(chǎn)品，質量不統(tǒng)一且可變性大。對NHL患者輸注前的CD19-CAR-T細胞產(chǎn)品進行功能及scRNA-seq分析[31]，細胞產(chǎn)品的多功能性由兩個方面來評估：酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測細胞因子的分泌；包括穩(wěn)態(tài)/增殖、炎癥、趨化、調節(jié)和免疫效應5個方面的32個關鍵免疫相關分子的表達情況構成的多功能強度指數(shù)。發(fā)現(xiàn)多功能強度指數(shù)與患者的臨床應答顯著相關。另一項基于CD19-CAR-T細胞應用于復發(fā)/難治性CD19+白血病的Ⅰ期臨床試驗（NCT02028455）的研究[32]發(fā)現(xiàn)，輸注前外周血LAG-3+/TNF-αlowCD8+T細胞頻率增加以及耗竭標志物的表達與初始治療失敗相關。

scRNA-seq分析一組接受CD19-CAR-T細胞治療的大B細胞淋巴瘤患者的輸注制品[33]。在完全應答者中觀察到CD8+中央記憶T細胞的特征，而在部分應答者中觀察到CD8+T細胞功能障礙特征，并富含耗竭和激活標記以及編碼MHCⅡ類蛋白的基因，表達CCR7+CD27+CD8+T細胞的富集與完全應答者相關，揭示了特定T細胞亞群與不同的臨床結果相關。CD19-CAR-T治療引起免疫效應細胞相關神經(jīng)毒性綜合征（immune effector cell-associated neurotoxicity syndrome，ICANS），患者最初出現(xiàn)震顫、書寫困難、輕度表達性失語、失用和注意力受損的這種不良反應與ICANS相關細胞密切相關。因此，在輸注制品中檢測ICANS相關細胞可以預測患者是否處于神經(jīng)毒性的高危狀態(tài)，并使用針對髓系細胞功能的藥物（如IL-1受體拮抗劑）進行預防性治療。此外，通過從應答和無應答白血病患者提取的CAR-T細胞進行scRNA-seq檢測[34]，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中受損的死亡受體信號轉導途徑導致CD19-CAR-T細胞的細胞毒殺傷功能失效并驅動CD19-CAR-T細胞功能障礙，提示了一種與抗原無關的CAR-T細胞治療耐藥的新機制。因此，利用單細胞測序技術識別CAR-T細胞在治療過程中的轉錄組特征，可發(fā)現(xiàn)預測臨床應答的標志物，在個性化免疫治療中發(fā)揮作用。

6 結語

綜上所述，機體的免疫系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，而腫瘤具有異質性，單一和通用的預測標記可能不現(xiàn)實。CD8+T細胞、CD4+T細胞、B細胞和髓系細胞等免疫細胞有望作為免疫治療療效預測標志物之一，但仍需結合其他分子標志物以及臨床預后因素建立一個綜合預測模型，進而可能為合理構建和評估基于抗PD-1和/或PD-L1的組合治療方案提供更為精準的提示。雖然近年來測序成本持續(xù)下降，單細胞技術呈飛躍式發(fā)展，但如果要廣泛應用于腫瘤患者的個體化免疫治療中，仍存在以下缺點：（1）樣本采集有難度，外周血樣本是最容易獲取的，但如果需要更具代表性的腫瘤組織作為樣本，是否能獲取到足夠數(shù)量及質量的細胞，仍然具有不確定因素；（2）工作流程耗時長，因為使用的樣本材料數(shù)量很少，但分析仍然需要足夠的細胞數(shù)量以確保所有細胞類型都能得到標示，且需要創(chuàng)建簡化和優(yōu)化的工作流程以縮短完成測序所需的時間；（3）數(shù)據(jù)分析復雜，很多由學者研發(fā)的分析數(shù)據(jù)軟件大部分都是開源的，但只有小部分既掌握先進生物信息學和統(tǒng)計技能，同時具備生物學系統(tǒng)知識的研究人員才能獲取權威結果，且目前關于如何定義質控標準、去除技術偽像和解釋結果的指導方針有限；（4）費用昂貴，成本較高及所需的大多數(shù)儀器和試劑都很昂貴，導致患者家庭經(jīng)濟壓力較大。相信隨著單細胞多組學研究的不斷深入、基因測序成本的進一步降低，基于單細胞水平的測序、蛋白分析極具發(fā)展?jié)摿?，將為人們認識疾病、理解其免疫機制及新藥物研發(fā)提供新的視角與方案。