李敏,魏春秀，楊武杰，王芳,趙靜

(1.菏澤學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 菏澤 274015; 2.濱州市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì), 山東 濱州256600;3.山東省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,山東 濟(jì)南 250014; 4.山東省聊城市莘縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局, 山東 聊城 252400;5.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所真菌學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101)

觀賞牡丹(PaeoniasuffruticosaAndrews)，屬于芍藥科芍藥屬，為落葉小灌木，是一種具有觀賞性、食用性和藥用性的植物，廣泛應(yīng)用于消炎、降血糖、抗腫瘤等方面的治療.牡丹的栽培歷史悠久，種植地分布廣泛.隨著種植年限增加，地下某些微生物逐年累積，致使牡丹根部腐爛，造成了油用牡丹的大量減產(chǎn)和觀賞牡丹的大面積死亡，牡丹種植業(yè)無(wú)法持續(xù)和延伸[1].牡丹根腐病又稱爛根病，是最嚴(yán)重的土傳病害之一，研究表明在山東菏澤牡丹根腐病的發(fā)病率約20%，嚴(yán)重地塊可達(dá)到40%以上[2].孫文姬[1]、成玉梅[3]等認(rèn)為引起菏澤地區(qū)牡丹根腐病的病原菌主要是茄病鐮刀菌.茄病鐮刀菌屬于瘤座孢科、鐮孢霉屬，營(yíng)寄生或腐生生存，而吳玉柱[4]等則認(rèn)為茄腐皮鐮孢霉是引起牡丹根腐病的病原菌.這些病原菌使牡丹根部腐爛，葉片失綠萎靡，植株生長(zhǎng)緩慢，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致植株枯萎死亡[5]，根腐病導(dǎo)致牡丹種植業(yè)經(jīng)濟(jì)虧損嚴(yán)重，并且影響丹皮的產(chǎn)量及藥用價(jià)值[6].由此可見(jiàn)，影響牡丹根腐病的病原菌可能不止一種，有可能是多種病原菌相互作用的結(jié)果.目前控制牡丹根腐病的主要措施是采用農(nóng)業(yè)和化學(xué)防治[7-8]，但成效甚微.傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)防治雖然低能耗、低污染，但成本高，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且見(jiàn)效慢；化學(xué)防治雖在短時(shí)間內(nèi)經(jīng)濟(jì)有效，但長(zhǎng)期使用易產(chǎn)生抗藥性，造成農(nóng)藥殘留、人畜中毒，影響生態(tài)平衡，使生物多樣性遭到破壞.新蘭[9]在辣椒疫病、李海薇[10]等在棉花枯萎病、王瑤[11]等在禾谷鐮刀菌、Weindling[12]等在大豆炭腐病的防治中均采用生物防治，并取得良好效果，生物防治有利于可持續(xù)發(fā)展.目前生物防治在其他植物根腐病方面有了一定進(jìn)展，張建強(qiáng)[13]等從無(wú)病燕麥根際土壤中分離篩選得到一株對(duì)燕麥鐮孢菌高效拮抗的細(xì)菌，細(xì)菌對(duì)供試病原菌表現(xiàn)出較好的抑菌作用.許樂(lè)[14]等從無(wú)病丹參根際土壤和植株中分離篩選得到一株高效抑制丹參病原菌生長(zhǎng)的菌株，該菌株的粗提物對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑制效果.牡丹的生防菌也有相關(guān)研究，王雪山[15]等從6份牡丹根際土壤樣品中分離得到7株對(duì)牡丹根腐病原菌具有良好拮抗作用的細(xì)菌分離物，其抑菌帶寬度在2～5 mm之間，具有較好的抑菌效果.吳玉柱[8]等從無(wú)病牡丹根際土壤中分離篩選得到6株抑菌效果較好的菌株.孟國(guó)慶[16]等從牡丹根際土壤中分離篩選出2株具有抑制效果的菌株，并鑒定為芽孢桿菌屬，這說(shuō)明生物防治目前在牡丹病菌防治方面是可行的.由于引起牡丹根腐病的病原菌種類(lèi)不一定是一種，本研究針對(duì)曹州牡丹園精品園區(qū)的部分觀賞牡丹爛根進(jìn)行病原菌分離，分離健康牡丹根際土壤和植株內(nèi)的細(xì)菌，通過(guò)平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)[17]，旨在篩選高效抑制牡丹病原菌的生防菌，為探討生防菌抗性機(jī)理，生物農(nóng)藥和生物肥料的研發(fā)提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤和植株

發(fā)病牡丹植株，無(wú)病牡丹植株和牡丹根際土壤由曹州牡丹園提供.

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、PDA、查氏培養(yǎng)基、生理生化培養(yǎng)基等[18-19].

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離、純化與保藏

將從曹州牡丹園取的發(fā)病牡丹植株的根部置于無(wú)菌袋中，帶回微生物實(shí)驗(yàn)室，沖洗表面的泥土和污物，將病根剪成1～2 cm小段或方塊置于0.1%汞溶液中處理15 min，并用無(wú)菌水沖洗3次，再置于75%乙醇溶液中處理30 min，用無(wú)菌水沖洗3次，無(wú)菌條件下接種于PDA平板上，置于26 ℃下培養(yǎng)，第2 d開(kāi)始觀察，待病根上長(zhǎng)出菌絲，對(duì)其進(jìn)行分離、純化，菌落形態(tài)特征、顯微形態(tài)特征，保藏，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用[20].

1.2.2 生防菌的分離、純化與保藏

取無(wú)病牡丹植株及其根際土壤，從無(wú)病植株分離生防菌的方法同病原菌；土壤中微生物的分離步驟如下：25 g根際土壤置于225 mL無(wú)菌生理鹽水中，制成濃度為10-1g/mL的溶液，吸取1 mL置于盛有9 mL生理鹽水的試管內(nèi)，稀釋成10-2g/mL，采用同樣方式稀釋至10-6g/mL，吸取適宜稀釋梯度溶液100 mL涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，次日觀察并及時(shí)挑取細(xì)菌，采用三區(qū)劃線法對(duì)菌落進(jìn)行分離、純化和保藏，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用.

1.2.3 抑菌判斷標(biāo)準(zhǔn)

(1)不抑制：病原菌生長(zhǎng)并覆蓋細(xì)菌.

(2)一般抑制：病原菌生長(zhǎng)遲緩，病原菌與生防菌之間有抑菌圈，且二者之間的距離小于1 cm，不能覆蓋細(xì)菌.

(3)較強(qiáng)抑制：病原菌生長(zhǎng)基本停止，無(wú)法向外延伸，病原菌與生防菌之間有明顯抑菌圈，且二者之間的距離大于1 cm，不能覆蓋細(xì)菌.

1.2.4 生防菌的篩選

采用對(duì)峙實(shí)驗(yàn)篩選生防菌，將活化病原菌接種在查氏平板中，26 ℃下倒置培養(yǎng)2 d，菌落長(zhǎng)到約2 cm時(shí)，將活化的細(xì)菌點(diǎn)接種在病原菌水平和垂直線上距菌落3 cm處的位置，26 ℃下倒置培養(yǎng)觀察，根據(jù)抑菌的標(biāo)準(zhǔn)判斷抑菌能力大小.

1.2.5 提取液的制備與抑菌篩選

將篩選的生防菌活化，制成1012個(gè)/mL的菌懸液，在無(wú)菌條件下吸取1 mL，接種在裝有150 mL LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在37 ℃，轉(zhuǎn)速為300 r/min的條件下培養(yǎng)24 h，制成發(fā)酵提取液.將6 mol/L HCl加入發(fā)酵液中，調(diào)節(jié)pH至2.0，在4 ℃條件下靜置過(guò)夜，10 000 r/min離心20 min，除去上清液，加入3 mL pH為7.2的甲醇攪勻，在4 ℃條件下靜置8 h，在10 000 r/min離心10 min，取其上清液轉(zhuǎn)移到新的無(wú)菌離心管中，即為胞外粗提物，用0.22 μm的濾膜過(guò)濾除菌，無(wú)菌條件下吸取100 μL粗提取物置于無(wú)菌濾紙片(直徑為6 mm)上，操作方法同生防菌的篩選.

1.2.6 生防菌的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)

觀察抑制能力強(qiáng)的生防菌的菌落形態(tài)特征，顯微形態(tài)特征；對(duì)其進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)(甲基紅實(shí)驗(yàn)、糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、淀粉水解實(shí)驗(yàn)等)了解其理化特性[21].

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離、觀察

從牡丹病株的根部分離純化得到2株病原菌，命名為MDG1和 MDG2(見(jiàn)圖1).牡丹病原菌MDG1菌落呈青綠色，邊緣整齊呈白色，中間厚邊緣薄.主菌絲比較粗，分枝菌絲細(xì)且尖端比較圓潤(rùn)，孢子形狀不規(guī)則.牡丹病原菌MDG2菌落呈絮狀，邊緣整齊呈白色，中間厚邊緣薄.菌絲特征與MDG1相同，但MDG2孢子形狀呈梭形，生長(zhǎng)到一定階段脫落.

圖1 牡丹根腐病病原菌MDG1、MDG2的菌落、顯微形態(tài)分析圖

2.2 生防菌的抑菌效果

2.2.1 病原菌MDG1生防菌的篩選

由圖2可知，細(xì)菌G22、t12對(duì)病原菌MDG1的抑制能力較強(qiáng)，使得病原菌絲變纖細(xì)，顯著阻止病原菌的生長(zhǎng)，病原菌與生防菌之間的距離大于1 cm；細(xì)菌GX4、18、38對(duì)病原菌MDG1的抑制能力一般，能使病原菌變纖細(xì)，但抑制能力不強(qiáng)，有輕微接觸，病原菌與生防菌之間的距離小于1 cm，病原菌仍能生長(zhǎng)繁殖；細(xì)菌44、17、12通過(guò)快速生長(zhǎng)繁殖，以擠占病原菌的生長(zhǎng)空間的方式對(duì)病原菌MDG1進(jìn)行抑制，能使病原菌變纖細(xì)，但抑制能力一般，病原菌與生防菌之間的距離小于1 cm，生長(zhǎng)速度緩慢但仍能繼續(xù)生長(zhǎng).

圖2 病原菌MDGI的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)圖

2.2.2 病原菌MDG2生防菌的篩選

由圖3可知，細(xì)菌37、32對(duì)病原菌MDG2的抑制能力較強(qiáng)，使得病原菌變纖細(xì)，無(wú)法向外擴(kuò)展，能夠顯著阻止病原菌的生長(zhǎng)，病原菌與生防菌之間的距離大于1 cm；細(xì)菌G42對(duì)病原菌MDG2的抑制能力一般抑制，能使病原菌變纖細(xì)，但抑制能力不強(qiáng)，有輕微接觸，病原菌與生防菌之間的距離小于1 cm，病原菌仍能生長(zhǎng)繁殖；細(xì)菌9、41、45、40、WX9通過(guò)快速生長(zhǎng)繁殖，以擠占病原菌生長(zhǎng)空間的方式對(duì)病原菌MDG2進(jìn)行抑制，使病原菌變纖細(xì)，但抑制能力不強(qiáng)，有輕微接觸，病原菌與生防菌之間的距離小于1 cm，病原菌生長(zhǎng)緩慢但仍能繼續(xù)生長(zhǎng)至與生防菌接觸.細(xì)菌G22、G23、WX8釋放的代謝物對(duì)病原菌MDG2進(jìn)行抑制，能使病原菌變纖細(xì)，無(wú)法向外擴(kuò)展，能夠顯著阻止病原菌的生長(zhǎng)，病原菌與生防菌之間的距離大于1 cm.

圖3 病原菌MDG2的對(duì)峙實(shí)驗(yàn)圖

2.3 生防菌提取液的抑菌效果

2.3.1 病原菌MDG1的生防菌發(fā)酵液的篩選

圖4 病原菌MDG1的液體抑制圖

由圖4可知，WX3、32的發(fā)酵液對(duì)病原菌MDG1的抑制能力較強(qiáng)，能使病原菌變纖細(xì)，無(wú)法向外擴(kuò)展，病原菌生長(zhǎng)不能覆蓋濾紙片，病原菌與濾紙片之間有明顯的抑菌圈，說(shuō)明發(fā)酵液中某種或多種成分具有抑菌作用.

圖5 病原菌MDG2的液體抑制圖

2.3.2 病原菌MDG2的生防菌發(fā)酵液的篩選

由圖5可知，G49、WX8的發(fā)酵液對(duì)病原菌MDG2的抑制能力較強(qiáng)，使病原菌變纖細(xì)，無(wú)法向外擴(kuò)展，病原菌生長(zhǎng)不能覆蓋濾紙片，病原菌與濾紙片之間有明顯的抑菌圈，說(shuō)明發(fā)酵液中具有一種或多種抑菌成分，WX8的發(fā)酵液中含抑菌成分或種類(lèi)較少，生長(zhǎng)后期不具有抑制功能.

2.4 生防菌的分離、純化與形態(tài)學(xué)觀察

2.4.1 生防菌的分離、純化

由圖6可知，G22為較小的淡黃色圓形菌落，表面濕潤(rùn)有光澤，44、WX8、40、41、WX9、t12這6株生防菌表面干燥有褶皺，邊緣不平整呈鋸齒狀，菌落較大，無(wú)突起.其中t12、44、40、WX9、41呈淡黃色，WX8較其顏色略淡，呈乳白色.18、G42這2株為淡黃色不規(guī)則形菌落，表面干燥有褶皺，邊緣不整齊呈鋸齒狀.G49、9、45這3株生防菌菌落較大，呈淡黃色，表面濕潤(rùn)，且有光澤.G23、32這2株生防菌菌落較大，呈白色，形狀不規(guī)則，表面濕潤(rùn)，且不光滑有褶皺，邊緣不整齊呈鋸齒狀.WX3菌落較小，呈白色，圓形，表面濕潤(rùn)，且有光澤.

圖6 生防菌菌落圖

圖7 革蘭氏染色圖片

2.4.2 生防菌的形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)革蘭氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，如圖7所示，G22近似球形或橢圓形，為革蘭氏陰性菌；G49近似球形或橢圓形，為革蘭氏陽(yáng)性菌；12、WX3、t12、17、44、38、GX4、18、32、G42、38、40、9、45、WX9、WX8、37這17株生防菌近似桿狀或棒狀，菌體大多平直細(xì)長(zhǎng)，兩端圓潤(rùn)或尖銳，為革蘭氏陽(yáng)性菌，41、G23這2株近似短桿狀，兩端尖銳，為革蘭氏陰性菌.

表1 生防菌的生理生化結(jié)果

2.5 生防菌生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定

由表1可知，抑制觀賞牡丹病原菌的生防菌共21株，生防菌均能分解明膠呈陽(yáng)性；G22能夠利用乳糖產(chǎn)酸變黃，乳糖發(fā)酵呈陽(yáng)性；GX4、WX8、40、G23這4株生防菌不能利用葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣為陰性，其余生防菌均為陽(yáng)性；38、WX8、9、32這4株生防菌不能分解淀粉呈陰性，其余生防菌均為陽(yáng)性；G22、18、12、32、G23、G49這6株生防菌滴加甲基紅試劑使培養(yǎng)基變黃為陰性，其余生防菌均為陽(yáng)性；18、t12、38、37、43、WX8、45、G42、WX9這9株生防菌使培養(yǎng)基變成深藍(lán)色，說(shuō)明這9株生防菌能夠利用檸檬酸鹽生長(zhǎng)，使pH變?yōu)閴A性且顏色變化為陽(yáng)性，其余生防菌均為陰性；GX4、18、44、17、12、t12、38、41、WX3、45、32、40、G23、G49這14株生防菌滴加吲哚試劑后呈粉紅色，說(shuō)明這14株生防菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，與吲哚試劑內(nèi)的對(duì)二甲基氨基苯甲醛作用形成紅色為陽(yáng)性，其余為陰性.

3 結(jié)論

(1)本實(shí)驗(yàn)通過(guò)菌落形態(tài)，顯微形態(tài)觀察，初步確定引起曹州牡丹園牡丹根部腐爛的病原菌為MDG1、MDG2.

(2)從無(wú)病牡丹土壤和植株內(nèi)分離、純化細(xì)菌136株，以牡丹根腐病病原菌為靶目標(biāo)，分離到21株具有較強(qiáng)抑菌能力的細(xì)菌，對(duì)病原菌MDG1抑制能力較強(qiáng)的有8株細(xì)菌(G22、GX4、18、44、17、12、t12、38)和32、WX32株菌株發(fā)酵液；對(duì)病原菌MDG2抑制能力較強(qiáng)的有11株細(xì)菌(37、41、WX8、G22、9、45、G42、32、40、G23、WX9)和G49、WX82株菌株發(fā)酵液，G22對(duì)于兩種病原菌都有抑制作用，WX8的菌體和發(fā)酵液對(duì)于病原菌MDG2都有抑制作用.

對(duì)抑制性強(qiáng)的生防菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化實(shí)驗(yàn)，為探究生防菌及其代謝物對(duì)牡丹病原菌抑制機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，為開(kāi)發(fā)生物菌肥提供理論支撐.