辛建珍

（清遠(yuǎn)市清環(huán)檢測技術(shù)有限公司，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）是一種具有高沸點(diǎn)的有機(jī)物，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料等產(chǎn)業(yè)[1]，目前已在環(huán)境中廣泛檢出[2]。該物質(zhì)對人體具有較強(qiáng)的致癌、致畸、致突變作用[3]。常年產(chǎn)卵的斑馬魚個體?。w長4～5 cm），飼養(yǎng)方便簡單，產(chǎn)卵量大且易于收集，其早期發(fā)育階段對外界環(huán)境敏感，是毒性試驗(yàn)的常用模式生物。直接暴露于1,2,4-TCB 中的成年斑馬魚容易受到損傷，對其胚胎進(jìn)行染毒能夠避免對其母體的傷害，能更直觀地觀察到胚胎的發(fā)育毒性效應(yīng)。本試驗(yàn)主要研究不同濃度的1,2,4-TCB對斑馬魚的毒性效應(yīng)，并通過卵凝結(jié)、孵化率和畸形率等毒理學(xué)終點(diǎn)指標(biāo)觀察其對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響。

1 試驗(yàn)方法與材料

1.1 受試生物與試劑

采用反應(yīng)靈敏、外觀正常、體態(tài)均勻（體長3.25 cm±0.35 cm）的健康成年斑馬魚作為受試對象。斑馬魚購于廣州市芳村市場，置于室內(nèi)水族箱中進(jìn)行馴養(yǎng)，馴養(yǎng)7 d 后試驗(yàn)，試驗(yàn)前一天斷食。主要試劑有1,2,4-TCB 和丙酮（分析純），所用試劑均為市售有證合格試劑。

1.2 測試終點(diǎn)及指標(biāo)

目前，斑馬魚及其胚胎染毒時(shí)間主要集中在4～48 h，可以觀察的毒理學(xué)終點(diǎn)包括卵凝結(jié)、囊胚發(fā)育、外包活動階段、原腸胚終止、胚孔關(guān)閉、體節(jié)數(shù)、尾部延伸、20 s 內(nèi)主動活動、眼點(diǎn)發(fā)育、心跳、血液循環(huán)、黑色素細(xì)胞、耳石的發(fā)育，48 h 后（不超過72 h）主要觀察心率、孵化率和畸形率等。其間主要涉及Ⅰ類、Ⅱ類兩類指標(biāo)，代表致死性的Ⅰ類指標(biāo)包括卵凝結(jié)、不開始原腸胚作用、原腸胚作用不終止、無體節(jié)、尾部無延伸、無心跳、48 h 后無主動運(yùn)動、不孵化等，揭示化合物特定作用方式（非致死性指標(biāo)）的Ⅱ類指標(biāo)包括體節(jié)數(shù)顯著減少、無血液循環(huán)、眼點(diǎn)不發(fā)育、24 h 后無主動運(yùn)動、各種畸形、孵化延遲等。

1.3 試驗(yàn)方法

定量1,2,4-TCB 用丙酮助溶后（丙酮的體積分?jǐn)?shù)不超過1%）[4]，用雙蒸水配制成濃度1 000 mg/L 的儲備液備用，使用時(shí)稀釋到所需濃度。

1.3.1 斑馬魚毒性試驗(yàn)

采用半靜態(tài)試驗(yàn)法，急性毒性試驗(yàn)按照資料[5-6]所述方法進(jìn)行。試驗(yàn)用水為曝氣48 h 后的自來水，試驗(yàn)器皿為規(guī)格25 cm×18 cm×25 cm 的小水族缸。量取2 L 藥液置于每個水族缸中，根據(jù)等對數(shù)間距設(shè)計(jì)5 個濃度組（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）[7]，同時(shí)做1 個對照組、1 個助溶劑組和1個平行組。每個組別放入10 尾受試斑馬魚。隨時(shí)撈出死亡受試魚，試驗(yàn)期間不可喂食斑馬魚，每3 d 更換一次水，試驗(yàn)周期為9 d，每天觀察一次，并記錄致死率，觀察其中毒癥狀。應(yīng)用概率單位法計(jì)算，得到暴露各時(shí)間的半致死濃度（LC50）及其95%置信區(qū)間[8]。

1.3.2 斑馬魚胚胎體外染毒

以3 ∶2 的雌雄比例，將產(chǎn)卵期的斑馬魚放在孵化器中，待其產(chǎn)卵。撈出魚卵，用去離子水沖洗魚卵3次，然后用顯微鏡分辨受精卵、未受精卵，選取正常分裂受精卵。為了與斑馬魚毒性試驗(yàn)對比，設(shè)置一致的濃度梯度組（1 mg/L，5 mg/L，10 mg/L，15 mg/L，20 mg/L）、對照組、平行組，另設(shè)一助溶劑組（1,2,4-TCB 濃度20 mg/L，丙酮體積分?jǐn)?shù)0.8%）。用潔凈培養(yǎng)皿作為斑馬魚胚胎體外染毒試驗(yàn)容器，每組培養(yǎng)皿中放入20 mL 試液，并放入20 枚約孵化3 h的囊胚期受精卵，置于室溫下培養(yǎng)。從斑馬魚產(chǎn)卵開始計(jì)時(shí)，每4 h 記錄一次情況，并記錄發(fā)育過程中的毒理學(xué)終點(diǎn)[9-11]。

1.3.3 斑馬魚胚胎體內(nèi)染毒

將之前處理9 d 后所剩的斑馬魚撈出并放置于清水中。由于高濃度（15 mg/L、20 mg/L）組處理的斑馬魚全部死亡，剩下3 個濃度組（1 mg/L、5 mg/L、10 mg/L）和1 個對照組的斑馬魚。待剩下的3 個濃度組斑馬魚產(chǎn)卵，撈出魚卵，用去離子水沖洗3次，用顯微鏡區(qū)分受精卵與未受精卵，選取正常分裂的受精卵。每組有20 枚受精卵，室溫培養(yǎng)，做兩組。從魚產(chǎn)卵時(shí)開始計(jì)時(shí)，每4 h 觀察一次，并記錄發(fā)育過程中的毒理學(xué)終點(diǎn)[12-14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 斑馬魚急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)濃度量的丙酮對斑馬魚沒有影響，但是斑馬魚對1,2,4-TCB 的毒性表現(xiàn)非常敏感，在高濃度時(shí)，魚立即表現(xiàn)出中毒癥狀，如煩躁、亂竄、局促不安、劇烈運(yùn)動、跳動、側(cè)游，而后運(yùn)動速度逐漸減慢[15-16]。96 h后，10 mg/L 處理組的魚游動漸緩，呼吸越發(fā)急促，碰觸時(shí)魚反應(yīng)遲鈍，經(jīng)常浮上水面呼吸。15 mg/L 與20 mg/L 處理組出現(xiàn)魚死亡。96 h 后換水，受試魚開始幾分鐘會出現(xiàn)一些煩躁不安的中毒癥狀，后續(xù)平靜下來。沒發(fā)現(xiàn)死亡情況，原因可能是已經(jīng)適應(yīng)環(huán)境。

染毒96 h后，1,2,4-TCB 與斑馬魚致死率的劑量效應(yīng)關(guān)系曲線如圖1 所示。將濃度換成濃度對數(shù)，將致死率換成概率單位，得到1,2,4-TCB 概率單位與對數(shù)濃度的曲線方程y=4.821 4x-0.449 5，相關(guān)系數(shù)r=0.852 8，概率P＜0.001，二者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。由概率單位法可得，染毒96 h 后斑馬魚LC50為3.94 mg/L，95%置信區(qū)間為3.14～4.74 mg/L。

圖1 染毒96 h 后1,2,4-TCB 與斑馬魚致死率的劑量效應(yīng)關(guān)系曲線

2.2 斑馬魚胚胎體外染毒試驗(yàn)

本研究將72 h 時(shí)孵化不出來的胚胎作為卵凝結(jié)一起統(tǒng)計(jì)。與對照組相比，經(jīng)1,2,4-TCB 處理后的斑馬魚胚胎產(chǎn)生各種毒理學(xué)終點(diǎn)，主要有卵凝結(jié)、原腸胚向外凸、尾短無延伸、心包囊水腫、孵化延遲或不孵化等。卵凝結(jié)導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育，趨于死亡或者已死亡。當(dāng)1,2,4-TCB 濃度為0 mg/L時(shí)，斑馬魚胚胎未出現(xiàn)致死效應(yīng)。隨著試劑濃度升高，斑馬魚胚胎致死率升高。在同一濃度，隨著受試時(shí)間的增加，卵凝結(jié)的比例增大。由此得知，斑馬魚胚胎體外染毒試驗(yàn)存在一定的時(shí)間效應(yīng)與劑量效應(yīng)。

2.3 斑馬魚胚胎體內(nèi)染毒試驗(yàn)

用1,2,4-TCB 處理斑馬魚，不僅對其生長有一定影響，也對其產(chǎn)卵數(shù)量及其正常受精有一定影響。1 mg/L 處理組的斑馬魚卵影響不明顯，隨著濃度的升高，影響逐漸增大，10 mg/L 處理組的斑馬魚未受精卵約占一半。采用不同濃度的1,2,4-TCB 對斑馬魚處理9 d，之后觀察其產(chǎn)的魚卵，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵凝結(jié)效應(yīng)明顯，且具有較高的致死率，隨著濃度的增加，斑馬魚卵凝結(jié)增加。對于同一濃度處理過的斑馬魚，隨著時(shí)間的延長，其卵凝結(jié)比例增大。對比可知，1,2,4-TCB 對斑馬魚胚胎體外染毒的毒性效應(yīng)要比體內(nèi)染毒明顯。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用1,2,4-TCB 對斑馬魚及其魚卵進(jìn)行處理。斑馬魚急性毒性試驗(yàn)顯示，1,2,4-TCB 對斑馬魚的毒性具有明顯的劑量效應(yīng)，當(dāng)濃度大于10 mg/L時(shí)，中毒癥狀明顯。1,2,4-TCB 能致斑馬魚胚胎卵凝結(jié)、尾部延伸少、脊椎彎曲、畸形及致死率上升。1,2,4-TCB 對斑馬魚胚胎發(fā)育具有明顯的致畸作用，相比體內(nèi)染毒，體外染毒對斑馬魚胚胎影響更明顯，主要表現(xiàn)在致畸方面。1,2,4-TCB 對生態(tài)環(huán)境具有潛在危害，本試驗(yàn)數(shù)據(jù)可為其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供依據(jù)。