張米帥，鄒雨佳，劉如明

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，遵義市醫(yī)藥生物技術(shù)重點實驗室，貴州省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，貴州遵義 563003）

戴氏蟲草（Cordyceps taii）是1991年由我國學(xué)者梁宗琦教授等在貴州省首次發(fā)現(xiàn)、鑒定并命名的蟲草類真菌，屬于子囊菌綱，肉座菌目，麥角菌科，蟲草菌屬，與傳統(tǒng)名貴藥用真菌冬蟲夏草、蟬花和蛹蟲草同屬，貴州民間多將其作滋補強壯藥用[1]?，F(xiàn)代藥理研究證明，多糖是戴氏蟲草主要活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗突變、抗輻射、抗氧化等多種藥理活性[2-6]。特別是其優(yōu)良的降血糖和調(diào)節(jié)血脂的功效[7]，使得戴氏蟲草多糖在功能食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用潛力和前景。

多糖在提取純化時，色素也很容易被提取出來，較深的顏色不僅干擾多糖的純度，還影響多糖的定性定量、分離純化及活性方面的研究，所以需要對多糖進行脫色處理[8]。近年來，有關(guān)戴氏蟲草多糖提取方法的研究已有報道[9]，但是針對其提取過程中的脫色研究，特別是對水提多糖和堿提多糖的脫色工藝進行對比研究還未見報道。因此，研究戴氏蟲草多糖的脫色工藝對其工業(yè)生產(chǎn)和藥用研發(fā)具有重要意義。目前國內(nèi)外對多糖脫色的報道較多，但由于多糖來源不同，脫色方法也不盡相同，有H2O2氧化脫色法、金屬絡(luò)合法、離子交換樹脂法、吸附法等[10]。H2O2和金屬絡(luò)合會破壞多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生雜質(zhì)留在多糖溶液中，降低多糖的生物活性[11]；樹脂脫色法操作相對復(fù)雜且價格較貴[12-13]；活性炭吸附法屬于物理吸附，是一種固體表面現(xiàn)象，色素在分子引力或化學(xué)鍵力的作用下，吸附在活性炭表面，從而達到分離的目的[14-16]?；钚蕴績r格便宜，對色素吸附能力較強，且脫色條件溫和，不會破壞多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)，是工業(yè)上較常用的一種多糖脫色材料[17-18]。

因此，本研究通過單因素實驗和正交試驗對比研究了活性炭對戴氏蟲草水提多糖和堿提多糖色素的去除工藝，并確定了兩種多糖最佳的脫色純化工藝條件。研究結(jié)果將為戴氏蟲草水提多糖和堿提多糖的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

戴氏蟲草（Cordyceps taii）GYYA 0601菌株

保存在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，戴氏蟲草菌絲體根據(jù)前期開發(fā)的液體深層培養(yǎng)條件，由本實驗室發(fā)酵制備?；钚蕴浚ǚ蹱钐浚称诽穷悓I(yè)，≥200目） 阿拉丁試劑（上海）有限公司，使用前進行預(yù)處理，105 ℃烘干后備用；氯仿、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸 重慶川東化工（集團）有限公司；正丁醇 天津市富宇精細化工有限公司；苯酚天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖 北京索萊寶科技有限公司；以上試劑 均為分析純。

T&J-Ctype 50L全自動生物反應(yīng)器 上海迪比爾；QHZ-98A搖床 太倉華美；UV2700紫外可見分光光度計 日本島津；Milli-Q Direct 8超純水制備系統(tǒng) 默克密理博；N-1100V旋轉(zhuǎn)減壓蒸發(fā)儀 東京理化；SHZ-III循環(huán)水真空泵 上海亞榮；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊；TLE204E電子天平、FE20 pH計 梅特勒-托利多；5810R臺式高速冷凍離心機 德國艾本德公司；KQ-500DE超聲波清洗機 昆山超聲。

1.2 實驗方法

1.2.1 戴氏蟲草水提多糖和堿提多糖的制備 多糖制備參考實驗室前期方法并進行適當(dāng)調(diào)整[7]。提取流程如下：稱取干燥的戴氏蟲草發(fā)酵菌絲體粉末500 g，以料液比1:6加入95%乙醇除脂除雜，重復(fù)5次。5000 g離心10 min去除上清，濾渣按料液比1:5加入去離子水，85 ℃水浴提取2 h，間歇攪拌，過濾，此操作重復(fù)5次。濾渣回收備用，合并5次濾液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮至原體積的1/5，加入4倍體積無水乙醇，4 ℃冰箱中醇沉24 h，5000 g離心10 min收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮洗滌2次。將沉淀用一定體積去離子水溶解，Sevage法[19]除蛋白至水相和氯仿相交界處無明顯蛋白層，減壓濃縮干燥，得戴氏蟲草水提多糖115 g。取之前回收濾渣，按料液比1:5加入0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，60 ℃水浴提取2 h，重復(fù)5次后合并上清，用0.1 mol/L HCl溶液將上清pH調(diào)為7，濃縮。后續(xù)操作同水提多糖提取，最終得戴氏蟲草堿提多糖70 g。分別稱取一定量干燥的戴氏蟲草水提多糖和堿提多糖，用去離子水溶解，使兩種多糖的濃度均為5 mg/mL，備用。

1.2.2 活性炭脫色單因素實驗 選取活性炭用量、脫色時間、脫色溫度、脫色pH四個因素[20-22]，分別做單因素實驗。

1.2.2.1 活性炭用量對脫色率的影響 參考工業(yè)上活性炭脫色的用量范圍，設(shè)置1、1.5、2、2.5、3和3.5 g/100 mL六個活性炭用量水平。水提多糖和堿提多糖溶液初始pH分別為4.86和7.23，用0.1 mol/L HCl溶液將水提多糖和堿提多糖pH分別調(diào)節(jié)為4和7，在40 ℃條件下振蕩脫色40 min，過濾除炭后測定上清液吸光值。

1.2.2.2 脫色時間對脫色率的影響 設(shè)置10、20、30、40、50和60 min六個脫色時間，水提多糖活性炭用量為2 g/100 mL，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為4，堿提多糖活性炭用量為3 g/100 mL，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為7，然后在40 ℃條件下振蕩脫色，過濾除炭后測定上清液吸光值。

1.2.2.3 脫色溫度對脫色率的影響 設(shè)置30、40、50、60、70、80 ℃六個脫色溫度，水提多糖活性炭用量為2 g/100 mL，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為4，振蕩脫色20 min，堿提多糖活性炭用量為3 g/100 mL，用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH為7，振蕩脫色50 min，過濾除炭后測定上清液吸光值。

1.2.2.4 脫色pH對脫色率的影響 設(shè)置3、4、5、6、7和8六個脫色pH，水提多糖活性炭用量為2 g/100 mL，在70 ℃條件下振蕩脫色20 min，堿提多糖活性炭用量3 g/100 mL，在70 ℃條件下振蕩脫色50 min離心，過濾除炭后測定上清液吸光值。

1.2.3 活性炭脫色正交試驗 按單因素實驗的結(jié)果，選擇確定活性炭用量（A）、脫色時間（B）、脫色溫度（C）、脫色pH（D）的3個水平，按L9（34）安排正交試驗，過濾除去活性炭后檢測分析多糖脫色率和多糖保留率，進行極差和方差分析，確定多糖脫色工藝的最優(yōu)組合[23]。正交試驗因素和水平見表1和表2。

表1 戴氏蟲草水提多糖脫色正交試驗的因素水平設(shè)計Table 1 Factor levels design for orthogonal decolorization experiment of water-extracted polysaccharides from C. taii

表2 戴氏蟲草堿提多糖脫色正交試驗的因素水平設(shè)計Table 2 Factor levels design for orthogonal decolorization experiment of alkali-extracted polysaccharides from C. taii

1.2.4 脫色率的計算 參考文獻選擇420 nm處測定戴氏蟲草水提和堿提多糖脫色前后的吸光值，計算脫色率[24-25]。

式中：A脫色前表示多糖溶液脫色前420 nm處吸光值；A脫色后表示多糖溶液脫色后420 nm處吸光值。

1.2.5 多糖測定方法和多糖保留率的計算 多糖含量采用苯酚-硫酸法[26]測定，用移液管分別吸取葡萄糖對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于25 mL具塞試管中，再分別加入蒸餾水至體積為1.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚和5 mL硫酸，混合均勻后置于30 ℃水浴鍋中顯色20 min，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液在490 nm下的吸光值為縱坐標(biāo)，溶液濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.01113X-0.0094，R2=0.9991。糖濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)，戴氏蟲草水提和堿提多糖脫色前后分別使用苯酚-硫酸法測定490 nm處吸光值，經(jīng)公式換算為糖濃度，計算多糖保留率。

式中：M脫色后多糖表示多糖溶液脫色后糖濃度，μg/mL；M脫色前多糖表示多糖溶液脫色前糖濃度，μg/mL。

1.2.6 脫色效果評價 考慮脫色率和多糖保留率兩項指標(biāo)，且二者對于脫色影響效果一樣，故本實驗數(shù)據(jù)處理采用加權(quán)評分法，將各項指標(biāo)除以該列最大值再乘以100為該項得分[27]。對脫色率和多糖保留率兩項指標(biāo)進行加權(quán)求和，設(shè)定二者的權(quán)重系數(shù)均為0.5，即得：綜合評分=0.5×脫色率+0.5×多糖保留率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 21.0對正交試驗結(jié)果進行極差和方差分析。*表示P＜0.05顯著性差異，**表示P＜0.01極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫色率計算所用波長的確定

對多糖溶液在400～800 nm波長范圍內(nèi)進行掃描（見圖1）。結(jié)果顯示兩種多糖溶液在可見光區(qū)均無最大吸收峰，且從400～800 nm范圍內(nèi)吸收呈逐漸下降趨勢。根據(jù)兩種多糖溶液脫色前均為黃褐色，故從溶液的互補色考慮，并參考蛹蟲草多糖和香菇多糖等真菌多糖的脫色方法，選擇420 nm處測定戴氏蟲草水提和堿提多糖脫色前后的吸光值，計算脫色率。

圖1 戴氏蟲草水提和堿提多糖脫色前全波長掃描Fig.1 Full-wavelength scanning before decolorization of waterand alkali-extracted polysaccharides from C. taii

2.2 活性炭用量的影響

圖2A顯示隨著活性炭用量的增加，水提多糖脫色率變化范圍較小，在2 g/100 mL用量時脫色率最大為80.72%；堿提多糖隨著活性炭用量的增加，脫色率顯著提高（P＜0.05），當(dāng)用量超過2 g/100 mL以后，隨著炭量的增加，脫色率幾乎不再增加，可能原因是脫色過程已趨于平衡，在3 g/100 mL用量時脫色率最大為68.77%。故后續(xù)單因素實驗，水提和堿提多糖脫色的活性炭用量分別選擇2和3 g/100 mL。

圖2 不同條件對水提多糖和堿提多糖脫色的影響Fig.2 Effect of different conditions on the decolorization of water- and alkali-extracted polysaccharides

2.3 脫色時間的影響

圖2B顯示，脫色時間20 min時，水提多糖脫色率最高為89.02%，隨著時間繼續(xù)增加，脫色率逐漸降低；堿提多糖脫色率隨著時間增加逐漸升高，在50 min達到最大值為68.16%?；钚蕴棵撋且粋€動態(tài)可逆的吸附過程，由結(jié)果可知：相比于堿提多糖，活性炭對水提多糖色素的吸附飽和時間更短；隨著吸附時間繼續(xù)延長，色素可能從活性炭解析至溶液中，反而影響脫色效果。后續(xù)單因素實驗，水提和堿提多糖脫色的時間分別選擇20和50 min。

2.4 脫色溫度的影響

圖2C顯示，隨著溫度的增加，水提多糖脫色率變化范圍較小，在70 ℃時脫色率達到最大為91.56%；堿提多糖隨著溫度增加，脫色率逐漸升高，同樣在70 ℃時達到最大為77.27%，當(dāng)溫度繼續(xù)升高脫色率急劇下降。分析可能原因，溫度增高可降低多糖溶液粘度，使其更易進入活性炭空隙，有利于色素的附著；但吸附作為物理過程，過高的溫度也會降低活性炭對色素的吸附，且可能破壞多糖結(jié)構(gòu)影響其活性[28]。后續(xù)單因素實驗，水提和堿提多糖脫色溫度均采用70 ℃。

2.5 脫色pH的影響

圖2D顯示，pH為3和4時，水提多糖脫色率分別為91.22%和91.16%，pH繼續(xù)升高，脫色率逐漸降低；當(dāng)調(diào)節(jié)堿提多糖溶液pH為3時出現(xiàn)沉淀，故從pH為4開始分析，結(jié)果顯示堿提多糖脫色率隨pH增加逐漸升高，在7時達到最大值為73.32%。由此推測，過低的pH可能影響堿提多糖的溶解度，使其不易進入活性炭空隙，從而影響色素的吸附脫除。

2.6 戴氏蟲草水提多糖脫色最佳工藝條件的確定

綜合4種因素對戴氏蟲草水提多糖脫色效果的影響，采用L9（34）安排正交試驗。因素水平表見表1，具體實驗設(shè)計及實驗結(jié)果見表3，并對正交試驗結(jié)果進行了極差和方差分析，相關(guān)結(jié)果見表4和表5。

表3 戴氏蟲草水提多糖活性炭脫色正交試驗結(jié)果Table 3 Results of orthogonal on decolorization of water-extracted polysaccharides from C. taii with activated carbon

表5 戴氏蟲草水提多糖活性炭脫色率方差分析Table 5 Variance analysis of decolorization rate of water-extracted polysaccharide from C. taii with activated carbon

表4脫色率極差R結(jié)果顯示C＞A＞B＞D，即影響戴氏蟲草水提多糖脫色率的因素依次是溫度（C）、活性炭用量（A）、時間（B）和pH（D），A、B和C因素具有極顯著差異（P＜0.01），D因素?zé)o顯著性差異（P＞0.05）；最優(yōu)組合為A3B1C2D2，即活性炭用量2.5 g/100 mL、吸附時間10 min、吸附溫度60 ℃、吸附pH為4。多糖保留率極差R結(jié)果顯示A＞D＞C＞B，即影響戴氏蟲草水提多糖保留率的因素依次是活性炭用量（A）、pH（D）、溫度（C）和時間（B），4個因素均具有極顯著差異（P＜0.01）；最優(yōu)組合為A1B1C1D2，即活性炭用量1.5 g/100 mL、吸附時間10 min、吸附溫度50 ℃、吸附pH為4。從表4極差結(jié)果分析，活性炭用量和脫色溫度對脫色率和多糖保留率的影響是相反的，活性炭用量越大，脫色率越高而多糖保留率越低，脫色溫度在60 ℃時，脫色率最高而多糖保留率最低；脫色時間對脫色率和多糖保留率的影響均成負相關(guān)，隨著脫色時間延長，脫色率和多糖保留率均呈下降趨勢；pH變化對脫色率影響不顯著，但隨著pH增加多糖保留率呈先增后減的趨勢，當(dāng)pH為4時，多糖保留率最高。

表4 戴氏蟲草水提多糖正交試驗極差分析Table 4 Extremum difference analysis of orthogonal experiment of water-extracted polysaccharide from C. taii

綜合考評，選擇多糖脫色率和多糖保留率二者的綜合評分來確定最佳工藝條件。綜合評分R結(jié)果顯示A＞D＞B＞C，即影響因素依次是活性炭用量（A）、pH（D）、時間（B）和溫度（C），四個因素均具有極顯著差異（P＜0.01）；最優(yōu)組合與多糖保留率一致，為A1B1C1D2，即活性炭用量1.5 g/100 mL、吸附時間10 min、吸附溫度50 ℃、吸附pH為4。

2.7 戴氏蟲草堿提多糖脫色最佳工藝條件的確定

戴氏蟲草堿提多糖脫色的L9（34）正交試驗各因素水平表見表2，具體實驗設(shè)計及實驗結(jié)果、極差和方差分析結(jié)果分別見表6、表7和表8。

表6 戴氏蟲草堿提多糖活性炭脫色正交試驗結(jié)果Table 6 Results of orthogonal on decolorization of alkali-extracted polysaccharides from C. taii with activated carbon

表8 戴氏蟲草堿提多糖活性炭脫色率方差分析Table 8 Variance analysis of decolorization rate of alkali-extracted polysaccharide from C. taii with activated carbon

表7脫色率極差R結(jié)果顯示C＞B＞D＞A，即影響戴氏蟲草堿提多糖脫色率的因素依次是溫度（C）、時間（B）、pH（D）和活性炭用量（A），4個因素均具有極顯著差異（P＜0.01）；最優(yōu)組合為A3B3C3D2，即活性炭用量3 g/100 mL、吸附時間50 min、吸附溫度70 ℃、吸附pH為7。多糖保留率極差R結(jié)果顯示A＞D＞C＞B，即影響戴氏蟲草堿提多糖保留率的因素依次是活性炭用量（A）、pH（D）、溫度（C）和時間（B），4個因素均具有極顯著差異（P＜0.01）；最優(yōu)組合為A1B1C1D3，即活性炭用量2 g/100 mL、吸附時間30 min、吸附溫度50 ℃、吸附pH為8。從極差結(jié)果分析，活性炭用量對堿提多糖脫色率和多糖保留率的影響相反，活性炭用量越大，脫色率越高而多糖保留率越低；脫色時間與多糖保留率成負相關(guān)，隨著時間增加，多糖保留率呈下降趨勢，但多糖脫色率在脫色時間為40 min時最低；脫色溫度與多糖脫色率成正相關(guān)，溫度越高脫色率越高，而多糖保留率在脫色溫度為50 ℃時最高；脫色pH與多糖保留率成正相關(guān)，pH越高多糖保留率越高，但多糖脫色率的最大值出現(xiàn)在pH為7時。

表7 戴氏蟲草堿提多糖正交試驗極差分析Table 7 Extremum difference analysis of orthogonal experiment of alkali-extracted polysaccharide from C. taii

堿提多糖綜合評分R結(jié)果顯示A＞D＞C＞B，即影響因素依次是活性炭用量（A）、pH（D）、溫度（C）和時間（B），四個因素均具有極顯著差異（P＜0.01）；最優(yōu)組合為A1B1C3D3，即活性炭用量2 g/100 mL、吸附時間30 min、吸附溫度70 ℃、吸附pH為8。

2.8 脫色工藝的驗證

使用優(yōu)化后的條件，即：水提多糖活性炭用量1.5 g/100 mL、吸附時間10 min、吸附溫度50 ℃、吸附pH為4；堿提多糖活性炭用量2 g/100 mL、吸附時間30 min、吸附溫度70 ℃、吸附pH為8，分別對二者進行脫色，并測定脫色率和多糖保留率，驗證上述脫色工藝。結(jié)果戴氏蟲草水提多糖脫色率和多糖保留率分別為92.12%±0.45%和73.46%±0.33%，戴氏蟲草堿提多糖脫色率和多糖保留率分別為75.67%±0.66%和56.72%±0.47%，表明優(yōu)化后的工藝條件穩(wěn)定可行。

3 討論與結(jié)論

脫色作為多糖提取純化過程中的重要一環(huán)，對多糖的結(jié)構(gòu)鑒定和活性評價起著至關(guān)重要的影響[29-30]。目前，活性炭因其優(yōu)良的脫色效果、低廉的成本和簡單易行的操作工藝，且具有安全無毒、易去除的特性，仍廣泛應(yīng)用于天然活性多糖的脫色，如地參多糖[31]和馬齒蕨多糖[32]。劉福崗等[33]分別使用活性炭法和雙氧水法對白屈菜多糖的脫色工藝進行了對比研究，證明盡管雙氧水法的多糖脫色率優(yōu)于活性炭法（74.82% vs 70.51%），但多糖保留率明顯劣于活性炭法（80.57% vs 95.79%），其原因可能源于雙氧水對多糖結(jié)構(gòu)的破壞。課題組前期也將D101型大孔樹脂用于戴氏蟲草水提多糖的純化，該方法多糖脫色率和多糖保留率分別為64.84%和53.43%[9]；而采用本研究開發(fā)的活性炭脫色法，即活性炭用量1.5 g/100 mL、吸附時間10 min、吸附溫度50 ℃、吸附pH為4，戴氏蟲草水提多糖的脫色率和多糖保留率分別為92.12%和73.46%，均優(yōu)于大孔樹脂法且操作過程更加簡單。另外研究結(jié)果顯示，戴氏蟲草水提多糖的活性炭脫色效果明顯優(yōu)于堿提多糖，推測可能原因為水提多糖脫色的最佳pH為酸性，而堿提多糖脫色的最佳pH為堿性。文獻報道活性炭對帶電物質(zhì)（如陰離子）的吸附能力與溶液pH有關(guān)：弱酸性物質(zhì)在低pH時帶電較少或不帶電，較易被吸附，高pH時電荷較強，不利于吸附，故在酸性條件或偏酸性樣品中活性炭具有更好的脫色效果[34]。

綜上，本研究通過考察活性炭用量、脫色時間、脫色溫度和脫色pH四個因素，對戴氏蟲草水提和堿提多糖的活性炭脫色工藝進行了優(yōu)化，證明活性炭吸附法對戴氏蟲草水提多糖和堿提多糖具有顯著的脫色效果，且多糖保留率高，該脫色工藝簡單高效，成本低廉，適合工業(yè)化應(yīng)用。