李海珀， 水清明， 賈 莉

(1.甘肅省定西市種子站，甘肅定西 743000； 2.甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅定西 743000；3.甘肅省定西市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，甘肅定西 743000)

氮是植物體內(nèi)核糖核酸、蛋白質(zhì)、酶及激素的重要組成成分，在植物生長發(fā)育及生理代謝中具有不可替代的作用[1]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用氮肥是保障農(nóng)作物品質(zhì)及產(chǎn)量的必要措施，然而施氮量與產(chǎn)量間具有一定閾值[2]，增加氮施用量可在一定程度上提高植株氮素含量，但氮素在主要營養(yǎng)器官中的再分配效率可能會因此減少，當(dāng)施氮量過高時產(chǎn)量顯著降低[3]。目前，氮肥不適當(dāng)施用帶來的負(fù)面影響日趨嚴(yán)重，如何有效降低氮肥使用量，提高作物氮利用率已成為發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)的重要問題[4]。為提高作物氮肥利用率，已經(jīng)開展了作物育種、緩釋控釋技術(shù)以及均衡施肥等多種策略[5]，取得了良好的生產(chǎn)效果，但優(yōu)化氮素管理實踐，仍是一個亟待探索的過程。

1 材料與方法

1.1 供試地點與供試材料

試驗于2021年5—7月于甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院溫室大棚中進(jìn)行。供試玉米品種為隆豐211，是甘肅省目前主栽的優(yōu)良品種之一，使用5%次氯酸鈉表面消毒并暗處理催芽24 h。

供試氮肥為15N-尿素(δ15N=11.28%)，來自上海化工研究院。生物炭購自南京勤豐眾成生物質(zhì)新材料有限公司，由玉米秸稈經(jīng)過450 ℃無氧環(huán)境下熱解2 h炭化制成，pH值為8.65，生物炭中C、H、O元素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為66.74%、1.17%、12.53%，容重為0.28 g/cm3，比表面積為9.12 m2/g，主要官能團(tuán)為羥基、烷烴和酰胺基。

供試土壤取自甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院內(nèi)(35°34′59″N，104°36′18″E)0～20 cm表層土壤。土壤類型為重壤土。土壤理化性質(zhì)為含有機質(zhì) 12.94 g/kg，全氮0.87 g/kg、堿解氮52.75 mg/kg，有效磷11.84 mg/kg，速效鉀103.36 mg/kg。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置2因素3水平完全隨機組合設(shè)計，因素1：施用生物炭(BC)，設(shè)置施用0%、3%、6%等3個生物炭水平，分別記為BC0、BC3、BC6；因素2：氮素水平(N)，在常規(guī)施肥基礎(chǔ)上設(shè)置100%、80%、60%等3個氮素水平，分別記為N100、N80、N60；共設(shè)置9個處理組合。其中施用生物炭處理的0%、3%、6%為施用質(zhì)量與培養(yǎng)土壤質(zhì)量之比，施用氮素處理的100%、80%、60%為與常規(guī)施氮量(225 kg/hm2)的質(zhì)量之比，即N100、N80、N60施氮量分別為3.0、2.4、1.8 g/盆。各處理重復(fù)3次。

盆栽裝置為聚乙烯塑料桶，盆高21 cm，上口徑17.5 cm，底徑14 cm。每盆裝土4 kg。將上述生物炭(BC)與施氮(N)處理稱取相應(yīng)質(zhì)量與土壤充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笱b盆，其中每盆純磷施入量為1.0 g(mP2O5∶mK2O=1.0 ∶1.5)。每盆施入催芽的玉米種子3粒，保持70%土壤持水量。培養(yǎng)期間，每1周轉(zhuǎn)動盆體1次，同時每2周隨機挪動盆體位置1次，以消除光照、通風(fēng)等因素造成的試驗誤差。試驗共培育40 d。

1.3 樣品采集及測定分析

1.3.1 玉米植株相關(guān)氮指標(biāo)、土壤氮測定 培養(yǎng)結(jié)束后，將植物地上部、根系分離，65 ℃烘干并稱質(zhì)量以確定植株干物質(zhì)含量。在測定15N豐度和總N含量之前，將植物樣品和風(fēng)干土壤樣品細(xì)磨并通過0.15 mm網(wǎng)篩，植物和土壤15N同位素比采用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(DELTA plus XP，美國Thermo Finnigan公司)測定。

1.3.2 玉米根系性狀及根系活性特征測定 盆栽結(jié)束后將盆體剖開，采用自來水小心清洗以獲得完整根系，采用EPSON Perfective V720 photo掃描儀對根系進(jìn)行掃描，WinRHIZO系統(tǒng)(Regent Instruments LA2000)分析根系體積、總根長、根系表面積及根系平均直徑。重復(fù)3次。根系活力采用氯化三苯基四氮唑法(TTC)測定[15]；采用甲烯藍(lán)吸附法測定玉米根系總吸收表面積、根系活躍吸收表面積[15]，比表面積為活躍吸收表面積與總吸收表面積之比。

1.3.3 氮素相關(guān)代謝基因表達(dá)分析 使用TRIpure Reagent Plant RNA Mini Kit(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)試劑盒提取地上部、根系總RNA，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript? Ⅱ QRT SuperMix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司)按照試劑盒合成第1條cDNA。以ZmUBC為看家基因，采用StepOnePlusTM Real-Time PCR系統(tǒng)(賽默飛世爾科技公司)對cDNA進(jìn)行qRT-PCR分析。氮素相關(guān)代謝基因(ZmAS1、ZmGS1)的特異性引物序列見表1。反應(yīng)體系：2×10 μL SYBR Premix ExTaqⅡ、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2.0 μL cDNA和10 μL ddH2O。擴增條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72.0 ℃ 30 s，40個PCR循環(huán)。借助RQ Manager(ThermoFisher Scientific，USA)采用2-ΔΔCT斷層掃描方法分析數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

來自15N標(biāo)記尿素的氮素(Ndff)、土壤氮素殘留以及植物氮素利用率(NRE)由下式計算[16]：

玉米各器官Ndff=玉米各器官15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；土壤Ndff=土壤的15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；

表1 qRT-PCR引物序列信息

NRE=玉米干質(zhì)量×植株N濃度(%)×玉米整株Ndff/施氮量×100%；

標(biāo)記土壤殘留率=土壤總干質(zhì)量×土壤全N×土壤Ndff/施氮量×100%；

標(biāo)記氮肥損失率=100%-NRE-土壤氮肥殘留率。

采用進(jìn)行雙因素方差分析和最小顯著法(LSD)進(jìn)行試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(α=0.05)，采用Origin 2018進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮肥減量配施生物炭對玉米根系氮組分及干物質(zhì)累積的影響

表2 氮肥減量配施生物炭對玉米根系礦質(zhì)氮組分及根系干物質(zhì)含量的影響

2.2 氮肥減量配施生物炭對玉米根系性狀的影響

由圖1-a可知，總根長指標(biāo)中，不同生物炭處理下其氮肥施用水平處理表現(xiàn)不一，就生物炭水平而言，以BC3、BC6處理大于BC0處理；就氮素減施水平而言，整體以N100、N80處理大于N60處理，其中N80處理在任一生物炭施用水平處理中皆顯著大于N60處理。由圖1-b可知，根系表面積中，就同一氮素施用水平處理中，均以BC3、BC6處理顯著大于BC0處理；整體而言，以BC3N100處理最大，其他處理較其降低1.32%～63.22%，其中顯著大于BC0N100、BC0N80、BC0N60、BC3N80、BC3N60處理。由圖1-c可知，根系體積指標(biāo)中，就氮素施用水平處理而言，整體以N60處理顯著小于其他氮肥施用水平處理，其中在BC0、BC3、BC6水平下較N100處理分別顯著降低49.14%、35.92%、49.06%；整體而言，以BC6N80處理最高，其他處理較其降低4.86%～61.51%。由圖1-d可知，根系平均直徑指標(biāo)中，任一氮素水平下，隨著生物炭施用水平的提高其平均直徑均相應(yīng)增加，且皆以N100處理較大，BC0、BC3、BC6水平下其平均直徑分別為2.73、2.74、2.86 mm，上述生物炭水平下N60較N100處理相應(yīng)分別顯著降低23.44%、21.53%、24.83%。

2.3 氮肥減量配施生物炭對玉米根系活性特征的影響

由圖2-a可知，根系活力指標(biāo)中，就氮素施用水平處理而言，整體以N60處理顯著小于其他氮肥施用水平處理，BC0處理下，N100、N80、N60處理間均差異顯著，而在BC3、BC6處理水平下，以N100處理較大但與N80處理未達(dá)顯著水平，在BC0、BC3、BC6水平下較N100處理分別顯著降低72.89%、22.03%、19.43%；整體而言，以BC6N100處理最高，其他處理較其降低2.43%～75.30%。由圖2-b可知，在根系總吸收表面積中，就生物炭施用水平而言，BC0處理下氮素施用處理間均差異顯著，BC3、BC6處理水平下則均無顯著差異。由圖2-c可知，在根系活躍吸收表面積中，以BC6N80處理最高，其他處理較其降低9.53%～77.28%，除與BC3N100、BC6N100處理無顯著差異外，皆顯著大于其他處理。比表面積為總根系表面積與活躍表面積之比，由圖2-d可知，總體而言，以BC6N100處理比表面積值最高，與BC3N100、BC6N80無顯著差異外，均顯著大于其他處理。

2.4 氮肥減量配施生物炭對玉米根系氮素代謝基因表達(dá)影響

植物中的氮代謝過程已被證明是多種相互依賴的途徑，其中涉及許多基因，包含一系列蛋白質(zhì)、酶和代謝物。其中，谷氨酰胺合成酶(GS)和天冬酰胺合成酶(AS)被認(rèn)為在植物氮代謝過程中具有重要作用。由圖3-a可知，在ZmGS1中，以在BC6N100處理轉(zhuǎn)錄水平最高，其次為BC3N100、BC0N100處理，三者無顯著差異外均顯著高于其他處理，而BC0N80、BC0N60處理差異顯著且均顯著低于其他處理。在ZmAS1中(圖3-b)，以BC6N80處理相對表達(dá)水平最高，余下處理較其降低16.14%～85.82%，其中與BC6N100處理無顯著差異外皆顯著大于其他處理。此外，在添加BC條件下，ZmGS1基因的相對表達(dá)豐度整體比ZmAS1基因更高，這意味著在添加BC的代謝調(diào)整過程中，ZmGS1基因可能比ZmAS1基因更敏感。

2.5 氮肥減量配施生物炭對15N標(biāo)記氮肥去向的影響

由表3可知，在不添加生物炭(BC0)處理中，隨著減氮水平增加，玉米地上部的氮利用率下降，而玉米根部的N利用率增加。在添加生物炭(BC3、BC6)處理中，玉米地上部的氮肥利用率隨著減氮水平的增加而增加，這與各處理在根系中呈相反趨勢。就生物炭處理(BC3、BC6)而言，與不添加生物炭處理(BC0)相比，在3%比例的生物炭處理(BC3)中，玉米地上部利用率、根系利用率及土壤殘留率增加、損失率降低，以添加6%比例的生物炭處理(BC6)具有最高的土壤殘留氮和最低的氮損失率。在玉米整株的氮肥利用率中，當(dāng)添加6%生物炭且施氮肥施用比例為80%時(BC6N80)，玉米植株的氮素利用率(NRE)最高，為29.42%；其他處理較其顯著降低7.65%～33.07%，損失率則顯著增加19.46%～153.69%。雙因素方差分析中，BC×N對根系氮肥利用率、整株氮肥利用率及氮肥損失率均存在顯著交互作用。

表3 氮肥減量配施生物炭下15N-尿素去向 %

3 討論與結(jié)論

根系是植物獲取養(yǎng)分及水分資源的主要器官，根系性狀(構(gòu)型)是反映植物根系生長的重要表征，發(fā)達(dá)的根系則意味著可最大化獲取土壤資源[11]。根系活性是根系生理代謝的重要體現(xiàn)，根系活性越高，表明碳水化合物及酶代謝越旺盛，資源獲取能力越強[21]。本研究中，未施用生物炭處理(BC0)下，隨著氮肥減施水平增加，玉米根系性狀(體積、總根長、表面積、平均直徑)和根系活性生理(根系活力、總吸收表面積、活躍吸收表面積、比表面積)均呈下降趨勢，表明氮肥減施不利于根系生長發(fā)育。這與前人研究結(jié)論[16]基本不一致，該研究表明常規(guī)施肥減氮20%條件下對烤煙根系生理影響不大，這可能是由于二者供試土壤養(yǎng)分水平差異過大的緣故。研究表明，作物植株中60%以上的養(yǎng)分資源來源于土壤，僅35%作用來源于外源施肥[22]，本研究供試土壤較為貧瘠，因此氮肥減施會直接影響玉米植物的生長發(fā)育。就BC施用水平而言，隨著施用水平增加其玉米根系性狀及根系活性指標(biāo)整體呈增加趨勢，表明6%的生物炭施用比例效果較好，且6%的生物炭施用比例下，N100處理與N80處理根系發(fā)育差異最小，表明常規(guī)施氮減氮20%條件下，施用較高比例的生物炭可保證玉米植株根系發(fā)育。

在高等植物中，天冬酰胺合成酶(AS)負(fù)責(zé)氨同化的第一步，谷氨酰胺合成酶(GS)則參與后續(xù)氨的轉(zhuǎn)化、儲存與運輸[23]。在植物的氮再利用階段，AS與GS共同作用于運輸含氮分子，催化谷氨酰胺和天冬氨酸形成天冬酰胺，該過程對于逆境下的氮循環(huán)至關(guān)重要[24]。在本研究中，觀察到玉米根系中ZmGS1的表達(dá)受BC添加比例的影響較大，尤其在BC6處理中，這意味著添加6%的BC比例條件下ZmGS1基因在改善氨同化和增加氮再利用方面發(fā)揮著更為重要的作用。類似地，ZmAS1在根系中的表達(dá)受BC添加和氮減少的影響亦較大，但表達(dá)水平更低(圖3-b)，這與先前對玉米根系的研究[13]一致，即AS活性在低氮脅迫下與銨同化循環(huán)相關(guān)的谷氨酰胺合酶和谷氨酰胺酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平較低[25]。

本研究中，BC0處理下，玉米植株的氮肥利用率(NRE)隨著氮減施水平的增加而降低，在減少氮使用的基礎(chǔ)上添加BC時可明顯提高NRE(表1)。這一結(jié)果與Agegnehu等的結(jié)論[26]趨于一致：生物炭與化肥結(jié)合使用時可顯著提高農(nóng)作物的肥料利用效率，其中對提高NRE尤為顯著。本研究中，玉米NRE在6% BC處理中顯著高于其他生物炭施用比例處理，初步表明6%生物炭是較佳的施用比例，可能歸因于適宜的生物炭施用量對土壤中氮動力學(xué)和氮循環(huán)過程的影響[8，27]。此外，在6% BC施用比例條件下，施氮80%水平處理(BC6N80)具有最高的NRE、土壤氮殘留率以及最低的氮損失率，再次表明80%減氮輸入結(jié)合6%的生物炭添加比例具有較好的保肥性。