趙 楠，張春楠，李宛澤，張 越，李 旭

(牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 黑龍江 牡丹江 157011)

中草藥飼料添加劑因其高效低毒且無(wú)抗藥性等優(yōu)點(diǎn)受到廣泛關(guān)注[1]。多酚可作為飼料添加劑，在改善禽畜腸道菌群方面具有重要作用[2-3]，隨著對(duì)綠色產(chǎn)品的需求越來(lái)越強(qiáng)烈，植物多酚作為天然抗氧化劑得到人們的青睞[4-5]。瓦松為景天科瓦松屬多年生草本植物，一年生蓮座叢的葉短;蓮座葉線形,先端增大，為白色軟骨質(zhì)，半圓形；有齒。在我國(guó)分布廣泛，因常生長(zhǎng)于瓦片之上而得名。研究發(fā)現(xiàn)，瓦松含有黃酮類、甾醇類、萜類、多酚等多種化學(xué)成分[6-8]，在提高宿主抗氧化、抗病毒、抑菌[9-10]以及增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等生物活性方面顯示良好的應(yīng)用潛力[11-13]。對(duì)瓦松有效成分的提取多集中于其多糖[14]、黃酮[15]和三萜[16-17]類成分的研究，鮮少有學(xué)者對(duì)瓦松內(nèi)多酚類物質(zhì)進(jìn)行提取研究。因此，本文綜合考慮瓦松中其他類成分的研究方法，在單因素考察的基礎(chǔ)上，結(jié)合正交試驗(yàn)，研究最佳多酚提取工藝條件，評(píng)價(jià)其抗氧化能力，進(jìn)一步為瓦松在飼料添加劑中的應(yīng)用可行性提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

中藥瓦松購(gòu)于亳州市康美中藥城，經(jīng)鑒定為景天科瓦松屬植物瓦松(Orostachysfimbriatus)，粉碎后過(guò)60目篩，備用。中藥精細(xì)粉碎機(jī)、寧波新芝SB-5200DT(360W)超聲波清洗儀，721型紫外分光光度計(jì)，電子天平。沒(méi)食子酸對(duì)照品，純度大于98%，購(gòu)于合肥博美生物有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

依據(jù)參考文獻(xiàn)[18]，采用福林酚比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱量10.0 mg沒(méi)食子酸，蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移至50 mL棕色容量瓶中定容后搖勻，獲得沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液，置于低溫處儲(chǔ)藏備用。取7個(gè)10 mL容量瓶標(biāo)記為1～7號(hào)，按標(biāo)記向容量瓶中依次精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6 mL對(duì)照品溶液，加入0.5 mL福林酚溶液，混勻后靜置一段時(shí)間，再滴加2 mL 20%碳酸鈉溶液，蒸餾水定容后于室溫下靜置1 h后，于760 nm處測(cè)定溶液的吸光值A(chǔ)。以吸光度值(A)對(duì)沒(méi)食子酸的濃度(c)進(jìn)行線性回歸，其回歸方程為A=34.823c+0.013 3，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，表明其在0.000 2～0.003 2 g/L濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系。

1.2.2 瓦松總多酚的提取和測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0 g瓦松樣品粉末，按照料液比加入定量乙醇溶液，在適宜溫度下進(jìn)行超聲提取，將得到的提取液于室溫下冷卻后過(guò)濾，得到的上清液即為樣品提取液。量取1 mL上清液依次加入福林酚試劑、碳酸鈉溶液，操作方法與“1.2.1”項(xiàng)下相同。根據(jù)線性回歸方程，計(jì)算瓦松提取液中的總多酚含量，并按照公式(1)計(jì)算提取率。

(1)

式中：C為樣品提取液的質(zhì)量濃度，g/L；V為瓦松總多酚溶液的體積，mL；m為瓦松樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

以瓦松總多酚提取率為考察指標(biāo)，測(cè)定不同乙醇濃度對(duì)總多酚提取率影響，設(shè)定條件為10倍量不同濃度乙醇溶液，分別采用40%、50%、60%、70%、80%濃度乙醇溶液，采用超聲裝置于70 ℃下提取70 min；測(cè)定不同提取溫度對(duì)總多酚提取率的影響，設(shè)定提取條件為10倍量50%乙醇溶液，分別在40、50、60、70和80 ℃溫度下超聲提取70 min；測(cè)定提取時(shí)間對(duì)總多酚提取率的影響，設(shè)定提取條件為10倍量50%乙醇溶液，70 ℃下分別提取40、50、60、70和80 min；測(cè)定料液比對(duì)總多酚提取率的影響，設(shè)定提取條件為一定體積的50%乙醇溶液，70 ℃下超聲提取70 min，其中料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40 g/mL。

1.2.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)瓦松總多酚提取工藝進(jìn)行四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)化其參數(shù)。以檢測(cè)瓦松總多酚提取率為指標(biāo)，以乙醇濃度(A)、提取溫度(B)、提取時(shí)間(C)、料液比(D)作為影響因素，進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交因素水平如表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

1.2.5 抗氧化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)文獻(xiàn)[19]方法，選取不同濃度瓦松總多酚溶液1 mL置于10 mL具塞試管中，再加入水楊酸溶液(10 mmol/L)和硫酸亞鐵溶液(9 mmol/L)各1 mL，混勻后加入1 mL過(guò)氧化氫溶液(8.8 mmol/L)，振蕩使之充分混勻后于37 ℃水浴下反應(yīng)30 min，并于波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定混合溶液的吸光度值A(chǔ)1，空白對(duì)照采用蒸餾水代替樣品溶液進(jìn)行測(cè)定得吸光度值A(chǔ)0，吸光度值A(chǔ)2為用蒸餾水代替雙氧水溶液測(cè)得，抗壞血酸為陽(yáng)性對(duì)照，根據(jù)公式(2)計(jì)算瓦松總多酚對(duì)羥基自由基的清除率。

(2)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

單因素試驗(yàn)和抗氧化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Origin 9.0進(jìn)行分析，正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果2.1.1 乙醇濃度的影響

作為提取中藥有效成分的常見(jiàn)溶劑，乙醇的濃度往往會(huì)對(duì)該中藥目標(biāo)有效成分提取率產(chǎn)生一定的影響。由圖1可知，瓦松的多酚提取率隨著乙醇濃度的提升出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)，多酚提取率達(dá)到峰值，后繼續(xù)提高乙醇濃度，瓦松總多酚的提取率反而下降。瓦松中多酚的極性較大，乙醇濃度過(guò)高，溶劑極性偏小，不利于多酚成分的提取，故選擇乙醇濃度為50%進(jìn)行考察。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

2.1.2 提取溫度的影響

根據(jù)圖2可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，在一定范圍內(nèi)瓦松總多酚提取率較低，隨著溫度逐漸升高，其內(nèi)的分子運(yùn)動(dòng)速度加快，增加了多酚在溶液中的溶解度，因而其提取率隨溫度的升高而增加。但當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃時(shí)，多酚結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低，破壞其分子結(jié)構(gòu)，故提取溫度設(shè)定在70 ℃進(jìn)行考察。

圖2 提取溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間的影響

在提取過(guò)程中，有效成分的溶解與擴(kuò)散需要一定的時(shí)間，當(dāng)擴(kuò)散達(dá)到平衡時(shí)提取完成，長(zhǎng)時(shí)間的提取容易導(dǎo)致成分降解以及雜質(zhì)溶出增加。由圖3可知，在瓦松總多酚提取過(guò)程中，提取時(shí)間從40 min增加到70 min時(shí)，提取率隨時(shí)間遞增后達(dá)到峰值，并在繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間后檢測(cè)到提取率明顯下降。因此為保證在得到最大提取量的前提下，選用70 min的提取時(shí)間為最適方案。

圖3 提取時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.1.4 料液比的影響

多酚受料液比因素影響下提取率變化結(jié)果見(jiàn)圖4，在料液比為1∶10 g/mL時(shí)多酚的提取率最大，隨著溶劑用量的增加，提取率反而呈下降趨勢(shì)，溶劑量過(guò)大導(dǎo)致其他成分溶出增加，降低了瓦松總多酚的提取率。因此選擇提取時(shí)料液比為1∶10 g/mL進(jìn)行考察。

圖4 料液比對(duì)多酚提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)瓦松總多酚提取率進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定其最佳提取工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。由表2分析可知，各因素對(duì)瓦松總多酚提取率的影響由大到小依次為提取時(shí)間(C)>提取溫度(B)>料液比(D)>乙醇濃度(A)，根據(jù)k值分析，其最優(yōu)組合為A1B1C2D2，即10倍量的40%乙醇溶液，60 ℃下超聲提取70 min。由表3分析可知，提取溫度、提取時(shí)間和料液比對(duì)瓦松總多酚提取率影響顯著(<0.05)，而乙醇濃度對(duì)瓦松總多酚提取率影響不顯著(>0.05)。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 方差結(jié)果分析

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證正交設(shè)計(jì)優(yōu)化后的工藝是否可靠，對(duì)提取條件A1B1C2D2進(jìn)行驗(yàn)證，即10倍的40%乙醇溶液作為提取溶劑，60 ℃下超聲提取70 min，進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，得到總多酚提取率分別為13.98%、13.73%和14.16%，其平均值為13.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.55%。該結(jié)果表示經(jīng)由正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化后的工藝條件穩(wěn)定，具有一定的科學(xué)性。

2.3 抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，在濃度0.2～2.0 g/L范圍內(nèi)，瓦松總多酚對(duì)羥基自由基清除率隨濃度的增加顯著增長(zhǎng)，呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，其半數(shù)清除濃度(IC50)為0.886 g/L。該結(jié)果表明瓦松總多酚對(duì)羥基自由基有一定的清除能力，具有一定體外抗氧化活性。

圖5 瓦松總多酚體外抗氧化能力

3 討論

通過(guò)超聲輔助乙醇提取法結(jié)合單因素及正交試驗(yàn)，對(duì)影響瓦松總多酚提取率的多個(gè)因素進(jìn)行考察并優(yōu)化工藝，最終確定其最佳提取工藝條件為乙醇濃度40%，提取溫度60 ℃，提取時(shí)間70 min，料液比1∶10 g/mL，在此條件下瓦松總多酚提取率達(dá)到13.96%，其中提取時(shí)間對(duì)提取率的影響最大。在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，瓦松總多酚對(duì)羥基自由基的清除能力與其濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，其IC50值為0.886 g/L，該結(jié)果表明瓦松總多酚具有良好的抗氧化能力。

超聲輔助提取法[20]是中草藥有效成分常有的提取方法之一，該方法既對(duì)提取物質(zhì)沒(méi)有要求也不會(huì)影響提取物質(zhì)的活性和結(jié)構(gòu)，同時(shí)還具有操作簡(jiǎn)單、易分離等特點(diǎn)，在對(duì)中草藥有效成分的提取中廣泛應(yīng)用，能夠大大節(jié)省試驗(yàn)所需要的時(shí)間。對(duì)瓦松總多酚的提取工藝研究中，應(yīng)用超聲輔助乙醇提取法，優(yōu)化后的工藝方案中不僅可以節(jié)約溶劑，而且適當(dāng)?shù)臏囟冗M(jìn)行提取不會(huì)破壞有效成分的結(jié)構(gòu)。

羥基自由基清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，瓦松總多酚具有較好的抗氧化活性，其清除自由基能力與濃度呈明顯的正相關(guān)。隨著促生長(zhǎng)類飼料添加劑的全面退出，提高免疫類中藥飼料添加劑[21]應(yīng)用的越來(lái)越廣泛，本文通過(guò)對(duì)瓦松總多酚的提取與抗氧化的研究，以期為瓦松作為飼料添加劑提供一定的參考價(jià)值。

4 結(jié)論

該研究為超聲輔助乙醇法從瓦松中提取總多酚，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到總多酚的最佳提取工藝為60 ℃下10倍量40%乙醇溶液超聲提取。在此條件下，瓦松總多酚提取率為13.96%。同時(shí)對(duì)從瓦松中提取的總多酚進(jìn)行抗氧化活性研究，多酚對(duì)羥基自由基的清除能力與其濃度呈明顯正相關(guān)，其半數(shù)清除濃度為(IC50)為0.886 mg/mL，呈現(xiàn)出良好的抗氧化性。