唐乃高 鄭根建

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔科，海南省海口市 570100)

2020年，全球唇及口腔癌的新發(fā)病例數(shù)約377 713例，死亡病例數(shù)約177 757例[1]?？谇击[狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是最常見的口腔癌病理類型。手術(shù)治療、放化療及靶向治療是OSCC的常見治療手段，這些方法均具有一定的療效，但在改善OSCC患者預(yù)后方面效果欠佳[2]。酒精、檳榔和香煙是OSCC最常見的致病因素[3]，其中咀嚼檳榔被公認(rèn)為是導(dǎo)致OSCC的最主要因素[4]。了解咀嚼檳榔所致的OSCC臨床特征，對(duì)于尋找OSCC的新治療靶點(diǎn)和改善患者預(yù)后具有重要意義。

研究顯示，miR-486-3p在急性冠狀動(dòng)脈綜合征、銀屑病、高血壓和代謝綜合征等多種疾病中發(fā)揮重要作用[5-7]。 miR-486-3p還可以通過(guò)抑制多種癌細(xì)胞的遷移和侵襲，發(fā)揮腫瘤抑制作用[8]，如miR-486-3p通過(guò)靶向細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的增殖、遷移和侵襲，以及宮頸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9-10]。盤蛋白結(jié)構(gòu)域受體-1(discoidin domain receptor-1，DDR1)是盤蛋白結(jié)構(gòu)域受體亞家族的成員，屬于受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族，在基質(zhì)重塑、膠原蛋白的產(chǎn)生和降解、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞黏附等多種細(xì)胞功能中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用[11]。已有文獻(xiàn)報(bào)告DDR1在肺癌[12]、乳腺癌[13]、腦癌[14]、口腔癌[8]和肝癌[15]等多種人類腫瘤中異常表達(dá)及被激活。本研究探討miR-486-3p通過(guò)靶向DDR1抑制嚼檳榔所致OSCC的作用機(jī)制，以期為臨床上治療OSCC提供新思路。

(2)邀請(qǐng)老黨員參加一個(gè)或幾個(gè)學(xué)生支部“三會(huì)一課”，加強(qiáng)對(duì)學(xué)生黨員組織生活的指導(dǎo)，講好黨課，做好黨建重點(diǎn)任務(wù)，并計(jì)劃擴(kuò)展到邀請(qǐng)校內(nèi)外有豐富經(jīng)驗(yàn)的老黨務(wù)工作者。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：人口腔表皮癌(oral epidermal carcinoma,OEC)-M1細(xì)胞系，正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞系OKF4/TERT-1，以及用于熒光素酶實(shí)驗(yàn)的工具細(xì)胞—人胚胎腎細(xì)胞系HEK293，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑：EdU細(xì)胞增殖試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGA331-1000)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen公司，批號(hào)：11750150)；甘氨酸(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：G274229)；Hoechst染色試劑盒(Bioworld公司，批號(hào)：33342)；QuantiTect SYBR Green試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：RR820A)；TRIzol試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：108-95-2)；pmirGLO螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體(Addgene公司，批號(hào)：117339)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(30IOC化學(xué)發(fā)光測(cè)試儀，Progema公司)；定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?TaKaRa公司，批號(hào)：R401)；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：11668500)；二喹啉甲酸蛋白濃度測(cè)定試劑盒(TaKaRa公司，批號(hào)：T9300A-3)；蛋白marker(Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：26617)；胎牛血清(BI公司，批號(hào)：04-010-1ACS)；DMEM(Gibco公司，批號(hào)：10-013-CVR)；Opti-MEM(Gibco公司，批號(hào)：31985-062)；青霉素鏈霉素混合液(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：KGY0023)；DDR1抗體(ABclonal公司，批號(hào)：A10487)、Caspase-3抗體(ABclonal公司，批號(hào)：A2156)、活化型Caspase-3(cleaved Caspase-3)抗體(ABclonal公司，批號(hào)：A2931)、GAPDH抗體(ABclonal公司，批號(hào)：A19056)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(Jackson公司，批號(hào)：111-035-003)；Triton X-100(Solarbio公司，批號(hào)：T8200)；T4連接酶(Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：D2886)；Polybrene試劑(上海懋康生物科技有限公司，批號(hào)：GM-040901A)。所有PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司和廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成；miR-486-3p mimic、miR-486-3p inhibitor、OE-DDR1慢病毒質(zhì)粒及sh-DDR1慢病毒質(zhì)粒均由生工生物(上海)股份有限公司合成；慢病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2、PMD2.G)由Addgene公司合成。檳榔堿(純度98%，Acros Organics公司，批號(hào)：300-08-3)。

1.2 方法

2.2 miR-486-3p對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，而miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例增高，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。3組的Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖1。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：OEC-M1細(xì)胞、OKF4/TERT-1細(xì)胞、HEK293細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清及1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM中，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)中。

1.2.2.2 瞬染：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期OEC-M1細(xì)胞，用胰酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(接種密度為1×106個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%后，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將細(xì)胞分為3組進(jìn)行干預(yù)：對(duì)照1組，常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，不給予任何特殊處理；miR-486-3p mimic組，給予50 nmol/L的miR-486-3p mimic處理48 h；miR-486-3p inhibitor組，給予100 nmol/L的miR-486-3p inhibitor處理48 h。各組細(xì)胞均培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2孵育箱中。

我國(guó)商業(yè)銀行參與PPP項(xiàng)目尚處于起步階段，部分商業(yè)銀行甚至都沒(méi)有參與過(guò)此類項(xiàng)目，PPP項(xiàng)目操作經(jīng)驗(yàn)不足，缺乏專業(yè)人才。PPP 融資與傳統(tǒng)信貸有著較大的區(qū)別，不僅在還款來(lái)源、追索權(quán)、管理模式、融資期限等方面均存在較大差異，在外部監(jiān)管環(huán)境上也有較大的區(qū)別。

二是依申請(qǐng)信息公開標(biāo)準(zhǔn)化。制定落實(shí)政務(wù)信息主動(dòng)公開制度，公開了財(cái)政部門預(yù)決算、政府性基金和行政事業(yè)性收費(fèi)目錄、規(guī)范性文件、財(cái)政政策等信息，推進(jìn)部門預(yù)決算和“四本預(yù)算”全公開。完善內(nèi)部工作流程和法定程序，制定《財(cái)政政府信息依申請(qǐng)公開標(biāo)準(zhǔn)化管理》，規(guī)范答復(fù)格式文書，將答復(fù)流程嵌入辦公自動(dòng)化。

“填詞首重音律，而予獨(dú)先結(jié)構(gòu)”，李漁的戲劇創(chuàng)作非常重視結(jié)構(gòu)，與承自西方小說(shuō)體系的現(xiàn)當(dāng)代小說(shuō)創(chuàng)作中的“結(jié)構(gòu)”概念不同，李漁所說(shuō)的結(jié)構(gòu)，其實(shí)是在強(qiáng)調(diào)行文的緊密性，他認(rèn)為戲劇的創(chuàng)作應(yīng)該“立主腦”且“密針線”。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：收集組織(組織采用搗碎器進(jìn)行搗碎)及各組細(xì)胞，采用TRIzol法提取總RNA，然后將RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。使用PCR儀擴(kuò)增miR-486-3p及內(nèi)參U6。擴(kuò)增體系為2×miRcute mirRNA premix 10 μL+反轉(zhuǎn)錄引物0.2 μL+miR-486-3p/U6上下游引物各0.5 μL+cDNA 1.0 μL+RNase Free H2O 7.8 μL，共計(jì)20 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。miR-486-3p上游引物序列為5′-GAGTGTCGGGGCAGCTCAGT-3′，下游引物序列為5′-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3′；U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用PCR儀擴(kuò)增DDR1及內(nèi)參GAPDH，擴(kuò)增體系為SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL+DDR1/GAPDH上下游引物各1 μL+cDNA 2 μL+RNase Free H2O 8.5 μL，共25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，總循環(huán)40次；73 ℃延伸5 min。DDR1上游引物序列為5′-GTTCCTGGCGGATGATG-3′，下游引物序列為5′-GGGAATGGGCAAGTATGG-3′；GAPDH上游引物序列為5′-ATGACATCAAGAAGGTGGTG-3′，下游引物序列為5′-CATACCAGGAAATGAGCTTG -3′。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-486-3p、DDR1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 EdU染色：用DMEM(含10%胎牛血清及1%青霉素鏈霉素混合液)按1 000 ∶1的比例稀釋EdU A液，以制備50 μmol/L EdU培養(yǎng)基。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組細(xì)胞，每孔加入100 μL的50 μmol/L EdU培養(yǎng)基，孵育2 h后棄培養(yǎng)基，用PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL細(xì)胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)，室溫孵育30 min后棄固定液，用PBS輕洗3次，5 min/次。采用0.5% Triton X-100室溫破膜20 min，PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入200 μL的2 mg/mL甘氨酸，在脫色搖床上孵育5 min后棄甘氨酸溶液，用PBS輕洗3次，5 min/次。每孔加入100 μL的1×Appollo染色反應(yīng)液，避光、室溫下在脫色搖床上孵育30 min，棄染色反應(yīng)液。每孔加入100 μL甲醇輕洗2次，5 min/次。用去離子水按100 ∶1的比例稀釋制備1×Hoechst反應(yīng)液，避光孵育20 min，棄1×Hoechst反應(yīng)液，用PBS輕洗3次，5 min/次。使用熒光顯微鏡(Leica公司，型號(hào)：DM2500)進(jìn)行觀察，陽(yáng)性細(xì)胞在顯微鏡下呈綠色。每組隨機(jī)選取10個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野下陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的比例，取平均值為該組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，用于表示細(xì)胞增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

建設(shè)富裕文明的美麗宜居名城。突出優(yōu)質(zhì)均等抓好民生大事、人文關(guān)懷解決關(guān)鍵小事，把就業(yè)、教育、醫(yī)療、養(yǎng)老、社保、住房、家政服務(wù)等問(wèn)題一個(gè)一個(gè)解決好、一件一件辦好，普遍增加群眾“隱性財(cái)富”。以時(shí)不我待的緊迫感構(gòu)建立體化現(xiàn)代綜合交通運(yùn)輸體系，高標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施“水氣土”專項(xiàng)治理，讓城鄉(xiāng)融合發(fā)展呈現(xiàn)新形態(tài)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析：采用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.targetscan.org/vert_80/)進(jìn)行miR-486-3p與DDR1的預(yù)測(cè)位點(diǎn)分析。首先輸入miR-486-3p，然后以|log2FC|≥2且P<0.05作為篩選條件，找到DDR1基因，點(diǎn)擊DDR1基因即可顯示miR-486-3p與DDR1基因的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.2.3 穩(wěn)轉(zhuǎn)：(1)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HEK293細(xì)胞，用胰酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(接種密度為1×106個(gè)/孔)，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書，將2 μg OE-DDR1慢病毒質(zhì)粒+1.6 μg psPAX2+2.4 μg PMD2.G轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞，放入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后以1 000 r/min離心10 min，取上清液(即病毒液)，并保存于-20 ℃冰箱待用。(2)取對(duì)數(shù)期OEC-M1細(xì)胞，用胰酶消化后接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(接種密度為1×106個(gè)/孔)，并分為對(duì)照2組、OE-DDR1組、sh-DDR1組。待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%后，棄去原細(xì)胞培養(yǎng)基，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。將2 mL DMEM(含10%胎牛血清+1%青霉素鏈霉素混合液)+1 mL病毒液(加入先前融化的病毒液)+1 μL Polybrene試劑加入OE-DDR1組6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，構(gòu)建OE-DDR1-OEC-M1穩(wěn)轉(zhuǎn)株；按照上述方法對(duì)sh-DDR1組細(xì)胞構(gòu)建sh-DDR1-OEC-M1穩(wěn)轉(zhuǎn)株；對(duì)照2組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行干預(yù)。

2.3 DDR1對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照2組相比，sh-DDR1組OEC-M1細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例降低，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高，而OE-DDR1組OEC-M1細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例升高，cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(均P<0.05)。3組的Caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

1.2.7 Western blot檢測(cè)：使用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，4 ℃下3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，保留上清液，采用二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量。各組取5 μg的蛋白上清液，加入10 μL 5×蛋白上樣緩沖液并于金屬浴中加熱變性5 min。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺分離膠及濃縮膠配置完成后，加入7 μL的蛋白樣品進(jìn)行電泳。待電泳結(jié)束后，以300 mA恒流進(jìn)行濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)型PVDF膜后，5%脫脂牛奶于室溫下封閉PVDF膜2 h后，TBST洗膜3次，5 min/次。加入稀釋后的Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、cleaved Caspase-3抗體(1 ∶1 000)、DDR1抗體(1 ∶1 000)、GAPDH抗體(1 ∶1 000)，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。TBST溶液清洗3次，5 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000)室溫振蕩1 h，TBST溶液清洗3次，5 min/次。最后均勻滴加電化學(xué)發(fā)光液，于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照。采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

通過(guò)思想政治理論課教學(xué)能使教師自身的教學(xué)指導(dǎo)能力與科研能力得到不斷提高；促使教師更加全面、深入地接觸和了解社會(huì)，拓寬了教師的視野，以便他們能夠?qū)ふ腋哂袃r(jià)值的科研和教研課題，進(jìn)一步增強(qiáng)廣大高校教師的科研意識(shí)，全面提高他們的科研能力。目前，我們的許多思想政治課教師只做到了“教書”，卻忽視了“育人”。而在理論課教學(xué)過(guò)程中，教師不僅能夠在教學(xué)中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，還能夠根據(jù)學(xué)生的反饋不斷地完善自身的教育教學(xué)，繼而明確教學(xué)的方向，加快創(chuàng)新步伐，并最終切實(shí)地提高思想政治理論課教學(xué)的實(shí)效性。

1.2.2.4 檳榔堿干預(yù)OKF4/hTERT細(xì)胞的方法：取生長(zhǎng)融合至80%的OKF4/hTERT細(xì)胞，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，將細(xì)胞隨機(jī)分為無(wú)檳榔堿組和檳榔堿組，無(wú)檳榔堿組常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，不給予任何特殊處理；檳榔堿組給予100 μmol/L的檳榔堿連續(xù)刺激細(xì)胞5 d。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-486-3p在OSCC組織中的表達(dá)情況 癌旁組織中的miR-486-3p相對(duì)表達(dá)水平為(1.08±0.21)，OSCC組織中miR-486-3p相對(duì)表達(dá)水平為(0.48±0.17)，后者低于前者(t=9.931，P<0.001)。

1.2.1 OSCC組織標(biāo)本的獲取：收集20例原發(fā)性O(shè)SCC患者的腫瘤組織及癌旁組織(距離腫瘤病灶2 cm的組織)，保存于液氮中備用。患者及其家屬已簽署知情同意書。本研究已經(jīng)過(guò)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院人體實(shí)驗(yàn)和倫理委員會(huì)的審查和批準(zhǔn)。

圖1 miR-486-3p對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

1.2.6 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)：將包含miR-486-3p靶序列的DDR1片段的整個(gè)3端非翻譯區(qū)(3′ untranslated region,3′UTR)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL 2×rTaq酶+1 μL cDNA+1 μL 10 μmol/L引物+23 μL滅菌水，共50 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；4 ℃保存。上游引物序列為5′-GTGATGGAGATGGGGCTT-3′，下游引物序列為5′-TCGGGAGAACTCTTTGCC-3′。使用T4連接酶將擴(kuò)增后的片段克隆到pmirGLO螢火蟲熒光素酶表達(dá)載體中，構(gòu)建DDR1-3′UTR-WT載體，在此基礎(chǔ)上使用定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?，?gòu)建miR-486-3p與DDR1的結(jié)合位點(diǎn)點(diǎn)突變載體(DDR1-3′UTR-MUT)，并進(jìn)行DNA測(cè)序驗(yàn)證。將OEC-M1細(xì)胞分為DDR1-3′UTR-WT+miR-486 3p-mimic組、DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic組，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將上述載體和20 μmol/L miR-486-3p mimic轉(zhuǎn)染至兩組OEC-M1細(xì)胞中。同時(shí)設(shè)立DDR1-3′UTR-WT+對(duì)照1組，只轉(zhuǎn)染DDR1-3′UTR-WT載體。48 h后采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 DDR1對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)水平的影響(x±s)

圖2 DDR1對(duì)OSCC細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.4 miR-486-3p在OSCC中靶向調(diào)控DDR1的表達(dá) 在TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)中分析發(fā)現(xiàn)，miR-486-3p與DDR1存在結(jié)合位點(diǎn)；轉(zhuǎn)染后，miR-486-3p與DDR1-3′-UTR-WT存在結(jié)合點(diǎn)，而與DDR1-3′-UTR-MUT不存在結(jié)合點(diǎn)，見圖3。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與DDR1-3′UTR-WT+對(duì)照1組相比，DDR1-3′UTR-WT+miR-486-3p mimic組的熒光素酶活性下降(P<0.05)，而DDR1-3′UTR-MUT+miR-486-3p mimic組的熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細(xì)胞的DDR1 mRNA表達(dá)水平降低，miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細(xì)胞的DDR1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，見表4。

起初，專家們認(rèn)為阿爾茨海默病源于基因異常。美國(guó)科技暢銷書《基因戰(zhàn)爭(zhēng)》就是從該病入手探討人類基因組計(jì)劃的。科學(xué)研究亦證實(shí)，發(fā)生在人體第21條染色體上的變異，可導(dǎo)致阿爾茨海默病，該原因引發(fā)的病癥有50%的概率遺傳到下一代，這種由遺傳因素導(dǎo)致的病癥，其發(fā)病年齡也通常較早。然而進(jìn)一步的研究表明，基因異常導(dǎo)致的發(fā)病只是極少數(shù)情況，大部分阿爾茨海默病并不遺傳，其原因通常較為復(fù)雜：飲食習(xí)慣、職業(yè)與經(jīng)濟(jì)狀況、甚至頭部遭受重?fù)舳伎梢詫?dǎo)致發(fā)病。全球65歲以上的老人中，平均每20個(gè)人中就有一個(gè)患有阿爾茨海默病，由于發(fā)病率高，一個(gè)家庭中有不止一個(gè)病人的情況也較為普遍，因此會(huì)造成遺傳的錯(cuò)覺(jué)。

圖3 miR-486-3p與DDR1存在結(jié)合位點(diǎn)

表3 各組OEC-M1細(xì)胞熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果(x±s)

表4 miR-486-3p對(duì)OEC-M1細(xì)胞DDR1 mRNA表達(dá)水平的影響(x±s)

2.5 檳榔堿對(duì)OKF4/TERT-1細(xì)胞miR-486-3p和DDR1表達(dá)水平的影響 與無(wú)檳榔堿組相比，檳榔堿組OKF4/TERT-1細(xì)胞中miR-486-3p表達(dá)水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 兩組OKF4/TERT-1細(xì)胞miR-486-3p、DDR1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較(x±s)

圖4 兩組OKF4/TERT-1細(xì)胞中DDR1蛋白的表達(dá)情況

3 討 論

miRNA參與人類多種疾病，可通過(guò)與靶基因的3′UTR結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)控靶基因的表達(dá)[16]。miR-486-3p作為腫瘤抑制因子，通過(guò)抑制多種致癌基因的表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往研究結(jié)果顯示，miR-486-3p在甲狀腺乳頭狀癌[17]、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[8]、宮頸癌[18]、膀胱[19]中異常表達(dá)。但是，有關(guān)miR-486-3p對(duì)OSCC的影響及其機(jī)制目前尚未完全清楚。本研究結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，OSCC組織中miR-486-3p表達(dá)水平降低(P<0.05)，說(shuō)明miR-486-3p可能參與OSCC的發(fā)病過(guò)程。此外，與對(duì)照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細(xì)胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高，而miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細(xì)胞增殖能力增高，cleaved Caspase-3表達(dá)水平降低(均P<0.05)。Caspase是一類與凋亡密切相關(guān)的蛋白水解酶家族,以Caspase前體酶原的形式存在于大多數(shù)動(dòng)物的細(xì)胞中。Caspase-3被切割活化后變成cleaved Caspase-3，但cleaved Caspase-3僅存在于正在發(fā)生凋亡的細(xì)胞中，未凋亡或已經(jīng)壞死的細(xì)胞中檢測(cè)不出cleaved Caspase-3。因此，該結(jié)果說(shuō)明miR-486-3p可以抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

羊多殺性巴氏桿菌感染引起的巴氏桿菌病應(yīng)該結(jié)合藥敏試驗(yàn)，選擇高敏抗生素進(jìn)行治療，選擇使用硫酸卡那霉素注射液、地塞米松磷酸鈉注射液，使用劑量分別為1.5萬(wàn)IU/kg體重、4 mg/只羊，混合后肌肉注射，1次/d，連續(xù)使用3 d[2]。同時(shí)在飲用水中添加0.1%的氟哌酸，讓患病羊自由飲水。對(duì)于體溫升高、不能正常進(jìn)食、病情較為嚴(yán)重的患病羊，選擇使用30%的安乃近注射液5 mL、5%的糖鹽水500 mL、維生素C5 mL，混合后靜脈注射，1次/d，連續(xù)使用3 d，強(qiáng)化補(bǔ)液[3]。

DDR1在多種腫瘤患者體內(nèi)呈高表達(dá)，并作為腫瘤蛋白在腫瘤細(xì)胞的生存、增殖、耐藥、侵襲性和遷移等過(guò)程中發(fā)揮作用[20]。高水平的DDR1可通過(guò)激活Notch受體1和Ras/Raf/絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路提高腫瘤細(xì)胞的生存能力[21]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照2組相比，sh-DDR1組OEC-M1細(xì)胞增殖能力降低，cleaved Caspase-3表達(dá)水平升高，而OE-DDR1組OEC-M1細(xì)胞增殖能力升高，cleaved Caspase-3表達(dá)水平降低(均P<0.05)，說(shuō)明抑制DDR1表達(dá)可以抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡。這提示DDR1在OSCC細(xì)胞生存中發(fā)揮了重要的作用，這為未來(lái)研究DDR1對(duì)OSCC細(xì)胞生存的影響及相關(guān)機(jī)制提供了框架。

本研究結(jié)果還顯示，與對(duì)照1組相比，miR-486-3p mimic組OEC-M1細(xì)胞的DDR1 mRNA表達(dá)水平降低，miR-486-3p inhibitor組OEC-M1細(xì)胞的DDR1 mRNA表達(dá)水平升高(均P<0.05)；此外，雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果和生物信息學(xué)分析顯示，miR-486-3p與DDR1存在結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明miR-486-3p可以直接通過(guò)與DDR1 3′UTR結(jié)合來(lái)下調(diào)DDR1的表達(dá)，從而發(fā)揮抑癌作用。

咀嚼檳榔是導(dǎo)致口腔黏膜纖維化的最主要原因，可增加口腔癌發(fā)病率，還與口腔白斑和口腔扁平苔蘚等癌前病變密切相關(guān)[22]。有研究顯示，檳榔是臺(tái)灣地區(qū)人群患口腔癌最常見的環(huán)境危險(xiǎn)因素[23]。咀嚼檳榔致口腔癌的原因可能是因?yàn)闄壚频亩喾N活性成分和代謝產(chǎn)物(包括檳榔生物堿、檳榔鞣質(zhì)、檳榔特異性亞硝胺和活性氧等)具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性，甚至直接致癌性[24]。本研究結(jié)果顯示，與無(wú)檳榔堿組相比，檳榔堿組OKF4/TERT-1細(xì)胞中的miR-486-3p表達(dá)水平降低，DDR1 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)，說(shuō)明檳榔可能通過(guò)調(diào)控miR-486-3p和DDR1的表達(dá)從而引起口腔癌的發(fā)病。

綜上所述，OSCC組織中miR-486-3p表達(dá)水平降低，miR-486-3p可能通過(guò)靶向下調(diào)DDR1的表達(dá)，抑制OSCC細(xì)胞增殖，促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。檳榔堿可下調(diào)正?？谇唤琴|(zhì)形成細(xì)胞中miR-486-3p的表達(dá)，而上調(diào)DDR1的表達(dá)，檳榔可能通過(guò)調(diào)控miR-486-3p和DDR1的表達(dá)從而誘發(fā)口腔癌。本研究結(jié)果或許可為臨床上治療咀嚼檳榔所致的OSCC提供了新的思路。