朱棟梁 顏紅霞 岳健軍 劉劍鋒 李增波 宋靜芳

（南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院兒科，湖南 衡陽(yáng) 421001）

宮內(nèi)發(fā)育遲緩（intrauterine growth restriction，IUGR）是指多數(shù)孕婦由于孕期營(yíng)養(yǎng)不良，造成胎兒發(fā)育受損，導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)極低出生體重，同時(shí)影響其認(rèn)知和神經(jīng)發(fā)育，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力下降［1］。目前針對(duì)IUGR的臨床治療，多以預(yù)防為主，無(wú)法從本質(zhì)上改善。海馬組織作為學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵部位，有豐富的神經(jīng)元，其中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受體酪氨酸激酶B（tyrosine kinase B，TrkB）在海馬組織中含量最高，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，可影響與學(xué)習(xí)和記憶能力相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)［2］。miRNA是一種非編碼RNA分子，在神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，可參與神經(jīng)元的增殖和凋亡［3-4］。多項(xiàng)研究表明，在多種因素所致學(xué)習(xí)記憶功能障礙模型動(dòng)物海馬組織中miR-204呈現(xiàn)高表達(dá)［4-5］，然而下調(diào)miR-204表達(dá)可抑制神經(jīng)炎癥，改善學(xué)習(xí)記憶功能［6-7］。Chen等［8］通過(guò)miRNA微陣列分析正常新生大鼠和IUGR新生大鼠海馬組織中差異表達(dá)的miRNA，結(jié)果顯示miR-204在IUGR新生大鼠海馬組織中高表達(dá)。然而miR-204高表達(dá)是否影響IUGR新生大鼠學(xué)習(xí)記憶能力目前尚不知曉。為此，本研究通過(guò)建立IUGR大鼠模型，探討miR-204對(duì)IUGR新生大鼠遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力的影響，并初步闡明其作用機(jī)制，旨在為預(yù)防和治療IUGR相關(guān)認(rèn)知功能障礙提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠90只（雌性30只，雄性60只），10周齡，購(gòu)自廣州銳格生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（粵）2021-0059。在無(wú)特定病原體條件下飼養(yǎng)，溫度23～25℃，相對(duì)濕度50%～57%，自由采食飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)飼料（熱卡量約為1 558 kJ/100 g，蛋白質(zhì)含量約為16%）和低蛋白飼料（熱卡量約為1 558 kJ/100 g，蛋白質(zhì)含量約為8%）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；miR-204拮抗劑（miR-204 antagomir）及拮 抗 劑對(duì) 照（antagomir-NC）、miR-204 mimic及mimic NC均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；BDNF抗體、TrkB抗體、磷酸化TrkB（p-TrkB、Tyr706/707）抗體、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）抗體、磷酸化CREB（p-CREB，Ser133）抗體和GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；SYBR FAST qPCR Master Mix、SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司；PrimeScriptⅡRTase、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TAKARA公司；Luciferase熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovision公司；電泳儀（型號(hào)：164-5056）美國(guó)BIO-RAD公司；PCR儀（型號(hào)：7500）購(gòu)自美國(guó)ABI公司；正置顯微鏡（型號(hào)：CX23）購(gòu)自日本Olympus公司；Morris水迷宮裝置（型號(hào)：63034）購(gòu)自深圳瑞沃德生命科技有限公司；全功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Synergy H4）購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 IUGR模型構(gòu)建90只SD大鼠按照雌雄比1∶2于18時(shí)進(jìn)行合籠，次日9時(shí)檢查雌鼠陰栓，共計(jì)受孕25只，記為妊娠第0天。25只孕鼠單只單籠飼養(yǎng)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常飲食組（n=10）和低蛋白飲食組（n=15）：正常飲食組孕鼠孕期全程給予標(biāo)準(zhǔn)飼料；低蛋白飲食組孕鼠孕期全程給予低蛋白飼料。幼鼠出生12 h后稱(chēng)重，低蛋白飲食組幼鼠體重低于正常飲食組幼鼠2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，表示IUGR建模成功［9］。幼鼠均由母鼠母乳喂養(yǎng)，低蛋白飲食組母鼠繼續(xù)給予低蛋白飼料，正常飲食組母鼠繼續(xù)給予標(biāo)準(zhǔn)飼料。

1.3.2 動(dòng)物分組及干預(yù)實(shí)驗(yàn)一：取25只正常幼鼠設(shè)為正常組，25只IUGR幼鼠設(shè)為IUGR組，分別于出生后第0、7、14、21、28天［9］各取5只幼鼠進(jìn)行稱(chēng)重并頸椎脫臼法處死，取海馬組織凍存，采用qRT-PCR檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)幼鼠海馬組織中miR-204表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)二：取10只正常幼鼠設(shè)為對(duì)照組，30只IUGR幼鼠分別設(shè)為模型組、miRNA拮抗劑對(duì)照組（antagomir-NC組）和miR-204拮抗劑組（antagomir組），每組10只。于出生后第3天，antagomir-NC組幼鼠腹腔注射antagomir-NC，antagomir組幼鼠腹腔注射miR-204 antagomir，5 nmol/次，對(duì)照組和模型組幼鼠注射0.9%氯化鈉溶液，每隔3 d注射1次，共7次。

1.3.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二各組每只大鼠于30日齡時(shí)進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前，站臺(tái)放置于第四象限，將大鼠置于站臺(tái)上適應(yīng)10 s，隨后大鼠從不同象限面朝池壁入水，記錄大鼠120 s內(nèi)登上站臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期），若大鼠在120 s內(nèi)未找到站臺(tái)，實(shí)驗(yàn)者將其引上站臺(tái)適應(yīng)10 s，記錄逃避潛伏期為120 s。按照上述進(jìn)行操作，每天4次，每次間隔1 h，訓(xùn)練4 d。空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束24 h后，撤除站臺(tái)，將大鼠面朝池壁放入第一象限相同入水點(diǎn)，記錄120 s內(nèi)跨越原站臺(tái)的次數(shù)。

1.3.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二各組每只大鼠于36日齡時(shí)取右側(cè)海馬組織凍存。實(shí)驗(yàn)一各時(shí)間點(diǎn)各組取5個(gè)樣本及實(shí)驗(yàn)二各組取10個(gè)樣本，按照TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度及純度。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，取1 μL cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃3 min，95℃5 s，56℃10 s，72℃25 s，共39個(gè)循環(huán)；65℃5 s；95℃50 s。miR-204以U6作為內(nèi)參基因，BDNF以GAPDH作為內(nèi)參基因，通過(guò)2-ΔΔCt方法計(jì)算實(shí)驗(yàn)一中各時(shí)間點(diǎn)miR-204和實(shí)驗(yàn)二中miR-204、BDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量［10］。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

1.3.5 尼氏染色將實(shí)驗(yàn)二各組每只大鼠于36日齡時(shí)取左側(cè)海馬組織采用4%多聚甲醛固定，將固定24 h的海馬組織取出常規(guī)脫蠟至水，行冠狀切面，制備石蠟切片（厚度4 μm）。然后石蠟切片置于60℃溫箱中使用1%甲苯胺藍(lán)染色40 min，蒸餾水沖洗后，分別置于由低到高（70%、80%、95%和100%）的乙醇中脫水，二甲苯再次透明，最后中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)病理變化，并隨機(jī)選取3個(gè)視野統(tǒng)計(jì)尼氏小體數(shù)量，取其平均值［11］。

1.3.6 Tunel檢測(cè)海馬組織細(xì)胞凋亡水平將已脫蠟水化后的石蠟切片用蛋白酶K工作液于37℃中孵育15 min。然后加入50 μL Tunel反應(yīng)混合液，在濕盒、暗室中加蓋37℃孵育60 min。用PBS沖洗3次。加入50 μL轉(zhuǎn)化POD，在濕盒中37℃孵育30 min。用PBS沖洗3次。加入100 μL DAB底物于室溫孵育10 min。用PBS沖洗3次。蘇木精復(fù)染，脫水，透明。封片后在顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡水平，隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)（棕色），計(jì)算細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)［12］。

1.3.7 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)取30 μg蛋白與上樣緩沖液混合，沸水浴10 min使蛋白變性后離心取上清上樣，SDS凝膠電泳2 h分離蛋白，濕轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，依次加入BDNF（1∶1 000）、TrkB（1∶1 000）、p-TrkB（1∶1 000）、CREB（1∶1 000）、p-CREB（1∶1 000）及內(nèi)參GAPDH（1∶1 000）抗體，室溫孵育1 h。PBST清洗3次，加入按照1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，PBST清洗3次，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行條帶分析，計(jì)算目的蛋白BDNF、TrkB、p-TrkB、CREB及p-CREB相對(duì)表達(dá)量［13］。

1.3.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)使用TargetScanHuman7.2在 線 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（http://www.targetscan.org/vert_72/）預(yù) 測(cè)miR-204和BDNF的 靶向結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)BDNF-3'-UTR野生型（BDNFWT）及BDNF-3'-UTR突變型（BDNF-MUT）片段序列，通過(guò)PCR擴(kuò)增、回收、酶切和純化后構(gòu)建熒光素酶報(bào)告載體。采用Lipofectamine 3000試劑分別 將miR-204 mimic和mimic NC與BDNF-WT或BDNF-MUT共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，按照熒光素酶報(bào)告檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，并使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定螢火蟲(chóng)和海腎熒光素酶活性，相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲(chóng)熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IUGR幼鼠體重和miR-204水平變化

與正常組比較，IUGR組出生后第0、7、14、21、28天幼鼠體重降低（表2），而海馬組織中miR-204表達(dá)水平升高（表3），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。體重是臨床評(píng)估IUGR的診斷標(biāo)準(zhǔn)，體重結(jié)果表明本研究已成功構(gòu)建IUGR大鼠模型。IUGR幼鼠海馬組織中miR-204含量呈時(shí)間依賴(lài)性，即隨著時(shí)間的增長(zhǎng)miR-204含量升高（F=43.444，P＜0.001），而正常幼鼠miR-204含量無(wú)變化（F=0.252，P=0.905），提示miR-204可能參與IUGR病程。

表2 兩組幼鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較（±s，g；n=25）

表2 兩組幼鼠不同時(shí)間點(diǎn)體重比較（±s，g；n=25）

注：［IUGR］宮內(nèi)發(fā)育遲緩。

組別正常組IUGR組t值P值第0天7.1±0.5 5.2±0.4 6.398＜0.001第7天14.3±0.6 11.7±0.4 8.147＜0.001第14天23.4±1.0 19.7±0.8 6.281＜0.001第21天32.3±1.2 25.1±0.9 10.556＜0.001第28天64.6±2.0 40.2±1.5 21.803＜0.001

表3 兩組幼鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織中miR-204 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s，n=25）

表3 兩組幼鼠不同時(shí)間點(diǎn)海馬組織中miR-204 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s，n=25）

注：［IUGR］宮內(nèi)發(fā)育遲緩。

組別正常組IUGR組t值P值第0天1.01±0.09 1.45±0.26-3.634 0.007第7天1.00±0.02 1.83±0.19-9.607＜0.001第14天1.00±0.06 2.02±0.13-16.210＜0.001第21天1.00±0.06 2.44±0.15-19.308＜0.001第28天1.03±0.07 3.16±0.33-14.180＜0.001

2.2 各組大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力比較

與對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期增加，跨臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，antagomir組大鼠逃避潛伏期減少，跨臺(tái)次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而antagomir-NC組逃避潛伏期、跨臺(tái)次數(shù)與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示IUGR會(huì)引起學(xué)習(xí)與記憶能力障礙；抑制miR-204表達(dá)后，學(xué)習(xí)與記憶能力得到改善。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)比較（±s，n=10）

注：a與對(duì)照組相比，P＜0.001；b與模型組相比，P＜0.001。

組別對(duì)照組模型組antagomir-NC組antagomir組F值P值逃避潛伏期(s)14.0±1.6 28.0±2.0a 28.0±1.9 20.0±1.9b 68.642＜0.001跨臺(tái)次數(shù)(次)8.0±0.7 5.4±0.5a 5.8±0.4 7.2±0.4b 24.444＜0.001

2.3 各組大鼠海馬組織中miR-204和BDNF mRNA表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，模型組miR-204表達(dá)水平升高，BDNF mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；與模型組比較，antagomir組miR-204表達(dá)水平降低，BDNF mRNA表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），而antagomir-NC組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示IUGR會(huì)引起海馬組織中miR-204高表達(dá)，BDNF低表達(dá)；抑制miR-204表達(dá)后，海馬組織中BDNF表達(dá)升高，推測(cè)miR-204可能調(diào)控BDNF。見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠海馬組織中miR-204和BDNF mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表5 各組大鼠海馬組織中miR-204和BDNF mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：a與對(duì)照組相比，P＜0.001；b與模型組相比，P＜0.001。［BDNF］腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。

組別對(duì)照組模型組antagomir-NC組antagomir組F值P值miR-204 1.02±0.05 3.07±0.08a 3.01±0.07 1.92±0.13b 610.526＜0.001 BDNF 1.00±0.06 0.56±0.05a 0.58±0.06 0.81±0.04b 67.065＜0.001

2.4 各組大鼠海馬神經(jīng)元損傷情況

如圖1所示，對(duì)照組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列整齊，胞漿均勻且有大量淡藍(lán)色尼氏小體。模型組和antagomir-NC組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列紊亂，部分錐體細(xì)胞胞核固縮，呈三角形，胞漿染色變淺且尼氏小體大量減少。antagomir組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列較整齊，錐體細(xì)胞胞核固縮現(xiàn)象明顯減少，尼氏小體數(shù)量有所恢復(fù)。選取36日齡大鼠，每組10只，對(duì)照組、模型組、antagomir-NC組和antagomir組海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量分別為（60.1±2.9）個(gè)、（30.3±3.6）個(gè)、（31.0±3.6）個(gè)和（49.4±3.2）個(gè)。與對(duì)照組比較，模型組海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.170，P＜0.001）；與模型組比較，antagomir組海馬CA1區(qū)尼氏小體數(shù)量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.434，P＜0.001），而antagomir-NC組尼氏小體數(shù)量無(wú)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.185，P＞0.05）。提示IUGR可引起海馬神經(jīng)元損傷；抑制miR-204表達(dá)后，海馬神經(jīng)元受損現(xiàn)象得到改善。

圖1 海馬組織CA1區(qū)病理變化（尼氏染色，×400）A：對(duì)照組；B：模型組；C：antagomir-NC組；D：antagomir組。注：▲表示尼氏小體，*表示變形錐體細(xì)胞。

2.5 各組大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡水平比較

對(duì)照組、模型組、antagomir-NC組和antagomir組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率分別為（4.7±0.9）%、（64.4±2.4）%、（62.8±2.6）%和（26.3±1.5）%。與對(duì)照組比較，模型組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=48.524，P＜0.001）；與模型組比較，antagomir組海馬CA1區(qū)細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=30.982，P＜0.001），而antagomir-NC組細(xì)胞凋亡率無(wú)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.350，P＞0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞凋亡變化（Tunel染色，×400） A：對(duì)照組；B：模型組；C：antagomir-NC組；D：antagomir組。

2.6 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkB信號(hào)通路活化情況

與對(duì)照組比較，模型組大鼠海馬中BDNF、p-TrkB和p-CREB蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.861、3.976、9.295，P＜0.001）。模 型組TrkB和CREB蛋白水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.102、0.556，P＞0.05）。與模型組比較，antagomir組大鼠海馬中BDNF、p-TrkB和p-CREB蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.152、9.286、13.553，P＜0.001）；而antagomir組TrkB和CREB蛋白水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.837、1.892，P＞0.05），而antagomir-NC組以上所有指標(biāo)蛋白水平與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng) 計(jì) 學(xué) 意 義（t=0.489、0.262、0.667、0.835、0.060，P＞0.05）。提示IUGR可引起大鼠海馬組織BDNF/TrkB信號(hào)通路的失活；抑制miR-204表達(dá)后，海馬組織BDNF/TrkB信號(hào)通路被激活。見(jiàn)表6和圖3。

圖3 各組大鼠海馬組織BDNF/TrkB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 A：對(duì)照組；B：模型組；C：antagomir-NC組；D：antagomir組。

表6 各組大鼠海馬組織中BDNF/TrkB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表6 各組大鼠海馬組織中BDNF/TrkB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：a與對(duì)照組相比，P＜0.001；b與模型組相比，P＜0.001。［BDNF］腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；［TrkB］酪氨酸激酶B；［p-TrkB］磷酸化酪氨酸激酶B；［CREB］cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白；［p-CREB］磷酸化cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白。

組別對(duì)照組模型組antagomir-NC組antagomir組F值P值BDNF 0.536±0.036 0.294±0.055a 0.306±0.032 0.764±0.023b 164.523＜0.001 TrkB 0.566±0.061 0.524±0.032 0.534±0.084 0.594±0.051 1.397 0.280 p-TrkB 0.480±0.030 0.304±0.082a 0.276±0.039 0.694±0.090b 42.139＜0.001 CREB 0.606±0.022 0.586±0.047 0.616±0.092 0.654±0.042 1.261 0.321 p-CREB 0.554±0.031 0.244±0.070a 0.246±0.045 0.696±0.056b 92.616＜0.001

2.7 miR-204與BDNF的靶向作用關(guān)系

如圖4所示，通過(guò)TargetScan在線數(shù)據(jù)庫(kù)顯示，miR-204與BDNF-3'-UTR之間存在潛在的互補(bǔ)序列，miR-204基因序列中UUCCCUU堿基與BDNF基因序列中AAGGGAA堿基配對(duì)，形成沉默復(fù)合體，阻止BDNF基因轉(zhuǎn)錄翻譯，減低BDNF蛋白表達(dá)水平。提示miR-204可靶向調(diào)控BDNF。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染BDNF-WT質(zhì)粒的細(xì)胞中，與共轉(zhuǎn)染mimic NC比較，共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic可降低細(xì)胞熒光素酶活性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.00±0.05 vs 0.47±0.04，t=18.009，P＜0.001）；在轉(zhuǎn)染BDNF-MUT質(zhì)粒的細(xì)胞中，與共轉(zhuǎn)染mimic NC比較，共轉(zhuǎn)染miR-204 mimic不能降低細(xì)胞熒光素酶活性，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（1.01±0.07 vs 0.98±0.06，t=0.343，P＞0.05）。

圖4 BDNF-3'-UTR預(yù)測(cè)的miR-204結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

IUGR可引起胎兒發(fā)育不勻稱(chēng)和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育障礙，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力下降。海馬組織主要負(fù)責(zé)學(xué)習(xí)和記憶，而IUGR中缺血和營(yíng)養(yǎng)不良等因素會(huì)引起海馬組織尼氏小體銳減，尼氏小體作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)志，出現(xiàn)數(shù)量減少時(shí)，會(huì)引起神經(jīng)元受損，損傷海馬組織，導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶能力衰退［14-15］。本研究采用低蛋白飲食法建立IUGR大鼠模型，結(jié)果顯示IUGR幼鼠體重顯著低于正常幼鼠，并表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙，與Chen等［16］研究結(jié)果一致，提示IUGR大鼠模型構(gòu)建成功。本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，IUGR幼鼠海馬組織中miR-204含量逐漸升高，而正常組幼鼠海馬組織中miR-204含量無(wú)變化，提示miR-204可能參與IUGR。

在IUGR研究中，miRNAs一直保持敏感性水平。miR-204作為miRNAs中的一員，已證實(shí)其參與神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控，但暫無(wú)與IUGR相關(guān)的研究。Hung等［17］研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p下調(diào)可導(dǎo)致BDNF/TrkB過(guò)表達(dá)和AKT/mTOR/Rac1信號(hào)通路激活，使海馬中的激素和神經(jīng)元得到調(diào)節(jié)，緩解精神壓力。Zhang等［18］研 究 表 明，抑 制miR-204通過(guò)阻斷BRUCE與STX17的相互作用來(lái)預(yù)防阿爾茨海默病中海馬神經(jīng)軸突營(yíng)養(yǎng)不良，治療記憶障礙。本研究結(jié)果顯示，IUGR大鼠海馬組織中miR-204含量升高，尼氏小體數(shù)量降低，細(xì)胞凋亡率升高，且出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)和記憶能力障礙；miR-204拮抗劑干預(yù)后，IUGR大鼠海馬組織中miR-204表達(dá)被抑制，海馬神經(jīng)元及學(xué)習(xí)和記憶能力有所改善。提示miR-204可能改善IUGR大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力。本研究還發(fā)現(xiàn)，IUGR大鼠海馬組織出現(xiàn)BDNF表達(dá)降低，而抑制miR-204表達(dá)后，BDNF表達(dá)上升，說(shuō)明miR-204可能調(diào)控BDNF。

BDNF/TrkB信號(hào)通路可增強(qiáng)IUGR患兒神經(jīng)元突觸聯(lián)系和可塑性，影響學(xué)習(xí)記憶功能［19］。研究［20］顯示，BDNF被激活后，在軸突末端與TrkB受體結(jié)合，促使TrkB受體內(nèi)酪氨酸殘基自身磷酸化，使p-TrkB水平升高，進(jìn)而促使ras-MAPK通路活化，激活CREB，并使CREB磷酸化，p-CREB水平增加（圖5）。甘世明等［21］研究顯示，激活BDNF/TrkB信號(hào)通路可使前體細(xì)胞和樹(shù)突進(jìn)行分化和連接，從而保護(hù)神經(jīng)。Ge等［22］研究顯示，miR-204和BDNF/TrkB信號(hào)通路可能參與胚胎期及成年期氟鋁暴露引起的子代大鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙，而抑制miR-204表達(dá)可激活BDNF/TrkB通路從而改善空間學(xué)習(xí)記憶障礙。本研究結(jié)果顯示，IUGR大鼠海馬組織中miR-204高表達(dá)，BDNF、p-TrkB及p-CREB水平降低，BDNF/TrkB信號(hào)通路活化被抑制，而抑制miR-204表達(dá)后，海馬組織中BDNF、p-TrkB及p-CREB水平升高；p-TrkB和p-CREB都是TrkB和CREB的活化形式，各組大鼠海馬組織內(nèi)TrkB和CREB表達(dá)均無(wú)明顯變化。為了進(jìn)一步探討miR-204與BDNF的關(guān)系，本研究進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示miR-204是BDNF負(fù)調(diào)控分子。提示抑制miR-204表達(dá)可引起B(yǎng)DNF的高表達(dá)，從而激活BDNF/TrkB信號(hào)通路，保護(hù)海馬神經(jīng)元，改善IUGR大鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。但本研究未設(shè)置miR-204表達(dá)促進(jìn)組，因此無(wú)法完全確定機(jī)制，只能提出miR-204的作用機(jī)制可能是與靶向調(diào)控靶向BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)。

圖5 BDNF/TrkB信號(hào)通路活化機(jī)制圖

綜上所述，抑制miR-204可改善IUGR新生大鼠學(xué)習(xí)及記憶功能，其作用機(jī)制可能與靶向激活BDNF/TrkB信號(hào)通路有關(guān)，本研究為miR-204可能作為IUGR的潛在標(biāo)志物或者治療靶點(diǎn)提供了一個(gè)強(qiáng)有力的依據(jù)。