任小彤，彭婧，韓曉，王軍，何非

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院葡萄與葡萄酒研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部葡萄酒加工重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100083）

葡萄果實(shí)中的酚類物質(zhì)（Phenolics）主要分布在果皮和種子中，包括類黃酮物質(zhì)（Flavonoids）和非類黃酮酚類物質(zhì)（Non-flavonoids）兩大類。其中，類黃酮物質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)骨架為C6-C3-C6，包括花色苷（Anthocyanins）、黃酮醇（Flavonols）和黃烷醇（Flavanols）類物質(zhì)，在植物體內(nèi)通過苯丙烷-類黃酮代謝合成途徑產(chǎn)生。導(dǎo)致釀酒葡萄中的類黃酮物質(zhì)產(chǎn)生差異的內(nèi)在因素是葡萄本身的遺傳特性；外在因素主要指環(huán)境因素[1]和栽培實(shí)踐，也就是風(fēng)土。一般來說，廣義的風(fēng)土包括氣候、土壤及人為栽培因素等；狹義的風(fēng)土則主要指前兩者，是產(chǎn)區(qū)風(fēng)格最重要的體現(xiàn)。釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的光照、熱量、地形、降雨和土壤等因素共同構(gòu)成風(fēng)土條件[2]。因風(fēng)土條件不同，同一品種的葡萄果實(shí)類黃酮物質(zhì)的組成和含量在不同地塊中也有可能存在差異。

我國新疆瑪納斯、山東蓬萊和云南德欽3個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的‘赤霞珠’果實(shí)和葡萄酒中總酚、總類黃酮、總黃烷醇含量不同，并且花色苷種類及含量隨海拔升高呈上升的趨勢[3]。氣溫、光照、水分和土壤等都會對類黃酮物質(zhì)產(chǎn)生影響。日本的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在成熟早期，夜間高溫條件下葡萄漿果中花色苷生物合成會受到抑制，這可能是由于花色苷生物合成基因的表達(dá)水平較低以及花色苷生物合成酶活性較低所致[4]。研究發(fā)現(xiàn)，將漿果進(jìn)行冷卻會導(dǎo)致(-)-表沒食子酸兒茶素延伸亞基的比例顯著增加[5]。光照對葡萄果實(shí)中類黃酮代謝產(chǎn)物的合成積累量和該路徑的碳流向有影響，進(jìn)而使生成的二羥基產(chǎn)物和三羥基產(chǎn)物比例產(chǎn)生差異[6]。光照對黃酮醇的積累會產(chǎn)生影響。在德國蓋森海姆葡萄園中的研究發(fā)現(xiàn)，黃酮醇合酶和黃酮醇糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)在遮陰果穗中幾乎不存在，但在重新光照后表達(dá)增加，漿果的黃酮醇含量也增加了很多[7]；另有研究發(fā)現(xiàn)，缺水誘導(dǎo)F3'5'H（類黃酮3'5'-羥化酶）基因表達(dá)，使得三羥基花色苷含量增高[8]。在澳大利亞南部5個(gè)商業(yè)葡萄園3年的試驗(yàn)表明，土壤特性是通過對葡萄樹的冠層、產(chǎn)量和漿果大小的影響來間接影響漿果的成分[9]。

試驗(yàn)選擇在寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)兩個(gè)酒莊的4個(gè)地塊開展，采集商業(yè)采收期的‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄漿果，對果皮及種子中的類黃酮類物質(zhì)進(jìn)行檢測，探究在不同風(fēng)土條件下葡萄漿果中類黃酮類物質(zhì)的差異以及造成差異的原因，以期為該產(chǎn)區(qū)葡萄酒特征風(fēng)格的塑造和小產(chǎn)區(qū)的劃分提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及氣候、土壤數(shù)據(jù)的收集

本試驗(yàn)選擇的葡萄園位于寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)，屬于溫帶大陸性氣候，有志輝源石酒莊的志輝地塊和仁益源酒莊的華西、金山和高家閘共4個(gè)地塊，地塊和品種信息如表1所示。葡萄樹整形方式均為改良VSP樹形，即“廠”形，自根苗，南北行向，短枝修剪，留梢量為每株12～15條，留果量為每梢1～2穗。病蟲害處理及施肥量均根據(jù)當(dāng)?shù)貥?biāo)準(zhǔn)制定，其他均采用常規(guī)的田間管理。

表1 不同地塊基本信息Table 1 Basic information of different parcels

采集2020年商業(yè)采收期的‘霞多麗’和‘赤霞珠’葡萄果實(shí)。每個(gè)品種在每個(gè)地塊采集紅、黃、藍(lán)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在園中隨機(jī)選取3行相鄰葡萄植株，每行選擇15株樹，隨機(jī)分為紅、黃、藍(lán)各5株，3行共選擇45株。上午10:00以前采樣，采用“五點(diǎn)取樣法”。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)采集300粒，共900粒。每個(gè)重復(fù)中100粒漿果用于理化指標(biāo)檢測，剩余樣品在液氮中冷凍后置于﹣80 ℃的冰箱中貯存，用于類黃酮類物質(zhì)檢測。

氣象數(shù)據(jù)在中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http://data.cma.cn/）采集。4個(gè)地塊與氣象站的距離分別為：金山：30.1 km；華西：22.5 km；志輝：20 km；高家閘：16.8 km。地理位置如圖1所示。

圖1 四個(gè)地塊與氣象站地理位置分布Figure 1 Geographical distribution of four parcels and weather station

2020年，在葡萄的生長季（4—9月）內(nèi)，總降雨量為1835 mm，有效積溫為1866.5 ℃，2011—2020年生長季平均有效積溫為1887.3 ℃。在6—8月葡萄生長期日最高溫度為20～38 ℃，成熟期日均溫為15～28 ℃，最適溫度在17～24 ℃之間[10]，說明氣溫適宜葡萄生長，降水也集中在這一時(shí)期。

土壤樣品在每個(gè)地塊于采樣所在的葡萄種植行間的行前、中、后共選取3個(gè)采樣點(diǎn)收集，進(jìn)行土壤相關(guān)指標(biāo)：全氮、全磷、全鉀、有機(jī)質(zhì)含量，pH、電導(dǎo)率（EC）、陽離子交換容量（CEC）和顆粒大小的測定。志輝地塊的全磷和全鉀含量均顯著高于其他地塊，而金山地塊的全磷含量和高家閘地塊的全鉀含量均顯著低于其余地塊。4個(gè)地塊的土壤EC值都在22～40 mS·m-1之間，說明土壤屬于非鹽堿土，對于有機(jī)質(zhì)和EC來說，各地塊之間無顯著性差異。所有地塊的土壤pH值均在8.4以上，為堿性土。土壤CEC值范圍為3.5～8.5 cmol·kg-1，大小為高家閘＞金山＞志輝＞華西，說明高家閘和金山地塊的土壤肥力較高。土壤顆粒組成反映土壤砂粘性的程度，與植物生長關(guān)系非常密切[12]，4個(gè)地塊的土壤均屬于砂壤土。高家閘的土壤類型更偏向粘土，其次是金山地塊，再次是華西地塊，志輝的土壤偏向于砂土。

1.2 試劑與儀器

試劑：氫氧化鈉、酚酞、甲醇、乙酸鈉、間苯三酚、丙酮、抗壞血酸、鹽酸等均為分析純，購于天津化工廠；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）購于美國Sigma-Aldrich公司；D-葡萄糖酸內(nèi)酯購于上海Sangon Biotech公司；上機(jī)檢測流動相中的甲醇、甲酸、乙腈均為色譜級，購于美國Sigma-Aldrich公司；花色苷、黃酮醇及黃烷醇標(biāo)品購于法國中草藥（Extrasynthese）公司。

儀器：冷凍干燥機(jī)FD-1C-50，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL-5-A低溫離心機(jī)產(chǎn)于上海飛鴿儀器有限公司；美國安捷倫1200系列高效液相色譜儀串聯(lián)Bruker系列離子阱質(zhì)譜儀，并配有可變波長檢測器（VWD），色譜柱為Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；美國安捷倫1200系列高效液相色譜串聯(lián)三重四級桿（QqQ）質(zhì)譜儀，色譜柱為美國安捷倫科技有限公司Poroshell 120 EC-C18（150 mm×2.1 mm，2.7 μm）。

1.3 類黃酮類物質(zhì)的提取與檢測

參照陳為凱[13]的方法進(jìn)行果皮中花色苷和黃酮醇以及果皮和種子中黃烷醇的提取。將上述提取液在檢測前采用0.22 μm尼龍濾膜過濾，參照趙培汝[14]的方法進(jìn)行花色苷的檢測。花色苷及其衍生物的定量采用外標(biāo)法，外標(biāo)物為二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷，花色苷含量均以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷的含量計(jì)。參照陳為凱[13]的方法進(jìn)行黃酮醇和黃烷醇的檢測，黃酮醇定量采用外標(biāo)法，以楊梅酮-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、丁香亭-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)物；各類黃酮醇物質(zhì)以相應(yīng)外標(biāo)物的含量計(jì)，西伯利亞落葉松黃酮-3-O-葡萄糖苷使用異鼠李素-3-O-葡萄糖苷為外標(biāo)物進(jìn)行定量；黃烷醇定量分別以(+)-兒茶素、(+)-棓兒茶素以及(-)-表?xiàng)攦翰杷貫橥鈽?biāo)物，計(jì)算5種黃烷醇的含量。類黃酮類物質(zhì)的定性依據(jù)為本實(shí)驗(yàn)室所建立的葡萄與葡萄酒酚類物質(zhì)HPLC-UV-MS指紋譜庫[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差的計(jì)算；通過SPSS 22.0（IBM，USA）進(jìn)行單因素方差分析（Duncan，P＜0.05）；采用Simca 14.1進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地塊‘霞多麗’果實(shí)類黃酮物質(zhì)分析

在‘霞多麗’葡萄漿果中，兩個(gè)地塊中均檢測出12種黃酮醇單體和5種黃烷醇單體。從表2中可知，檢測出的黃酮醇類物質(zhì)為槲皮素類、山奈酚類和異鼠李素類等。兩個(gè)地塊中總黃酮醇含量無顯著差異，僅有高家閘地塊的異鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于志輝地塊。

表2 不同地塊‘霞多麗’葡萄果皮中的黃酮醇Table 2 The concentration of flavonols in 'Chardonnay' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

根據(jù)B環(huán)羥基取代的不同，F(xiàn)3'H（類黃酮3'-羥化酶）羥基取代黃烷醇有(+)-兒茶素和(-)-表兒茶素，F(xiàn)3'5'H羥基取代黃烷醇有(-)-表?xiàng)攦翰杷?。mDP（Mean Degree of Polymerization，平均聚合度）是黃烷醇類物質(zhì)的一個(gè)重要指標(biāo)，其計(jì)算公式是：mDP＝(延伸單元物質(zhì)的量＋末端單元物質(zhì)的量)/末端單元物質(zhì)的量。

從表3中可以看出，志輝地塊的葡萄漿果果皮中的原花色素的(-)-表兒茶素末端單元含量顯著高于高家閘地塊，而高家閘地塊的果皮mDP、果皮原花色素(-)-表?xiàng)攦翰杷啬┒藛卧?-)-表兒茶素沒食子酸酯末端單元含量顯著高于志輝地塊。

表3 不同地塊 ‘霞多麗’葡萄果皮及種子中的黃烷醇Table 3 The concentration of flavanols in 'Chardonnay' grape peels and seeds in different parcels mg·kg-1 FW

2.2 不同地塊‘赤霞珠’果實(shí)類黃酮物質(zhì)分析

在‘赤霞珠’葡萄漿果中，共檢測到14種花色苷單體、12種黃酮醇單體和5種黃烷醇單體。根據(jù)B環(huán)羥基取代的不同，花色苷可以被分為兩類：F3'H羥基取代花色苷（花青素類和甲基花青素類）和F3'5'H羥基取代花色苷（花翠素類、甲基花翠素類和二甲花翠素類）。二甲花翠素結(jié)構(gòu)中B環(huán)不含有鄰位羥基，對酶類和金屬離子的氧化不敏感，因此具有較強(qiáng)的抗氧化力。類似地，甲基花青素也有較強(qiáng)的抗氧化力[16]。

根據(jù)表4可知，華西地塊的二甲花翠素-3-O-咖啡?；ㄉ蘸匡@著高于志輝和金山地塊；金山地塊的甲基花翠素-3-O-香豆?；ㄉ蘸匡@著高于志輝和華西地塊。

表4 不同地塊‘赤霞珠’葡萄果皮中的花色苷Table 4 The concentration of anthocyanins in 'Cabernet Sauvignon' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

從表5中可知，金山地塊的楊梅酮-3-O-葡萄糖醛酸苷含量顯著高于華西地塊的含量，并且金山地塊的槲皮素-3-O-蕓香糖苷含量顯著高于其余地塊的含量；志輝地塊的楊梅酮-3-O-半乳糖苷和槲皮素-3-O-葡萄糖苷含量顯著低于華西和金山地塊的含量；華西地塊的山奈酚-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于志輝地塊，而華西地塊的異鼠李素-3-O-葡萄糖苷和丁香亭類-3-O-葡萄糖苷含量顯著高于其余兩個(gè)地塊。

表5 不同地塊‘赤霞珠’葡萄果皮中的黃酮醇Table 5 The concentration of flavonols in 'Cabernet Sauvignon' grape peels in different parcels mg·kg-1 FW

由表6可知，延伸單元的含量是果皮和種子中總黃烷醇含量的主要組成部分。對于‘赤霞珠’來說，華西地塊的果皮總游離單體和總延伸單元的含量均顯著低于其余地塊的含量；志輝地塊的果皮總末端單元的含量顯著低于華西和金山地塊。種子的總游離單體、總末端單元、總延伸單元含量和mDP在三個(gè)地塊之間均無顯著性差異。華西地塊的果皮黃烷醇總含量顯著低于其余兩個(gè)地塊的含量，金山地塊的種子黃烷醇總含量顯著高于志輝地塊的含量。對于黃烷醇總含量和類黃酮總含量來說，均為金山地塊的含量顯著高于志輝地塊的含量。

表6 不同地塊 ‘赤霞珠’葡萄果皮及種子中的黃烷醇Table 6 The concentration of flavanols in 'Cabernet Sauvignon' grape peels and seeds in different parcels mg·kg-1 FW

2.3 不同地塊兩品種果實(shí)的特征性差異化合物分析

為了探究‘霞多麗’及‘赤霞珠’漿果中類黃酮類物質(zhì)的特征差異性化合物，用相應(yīng)地塊的花色苷、黃酮醇和黃烷醇物質(zhì)為判別指標(biāo)，進(jìn)行有監(jiān)督的正交偏最小二乘判別分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2 葡萄果實(shí)中類黃酮物質(zhì)含量的OPLS-DA模型分析Figure 2 The OPLS-DA models analysis based on the flavonoids compounds in grape fruits

采用了OPLS-DA模型進(jìn)行分析，‘霞多麗’中提取到的前兩個(gè)主成分解釋了總方差的83.5%，說明這兩個(gè)主成分可以很好地將兩個(gè)地塊分開。從圖2A中可以看出，位于X正半軸的是高家閘，而志輝位于X軸的負(fù)半軸。結(jié)合圖2B可以看出，志輝和高家閘地塊都有一定種類的黃酮醇和黃烷醇類特征性差異物質(zhì)?！嘞贾椤刑崛〉降那皟蓚€(gè)主成分解釋了總方差的60.6%，能夠較好地代表原始數(shù)據(jù)。從圖2C中可以看出，志輝位于X軸正半軸、Y軸負(fù)半軸，華西位于X軸的負(fù)半軸、Y軸負(fù)半軸，而金山位于X軸正半軸、Y軸正半軸，3個(gè)地塊被較好的分開了。結(jié)合圖2D可知，志輝地塊的主要特征差異性化合物為黃烷醇類，華西地塊含有較多的黃酮醇類化合物，而金山地塊含有較多的花色苷類物質(zhì)。通過VIP預(yù)測值表，篩選出VIP＞1的特征差異化合物，如表7所示。

表7 通過OPLS-DA模型識別的主要差異化合物Table 7 Primary biomarker compounds identified by the OPLS-DA mode

3 討論與結(jié)論

對近十年的月平均降水量和月平均溫度進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，2020年的數(shù)據(jù)處于近十年數(shù)值波動范圍內(nèi)，說明2020年份具有典型性。志輝、華西、金山和高家閘4個(gè)地塊都處于賀蘭山東麓，但與山體距離不同[17]，金山地塊距離賀蘭山最近，易受山上冷氣流的影響，因此氣溫相對較低；高家閘地塊因距山較遠(yuǎn)而氣溫較高，志輝和華西地塊的氣溫居中。

黃酮醇合成發(fā)生在葡萄開花前后和漿果成熟期間[18]。白葡萄的黃酮醇含量以槲皮素類為主[19]，異鼠李素類通常作為非常少量的化合物出現(xiàn)[20]，本試驗(yàn)‘霞多麗’的數(shù)據(jù)與此規(guī)律相符。另有研究表明，紅色品種的黃酮醇含量以楊梅酮和槲皮素為主，其中歐亞種含量最多的是槲皮素，與本研究結(jié)果相一致[21]。盡管‘霞多麗’葡萄中的黃酮醇含量在高家閘地塊和志輝地塊中并未表現(xiàn)出顯著差異，但是高家閘地塊有增加槲皮素類和異鼠李素類物質(zhì)的趨勢，而志輝地塊有更多的山奈酚類黃酮醇物質(zhì)。研究顯示，黃酮醇中蘆丁的含量與土壤中的粘土含量呈正相關(guān)[22]，這可能是‘赤霞珠’在粘土含量更高的金山地塊有更多的槲皮素-3-O-蕓香糖苷的原因。高溫可能導(dǎo)致葡萄中的黃酮醇化合物降解[23]，志輝地塊的溫度高于華西和金山地塊，這可能是‘赤霞珠’的黃酮醇總含量在志輝地塊顯著低于華西和金山地塊的原因。另外，黃酮醇濃度與光照參數(shù)呈顯著正相關(guān)[24]，研究發(fā)現(xiàn)光照是葡萄漿果黃酮醇合成的必要條件，編碼黃酮醇合酶的基因在遮蔭果實(shí)中表達(dá)大大降低[25]，而太陽輻射會增加槲皮素、山奈酚和楊梅酮的濃度[26]。結(jié)合土壤數(shù)據(jù)，金山地塊的土壤CEC值較高，而華西地塊的較低，因此金山地塊的土壤較肥沃、葉片生長較密集，這可能導(dǎo)致果實(shí)的遮陰較多，從而接受的光照強(qiáng)度較低，所以‘赤霞珠’在金山地塊的黃酮醇類物質(zhì)濃度較低，而在華西地塊濃度較高。

‘赤霞珠’種子中的黃烷-3-醇的含量高于果皮中的，這與已有研究結(jié)果一致[21]。結(jié)合土壤數(shù)據(jù)，高家閘地塊的土壤全氮和CEC值均顯著高于志輝地塊，說明其土壤可能更有利于葡萄樹體和漿果的生長[27-28]，因此高家閘地塊葡萄的葉片生長較密集，遮陰程度較高、光照較少。相反，志輝地塊的遮陰程度則較低、光照較多，研究發(fā)現(xiàn)，在黑暗條件下，(-)-表兒茶素的含量下降[29]，此外，對于果皮來說，遮陰會減少末端亞基的含量[30]，高家閘地塊遮陰較多、光照較少，這可能是‘霞多麗’在該地塊的果皮(-)-表兒茶素末端單元濃度低于志輝地塊的原因。另外，研究發(fā)現(xiàn)，溫度降低會導(dǎo)致3'5'-羥化原花色素的比例增加[31-32]，金山地塊溫度低于華西地塊，這可能導(dǎo)致了金山地塊‘赤霞珠’的果皮游離(-)-表?xiàng)攦翰杷貪舛容^高。土壤中的磷含量與兒茶素含量呈正相關(guān)[22]，志輝地塊的全磷含量顯著高于其余地塊，可能促進(jìn)了‘赤霞珠’在該地塊的果皮游離(+)-兒茶素的積累。研究表明，隨著熱量的積累，末端亞基的積累可能有所減少[33]，高家閘地塊的溫度較高，這可能是‘霞多麗’在該地塊的果皮中總末端單元濃度顯著低于志輝地塊的原因。另外，熱量積累最多的水果也具有最高的原花色素mDP[33]，因此‘霞多麗’在高家閘地塊的果皮原花色素mDP高于志輝地塊；同理，‘赤霞珠’在志輝地塊的果皮原花色素mDP也顯著高于華西和金山地塊。

在3個(gè)地塊的‘赤霞珠’中，均為花青素類花色苷含量最少，而二甲花翠素類含量最多，這與已有研究結(jié)果一致[23]?；ㄉ盏臐舛入S著水分的減少而增加，也隨著漿果變小而增加[34]。對意大利東北部10年生‘美樂’葡萄的研究發(fā)現(xiàn)，受到水分脅迫的葡萄果實(shí)在收獲時(shí)的總花色苷含量連續(xù)兩年增加[35]。結(jié)合土壤分析可知，華西地塊的土壤偏向砂土，水分含量較低，加之華西地塊的‘赤霞珠’果實(shí)的粒質(zhì)量和粒體積均顯著低于金山地塊，可能導(dǎo)致了華西地塊的二甲花翠素-3-O-咖啡酰葡萄糖苷濃度較高。有研究發(fā)現(xiàn)，高溫降低了F3'5'H取代的花色苷濃度，并且甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷會由于高溫而減少[32]，此外，在夜間高溫下，花青素、花翠素和甲基花翠素類花色苷占總花色苷含量的比例會大大降低[36]。金山地塊溫度較低，這可能導(dǎo)致了‘赤霞珠’在該地塊的甲基花翠素-3-O-香豆酰葡萄糖苷的濃度較高。

總體來說，寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)的不同地塊對釀酒葡萄果實(shí)的類黃酮物質(zhì)的濃度和組成產(chǎn)生了影響，對于‘霞多麗’葡萄，溫度和土壤肥力較低的志輝地塊可以賦予果實(shí)更多的黃烷醇類物質(zhì)，而土壤較粘和土壤肥力較高的高家閘地塊可以賦予其更多的黃酮醇類物質(zhì)。對于‘赤霞珠’葡萄，不同地塊對黃酮醇和花色苷類物質(zhì)影響更大，華西地塊的‘赤霞珠’中特征性差異化合物以黃酮醇類為主，而金山地塊的‘赤霞珠’則含有更多的花色苷類化合物。