許璐凡 王 軍 李詩夢 惠志遠 曹子敏 楊 磊

(1 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院針灸科，北京，100700； 2 北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院眼科，北京，100078)

焦慮障礙是一種以焦慮情緒為主要表現(xiàn)的神經癥，常表現(xiàn)為持續(xù)的緊張不安、無明顯原因和固定內容的擔心，往往伴有自主神經功能障礙[1-2]。流行病學調查顯示，我國焦慮障礙的發(fā)病率高達4.98%，已成為患病率最高的精神障礙疾病[3]。目前臨床治療中，抗焦慮藥物可有效緩解焦慮癥狀，但也帶來一系列不良反應，使其臨床應用受到限制。鑒于西藥治療的局限性，針刺治療具有整體調節(jié)的優(yōu)勢，療效確切且不良反應少[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，基于“心腦同調”理論針刺治療焦慮障礙療效顯著，但針刺治療焦慮障礙的作用機制目前尚未闡明[5-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF)-酪氨酸激酶受體B(Tyrosine Receptor Kinase B，TrkB)信號通路在神經結構與功能的可塑性調節(jié)中起重要作用，該信號通路的異常表達與焦慮障礙的發(fā)病密切相關[8-9]。本研究從“心腦同調”角度取穴，觀察電針對焦慮模型大鼠行為學及BDNF-TrkB信號通路的影響，探討針刺治療焦慮障礙的療效及可能作用機制，為臨床研究提供新的思路與實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用32只8周齡雄性SD大鼠，體質量(200±20)g，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司[動物許可證編號：SCXK(京)2019-0010]。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物房，室溫(23±2)℃，濕度(50±1)%，12 h明暗交替環(huán)境。實驗程序遵循《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關規(guī)定，且經北京中醫(yī)藥大學動物使用和管理委員會批準(倫理審批號：BUCM-4-2019110601-4088)。

1.1.2 試劑與儀器 華佗牌電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，型號：SDZ-IIB型)；毫針(北京中研太和醫(yī)療器械有限公司，規(guī)格：0.25 mm×13 mm)；高架十字迷宮(上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XG201)；曠場實驗箱(上海欣軟信息科技有限公司，型號：XR-XZ301)；酶標儀(無錫華衛(wèi)朗德儀器有限公司，型號：DR-200BS)；光學顯微鏡(重慶奧特光學儀器有限公司，型號：BK-FL4)；BDNF酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號：20191112)；BDNF抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：20191104)；TrkB抗體(北京博奧森生物技術有限公司，批號：20191108)；水合氯醛(上海源葉生物科技有限公司，貨號：Z25A10Y86923)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將32只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、電針組、假針組，每組8只。各組大鼠在實驗前適應性飼養(yǎng)7 d，在此期間實驗者每日撫摸大鼠2 min。參照文獻[10]，采用國際通用的慢性不可預見性應激刺激法制備焦慮大鼠模型。應激刺激法包括6種：24 h禁食禁水、24 h高密度居住、30 min束縛、10 min夾尾、暖泳(31 ℃，15 min)和冷泳(18 ℃，10 min)，足底電擊15 min。每日隨機給予1種刺激，相同刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)15 d。正常組每日抓取，不予以造模，其余各組大鼠均接受應激刺激。

1.2.2 干預方法 電針組于應激刺激前1 h進行電針干預。根據《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜[11]，將大鼠用鼠套固定后，選取“百會”“風府”“神門”“內關”進行針刺?！鞍贂毕蚝笃酱? mm，“風府”向后下方斜刺1 mm，“神門”“內關”直刺1 mm?！鞍贂薄帮L府”為一組，“神門”“內關”為一組，分別連接電針治療儀。電針參數(shù)：疏密波，強度為0.15 mA，頻率為20 Hz，留針20 min。于造模當天開始治療，隔日1次，“神門”“內關”每次取單側穴，左右交替，持續(xù)15 d。假針組參照電針組選穴，于相應穴位旁1 mm非經非穴處淺刺，不連接電針治療儀，治療時間與留針時間同電針組。模型組大鼠于相同時間以鼠套固定20 min，此外不作任何治療。正常組不做任何治療。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 高架十字迷宮實驗 于實驗第15天，采用高架十字迷宮實驗檢測各組大鼠的焦慮水平。將大鼠置于高架十字迷宮中央區(qū)且面向開放臂，采用supermaze軟件記錄5 min內大鼠的活動情況，包括進入開臂次數(shù)(OE)、開臂停留時間(OT)、進入閉臂次數(shù)(CE)及閉臂停留時間(CT)，根據上述指標計算進入開臂次數(shù)百分比(OE%)：OE%=OE/(OE+CE)×100%，開臂停留時間百分比(OT%)：OT%=OT/(OT+CT)×100%。每只大鼠測試前均用20%乙醇清除高架十字迷宮的殘留氣味。

1.2.3.2 曠場實驗 各組大鼠于實驗第15天進行曠場實驗。曠場實驗箱為立方形敞箱，80 cm×80 cm×40 cm，將曠場箱底部劃分為面積相等的25個方格。將大鼠放置于箱底部中央方格內，運用supermaze軟件記錄5 min內大鼠的探究行為與運動情況。以大鼠穿越曠場箱底面的格數(shù)(四爪均進入的方格數(shù))記錄為水平運動次數(shù)，以大鼠雙前肢離開曠場箱底的直立次數(shù)記錄為垂直運動次數(shù)。每只大鼠測試前均用20%乙醇清除曠場實驗箱的殘留氣味。

1.2.3.3 ELISA檢測血清BDNF水平 實驗第15天造模與治療結束后，以10%水合氯醛按350 mL/kg劑量腹腔注射麻醉各組大鼠，經腹主動脈采血，血液靜置后離心(4 ℃，3 000 r/min，15 min，離心半徑10 cm)，取上清置于-80 ℃保存。采用ELISA技術檢測各組大鼠血清BDNF水平，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測分析。

1.2.3.4 免疫組織化學法檢測前額葉皮質BDNF、TrkB蛋白表達量 取血后，快速斷頭剝離腦組織，分離前額葉皮質，以4%多聚甲醛溶液固定。常規(guī)脫水、包埋、切片，并嚴格按照免疫組織化學試劑盒說明書進行制片。免疫組織化學染色陽性表達為棕黃色顆粒。在400倍顯微鏡下進行圖像采集，采用Image J圖像分析軟件對BDNF、TrkB蛋白表達量進行分析，以平均光密度值表示。

2 結果

2.1 宏觀表征 正常組大鼠精神良好，皮毛潤澤，反應敏捷，飲食正常，多洗臉、梳頭等修飾行為；模型組大鼠毛色欠光澤，飲水迫切，大便色黑干燥，排便粒數(shù)減少，有攻擊行為；電針組大鼠精神漸佳，毛色較為光澤，飲食漸增，行動較靈敏，修飾行為增多；假針組大鼠飲水增加、攝食下降、大便干燥。

2.2 大鼠高架十字迷宮實驗 與正常組比較，模型組大鼠OE%、OT%值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)；與模型組比較，電針組OE%、OT%值明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，假針組OE%、OT%值有升高趨勢，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05，P>0.05)；與電針組比較，假針組OT%值明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，OE%值有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。各組大鼠的高架十字迷宮運動軌跡顯示，與正常組比較，模型組大鼠在開臂區(qū)的運動軌跡明顯減少；與模型組比較，電針組大鼠在開臂區(qū)的運動軌跡明顯增加；與電針組比較，假針組大鼠在開臂區(qū)的運動軌跡明顯減少。見圖1。

表1 各組大鼠進入開臂次數(shù)百分比、開臂停留時間百分比結果比較

圖1 各組大鼠高架十字迷宮實驗軌跡

2.3 大鼠曠場實驗 與正常組比較，模型組水平得分、垂直得分明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，電針組水平得分、垂直得分明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)，假針組水平得分、垂直得分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，P>0.05)；與電針組比較，假針組水平得分、垂直得分顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。見表2。各組大鼠曠場實驗軌跡顯示，與正常組比較，模型組大鼠的活動軌跡明顯減少；與模型組比較，電針組大鼠的活動軌跡明顯增加；與電針組比較，假針組大鼠的活動軌跡明顯減少。見圖2。

表2 各組大鼠曠場實驗結果比較分，n=8)

圖2 各組大鼠曠場實驗軌跡

2.4 各組大鼠血清BDNF水平 模型組大鼠血清BDNF水平較正常組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；電針組大鼠血清BDNF水平較模型組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；假針組大鼠血清BDNF水平較模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；假針組血清BDNF水平較電針組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清BDNF水平比較

2.5 各組大鼠前額葉皮質BDNF、TrkB蛋白表達 BDNF、TrkB陽性反應物呈棕黃色，主要位于細胞膜表面和細胞質。見圖3～4。與正常組比較，模型組大鼠前額葉皮質BDNF、TrkB平均光密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.01)；與模型組比較，電針組大鼠前額葉皮質BDNF、TrkB平均光密度明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，假針組大鼠前額葉皮質BDNF、TrkB平均光密度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，P>0.05)；與電針組比較，假針組大鼠前額葉皮質BDNF、TrkB平均光密度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。見表4。

圖3 各組大鼠前額葉皮質BDNF表達(免疫組織化學染色，×400，箭頭示BDNF陽性細胞)

圖4 各組大鼠前額葉皮質TrkB表達(免疫組織化學染色，×400，箭頭示TrkB陽性細胞)

表4 各組大鼠額葉BDNF、TrkB平均光密度比較

3 討論

中醫(yī)學認為“焦慮障礙”屬于“郁癥”“不寐”“虛煩”等疾病范疇，多由于素體虛弱，七情內傷，或肝失疏泄，氣機郁滯，或思慮過度，耗傷心神[12]。該病病機為神機被擾，病位多涉及心、腦、肝、脾，其中又與心、腦關系尤為密切。心藏神，腦為元神之府，人的精神、情志活動由心神與腦神共同支配，若心神被擾、元神失用則會出現(xiàn)精神、情志方面的異常。焦慮障礙存在心腦共患的特點，“心腦同調”為本病治療的關鍵[13]。本實驗基于前期臨床研究[5-7]，選取百會、風府治“腦”，神門、內關調“心”?！鹅`樞·衛(wèi)氣》曰：“頭氣有街……氣在頭者，止之于腦?！薄鹅`樞·海論》曰：“腦為髓之海，其輸上在于其蓋(百會穴)，下在風府。”故治“腦”取百會、風府符合氣街、四海理論。根據經絡理論，風府為督脈“入腦”之穴，百會為督脈“出腦”之穴，二穴共同調節(jié)腦髓，奉養(yǎng)腦神。神門為手少陰心經的原穴，是心原氣經過和留止之處，《靈樞·九針十二原》云：“五臟有疾也，當取之十二原?！眱汝P為手厥陰心包經絡穴，《百證賦》中提及內關有“掃盡胸中之苦悶”之效，提示內關有治療神志疾病的功效。二穴與心關系密切，具有寧心安神、寬胸解郁之效。

合適的動物模型是研究焦慮障礙發(fā)病及治療機制的基礎，慢性不可預見性應激模型是目前國際通用的焦慮障礙的造模方法之一。高架十字迷宮實驗和曠場實驗是動物焦慮行為學研究中較為經典的測試。高架十字迷宮實驗利用大鼠對新異環(huán)境的探究特性、對高懸開放環(huán)境的恐懼及其趨暗性，形成探究與規(guī)避的行為沖突，從而評估大鼠的焦慮程度[14]。大鼠穿梭開放臂的頻次及時間的所占百分比表達了大鼠的焦慮狀態(tài)存在與否及其水平高低。實驗結果表明，模型組大鼠OE%和OT%值顯著降低，表現(xiàn)出明顯的焦慮行為，而“心腦同調”法電針顯著提高焦慮大鼠的OE%和OT%值，明顯改善大鼠的焦慮行為，且優(yōu)于假針組。曠場實驗用于評估嚙齒類動物的自發(fā)活動與探究行為，結果表明，焦慮模型大鼠水平得分與垂直得分顯著降低，自發(fā)活動與探究行為明顯受到抑制。“心腦同調”法電針顯著增加大鼠的自發(fā)活動與探究行為，且效果明顯優(yōu)于假針組。通過以上行為學評價結果證實本實驗造模成功，“心腦同調”法電針對焦慮大鼠行為學有較好的干預調節(jié)效應。

焦慮障礙的發(fā)病機制目前尚未闡明，其中神經營養(yǎng)學說獲得較廣泛接受。該學說認為神經網絡對外界環(huán)境變化的適應性降低是導致情緒異常的主要原因，而神經營養(yǎng)因子可增強神經可塑性，維持中樞神經系統(tǒng)的內穩(wěn)態(tài)，從而適應外界環(huán)境變化[15]。BDNF是一種廣泛分布于中樞神經系統(tǒng)的神經營養(yǎng)因子，以前額葉皮質和海馬內水平最高，在神經元的分化、增殖、營養(yǎng)及再生修復中起重要的作用，并且與情感調節(jié)關系密切[16-17]。BDNF通過與其特異性受體TrkB結合，引起TrkB同源二聚體化，誘導結合部位自磷酸化，按次序激活特定的蛋白質和酶，啟動下游信號轉導通路，從而發(fā)揮神經保護和神經營養(yǎng)等生物學效應，增強神經可塑性[18]。目前越來越多的證據表明BDNF-TrkB信號通路的異常表達與焦慮障礙的發(fā)生關系密切。動物實驗表明，慢性束縛應激下，大鼠出現(xiàn)明顯焦慮抑郁樣行為，海馬內BDNF、TrkB陽性細胞數(shù)及蛋白表達明顯下降[19]。有研究證實，大腦中的BDNF可透過血腦屏障進入循環(huán)系統(tǒng)，且腦內BDNF水平與血清BDNF水平變化具有一致性[20]。臨床研究表明，與健康者比較，廣泛性焦慮障礙患者血清BDNF水平明顯降低，經抗焦慮治療后患者焦慮情緒逐漸緩解，血清BDNF水平較前明顯升高[21]。由此可見，BDNF-TrkB信號通路與焦慮障礙的病理生理過程密切相關。前額葉皮質是腦內參與情緒調節(jié)的關鍵腦區(qū)，BDNF及其受體TrkB在前額葉皮質中有較高的表達。本實驗研究結果提示，焦慮模型大鼠血清BDNF水平、前額葉皮質BDNF、TrkB表達量明顯降低，而“心腦同調”法電針可糾正這一異常變化，且電針組調節(jié)效果明顯優(yōu)于假針組。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)焦慮模型大鼠前額葉皮質BDNF-TrkB信號通路異常表達，可能與焦慮障礙的發(fā)生發(fā)展密切相關?！靶哪X同調”法電針可能通過調控該信號通路，調節(jié)神經結構與功能的可塑性，緩解大鼠的焦慮行為，從而達到對焦慮障礙的治療作用。本研究為基于“心腦同調”理論針刺治療焦慮障礙的機制研究提供了實驗依據，后續(xù)我們將進一步探究焦慮障礙的發(fā)病機制及針刺抗焦慮的作用機制，為臨床治療焦慮障礙提供新的靶點與思路。