馬若婷，孫佳楠，趙生俊，張海英,3

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，2新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥學(xué)部，3新疆中藥炮制研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830000)

阿魏(Ferula.)為傘形科屬種植物的樹脂，具有消食、化癥、散痞、殺蟲的功效，臨床多用于肉食積滯、瘀血癥瘕、腹中痞塊、蟲積腹痛的治療[1]?！缎陆参镏尽肥蛰d有17種香阿魏，其中荒地阿魏(Ferulasyreitschikowii)、多傘阿魏(Ferulafeurlaeoides)、山地阿魏(Ferulaakitschkensis)、準(zhǔn)噶爾阿魏(Ferulasoongarica)等4種香阿魏分布較廣，蘊(yùn)藏量豐富，具有一定的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤。傳統(tǒng)的宮頸癌治療手段主要依靠手術(shù)、化療和放療，在殺滅腫瘤細(xì)胞的同時(shí)會(huì)對(duì)正常人體產(chǎn)生極大的毒副作用[2-3]，近些年來中藥抗腫瘤作用或聯(lián)合中藥治療腫瘤成為抗癌研究的熱點(diǎn)。在國外有多篇文獻(xiàn)報(bào)道阿魏屬植物用于宮頸癌的治療，Jian[4]等從阿魏(Feruladissecta)的根中分離出的兩個(gè)新倍半萜苯甲酸衍生物syreiteate A和syreiteate B，對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞有較強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制作用。Zhang[5]等研究發(fā)現(xiàn)從阿魏根中分離得到的倍半萜類化合物TAW，對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞有生長(zhǎng)抑制作用，作用機(jī)制包含誘導(dǎo)細(xì)胞胞吞和自噬。本課題組研究發(fā)現(xiàn)[6-8]，阿魏對(duì)宮頸癌細(xì)胞及動(dòng)物模型均有抗腫瘤作用，且抑制宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲。本研究采用體外細(xì)胞與體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合，探究新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)宮頸癌細(xì)胞活性的抑制作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料荒地阿魏(Ferulasyreitschikowii)、多傘阿魏(Ferulaferulaeoides)、山地阿魏(Ferulaakitschkensis)、準(zhǔn)噶爾阿魏(Ferulasoongarica)于2021年5月分別采集于烏魯木齊市米東區(qū)、石河子市、托里縣、塔城北山。均由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院李永和主任中藥師鑒定，為傘形科阿魏屬植物的根，結(jié)果與《中國植物志》相符。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器ZHJH-C1112B超凈工作臺(tái)(中國上海智誠)；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；IX71-12FL/PH倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；TGL-16B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn))；S-79943MULTISKAN酶標(biāo)儀(Thermo公司)；貝克曼AU5800全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司)；流式細(xì)胞檢測(cè)儀(美國BD公司)。

1.3 試藥MTT(美國Sigma公司，批號(hào)EZ6789D144)；胎牛血清(FBS)(美國Sigma公司，批號(hào):BCBZ5164)；凋亡試劑盒(美國BD公司，批號(hào)：1182811)；順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)601210205)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測(cè)定試劑盒(貝克曼庫爾特試驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司，批號(hào)AUZ9460)；天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒(貝克曼庫爾特試驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司，批號(hào)AUZ9244)；胱抑素C(CysC)測(cè)定試劑盒(邁克生物股份有限公司，批號(hào)0821031)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞健康KM雌性小鼠，體重18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0003)。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室，明暗交替，動(dòng)物自由飲水進(jìn)食。小鼠宮頸癌U14細(xì)胞、人宮頸癌Hela細(xì)胞均購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。

1.5 新疆4種阿魏乙醇提取物的制備將新疆4種阿魏的根切片，用5倍量的95%酒精將阿魏根回流提取2 h，過濾，重復(fù)3次，將3次過濾液合并，減壓濃縮，得到4種阿魏乙醇提取物的黑色稠浸膏，荒地阿魏、多傘阿魏、山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏的浸膏得率分別為15.1%、28.4%、30.2%、26.7%。

1.6 指標(biāo)的測(cè)定

1.6.1 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用 將細(xì)胞分為空白組、模型組以及新疆4種阿魏給藥組。將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Hela細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞混懸液的濃度到2×105個(gè)/mL，于96孔板中培養(yǎng)24 h，取1 g新疆4種阿魏乙醇提取物浸膏，DMSO稀釋至10 mL至完全溶解，再吸取相應(yīng)劑量的藥物與細(xì)胞培養(yǎng)液配制為300、150、75、37.5、18.75和9.375 μg/mL 6個(gè)濃度，每孔內(nèi)添加100 μL，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，空白組不添加液體，模型組是相同體積的10%FBS完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)于CO2培養(yǎng)箱中。24 h后棄去96孔板上清液，將 MTT試劑100 μL加至96孔板，孵育4 h，每孔加入150 μLDMSO，用酶標(biāo)儀(490 nm)檢測(cè)吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。采用Graphpa Prism 5軟件計(jì)算各組IC50。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。抑制率(%)=(模型組OD值-給藥組OD值)/(模型組OD值-空白組OD值)×100%。

1.6.2 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的凋亡作用 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的宮頸癌Hela細(xì)胞消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞混懸液的濃度到2×105個(gè)/mL，于6孔板中培養(yǎng)24 h，給藥新疆4種阿魏乙醇提取物75 μg/mL，每孔內(nèi)添加2 mL，藥物作用24 h后，消化收集細(xì)胞并調(diào)整為1×106個(gè)/mL，添加400 μL的緩沖液，加入5 μL的Annexin V-FITC，避光反應(yīng)15 min后加入5 μL的PI染液，上流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)，計(jì)算細(xì)胞總凋亡率=早期凋亡+晚期凋亡。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6.3 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)實(shí)驗(yàn)性宮頸癌U14小鼠的抑瘤作用 取體重18～22 g的KM雌性小鼠110只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，將小鼠分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、順鉑組和4種阿魏高、低劑量組。除空白對(duì)照組外，其他小鼠右前肢腋下接種2×106個(gè)/mL的鼠宮頸癌U14細(xì)胞混懸液，每只小鼠0.2 mL，次日進(jìn)行灌胃給藥。稱取相應(yīng)劑量4種阿魏乙醇提取物稠浸膏于乳缽中，食用油∶水∶吐溫-80=8∶4∶1，加入容器中，研勻配制成含藥乳劑，4種阿魏高、低劑量組分別給藥1.5 g生藥/kg、0.75 g生藥/kg，空白對(duì)照組、模型對(duì)照組小鼠灌胃給藥相同比例的空白乳劑，所有小鼠連續(xù)給藥12 d；順鉑組5 mg/kg劑量每3 d進(jìn)行腹腔注射，共注射4次。各組末次灌胃1 h后，小鼠摘眼球取血，靜置離心后吸取血清，使用全自動(dòng)生化分析儀器分析，得出ALT、AST以及CysC數(shù)據(jù)并記錄。取血后立即脫頸處死，取出小鼠的腫瘤組織、脾、腎、胸腺，稱量，計(jì)算其抑瘤率、脾指數(shù)、腎指數(shù)、胸腺指數(shù)。將腫瘤組織放置于10%的中性福爾馬林溶液中浸泡保存。抑瘤率%=(模型對(duì)照組瘤重-給藥組瘤重)/模型對(duì)照組瘤重×100%，脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)，腎指數(shù)=腎臟質(zhì)量(mg)/體重(g)，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.6.4 腫瘤組織蘇木精-伊紅(HE)染色 石蠟包埋法包埋各組小鼠腫瘤組織，病理切片機(jī)切片。梯度乙醇脫水，透明，石蠟包埋，中性樹膠封固。切片，用蘇木精-伊紅染色，于光學(xué)顯鏡下拍照(×200)，用于組織形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的抑制作用荒地阿魏、多傘阿魏、山地阿魏和準(zhǔn)噶爾阿魏對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖有抑制作用，IC50分別為 25.67、32.67、50.03、54.07 μg/mL，見表1。

表1 新疆4種阿魏對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制結(jié)果/(μg/mL)

2.2 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的凋亡作用新疆4種阿魏對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞均有一定的促凋亡作用，給藥濃度為75 μg/mL，細(xì)胞總凋亡率分別為準(zhǔn)噶爾阿魏(68.23±5.21)%、荒地阿魏(53.67±3.46)%、山地阿魏(50.92±4.12)%、多傘阿魏(47.41±3.08)%。結(jié)果表明準(zhǔn)噶爾阿魏的促人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡作用最強(qiáng),見表2。

表2 新疆4種阿魏乙醇提取物對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響

2.3 新疆4種阿魏的抑瘤作用模型對(duì)照組小鼠腫瘤組織明顯較大，順鉑組、阿魏各給藥組小鼠的腫瘤組織明顯減小，荒地阿魏、多傘阿魏、山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏高、低劑量組腫瘤重量明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)。與順鉑組比較，新疆4種阿魏瘤重?zé)o顯著性差異(P>0.05)。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組、4種阿魏給藥組的脾臟重量明顯升高(P<0.05)；4種阿魏給藥組、順鉑組的腎臟指標(biāo)未見顯著改變，腎臟外觀、顏色及形態(tài)均未見改變；模型對(duì)照組的胸腺重量顯著升高，胸腺明顯增生變大，顏色為白色無變化；荒地阿魏、多傘阿魏的胸腺指標(biāo)與空白對(duì)照組比較無顯著變化，山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏、順鉑組的胸腺指標(biāo)與空白對(duì)照組比較明顯減小(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，4種阿魏的脾臟重量無明顯變化，順鉑組脾臟重量明顯減輕(P<0.05)；山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏、順鉑組的胸腺指標(biāo)明顯減小(P<0.05)，見表3、4。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及新疆4種阿魏給藥組的丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶均無明顯變化，表明藥物對(duì)肝臟功能無明顯的作用。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組及新疆4種阿魏給藥組的胱抑素C均無明顯變化，表明藥物對(duì)腎臟功能無明顯的作用；順鉑組的胱抑素C明顯升高(P<0.05)，提示有一定程度的腎臟損傷，與順鉑臨床應(yīng)用的腎毒性相吻合,見表5。

表3 新疆4種阿魏對(duì)實(shí)驗(yàn)性宮頸癌U14小鼠的腫瘤、臟器重量的影響

表4 新疆4種阿魏對(duì)實(shí)驗(yàn)性宮頸癌U14小鼠臟器指數(shù)及抑瘤率的影響

表5 新疆4種阿魏對(duì)實(shí)驗(yàn)性宮頸癌U14小鼠肝腎功能的影響

2.4 腫瘤組織蘇木精-伊紅(HE)染色模型對(duì)照組腫瘤組織體積較大，呈圓形或者橢圓形，胞漿、核膜以及核仁均染色清晰；腫瘤細(xì)胞核大而清楚，異型較多，呈核分裂相；阿魏各給藥組腫瘤細(xì)胞體積減小，大部分呈梭形，腫瘤細(xì)胞、核仁以及核膜出現(xiàn)了明顯的皺縮；腫瘤細(xì)胞核固定縮緊，異型的核分裂較少，組織內(nèi)出現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1，表明阿魏各給藥組對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，細(xì)胞核出現(xiàn)固縮、碎裂，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。

(注:A:模型對(duì)照組;B:順鉑組;C:荒地阿魏高劑量組;D:荒地阿魏低劑量組;E:多傘阿魏高劑量組;F:多傘阿魏低劑量組;G:山地阿魏高劑量組;H:山地阿魏低劑量組;I:準(zhǔn)噶爾阿魏高劑量組;J:準(zhǔn)噶爾阿魏低劑量組)

3 討論

宮頸癌是婦女最常見的惡性腫瘤，由于子宮頸正常上皮發(fā)生了顯著的形態(tài)改變，并且在一系列的前浸潤(rùn)性病變，進(jìn)而發(fā)展成癌。Hela細(xì)胞是從人類病變子宮內(nèi)膜上分化而來的細(xì)胞，有實(shí)驗(yàn)研究表明其增殖和凋亡與宮頸癌預(yù)后有很大關(guān)系[9-10]。根據(jù)美國國立癌癥學(xué)會(huì)公布的天然藥物抗腫瘤作用指標(biāo)規(guī)定，該植物的粗提物對(duì)細(xì)胞的IC50的抑制作用低于30 μg/mL，或100 μg/mL濃度其抑制增殖作用大于80%，表明該植物具有對(duì)腫瘤明顯的抑制作用[11]。本研究采用MTT法求得細(xì)胞增殖抑制率及IC50，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)4種阿魏乙醇提取物的細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，荒地阿魏、多傘阿魏、山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏75 μg/mL濃度的增殖抑制率均大于80%，表明4種阿魏的體外抗腫瘤效果均較好；對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞均具有一定的促凋亡作用。

《抗腫瘤藥效學(xué)指導(dǎo)原則》[12]規(guī)定，當(dāng)天然藥物對(duì)腫瘤抑制率超過40%時(shí)，可以認(rèn)為其有一定的抗癌效果，值得深入的研究。根據(jù)抑瘤率，荒地阿魏、山地阿魏和準(zhǔn)噶爾阿魏等均具有一定的抗癌活性，符合規(guī)定。中藥由于化學(xué)成分復(fù)雜，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑的作用特點(diǎn)，出現(xiàn)倒置現(xiàn)象，如多傘阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏高劑量組的腫瘤重量大于低劑量組，表現(xiàn)出低劑量組的抑瘤率更好，這些有待于后續(xù)增加樣本量及重復(fù)次數(shù)，以明確其較佳的劑量范圍。

脾臟是機(jī)體最大的免疫應(yīng)答器官，是各類免疫細(xì)胞居住的場(chǎng)所，胸腺是免疫系統(tǒng)的中心器官，主要功能是產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞和分泌胸腺素，參與細(xì)胞免疫。本研究結(jié)果顯示，模型對(duì)照組脾臟、胸腺重量顯著增加(P<0.05)，說明當(dāng)小鼠患上腫瘤后，觸發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)能使脾臟、胸腺增大；順鉑組脾臟、胸腺與正常對(duì)照組比較均顯著下降，表明順鉑的免疫抑制作用；而新疆4種阿魏對(duì)脾臟重量無明顯影響，山地阿魏和準(zhǔn)噶爾阿魏可使胸腺重量明顯減輕，是免疫抑制作用還是其他原因，有待于后續(xù)研究。

藥物在抑制腫瘤的同時(shí)，其不良反應(yīng)一直是抗腫瘤藥物關(guān)注的熱點(diǎn)，傳統(tǒng)的化學(xué)藥物治療由于廣泛的不良反應(yīng)，如骨髓抑制、消化道反應(yīng)、脫發(fā)、心臟毒性、肝腎功能的損傷備受關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定了新疆4種阿魏對(duì)小鼠肝腎功能的影響，研究表明，新疆4種阿魏對(duì)宮頸癌小鼠的肝腎功能沒有明顯影響。由于指標(biāo)單一，在后續(xù)工作中，還需要結(jié)合血清肌酐、尿素氮以及腎臟病理等指標(biāo)進(jìn)行進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證。要全面評(píng)價(jià)新疆4種阿魏的安全性，還需要結(jié)合凝血功能、血液常規(guī)及各臟器的病理檢查。

綜上所述，荒地阿魏、多傘阿魏、山地阿魏、準(zhǔn)噶爾阿魏乙醇提取物具有較強(qiáng)的抗宮頸癌活性。