甄昊，王犖,2，劉艷霞，吳洋磊，譚八梅，丁君,2，常亞青

（1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023；2.南方海洋科學與工程廣東省實驗室（廣州），廣東 廣州 511458）

中間球海膽Strongylocentrotus intermedius（又稱蝦夷馬糞海膽）味道鮮美，營養(yǎng)價值高，是我國北方主要海膽?zhàn)B殖種類[1]。近年來，隨著極端高溫天氣頻發(fā)，中間球海膽大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻現(xiàn)，溫度已然成為制約中間球海膽產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素[2]。

溫度對水生生物生長發(fā)育模型構(gòu)建的相關(guān)工作愈發(fā)受到關(guān)注[3,4]。溫度與中間球海膽的生長、發(fā)育密切相關(guān)[5-7]。丁君等[8]基于不同規(guī)格中間球海膽生長數(shù)據(jù)，構(gòu)建了中間球海膽殼高、殼徑與生長的線性模型，探明了適宜溫度下中間球海膽生長發(fā)育特征。甄昊等[9]利用響應(yīng)曲面法構(gòu)建了溫度和鹽度對中間球海膽胚胎存活率影響的預測模型，查明中間球海膽胚胎成活的最適溫鹽條件。吳洋磊等[10]研究了不同溫度和鹽度對中間球海膽胚胎發(fā)育早期進程的聯(lián)合效應(yīng)，建立了溫度和鹽度對中間球海膽胚胎發(fā)育進程定量關(guān)系模型和早期胚胎發(fā)育時期溫度和鹽度的最佳組合。目前，有關(guān)溫度對中間球海膽胚胎發(fā)育方面的預測模型已有初步進展，但溫度對中間球海膽不同生長階段影響的預測模型還未見報道。

多項式擬合是基于多項式方程擬合因變量與響應(yīng)值的關(guān)系，響應(yīng)曲面法采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系；兩者相結(jié)合為探討多種環(huán)境因素對生物效應(yīng)提供了有效途徑，廣泛應(yīng)用水產(chǎn)領(lǐng)域[11,12]。本研究利用多項式擬合和響應(yīng)曲面法，建立不同溫度條件下不同殼徑中間球海膽生長預測模型，查明不同殼徑中間球海膽生長的最適溫度和極限溫度，以期為深入探究中間球海膽溫度適應(yīng)性機理和工廠化養(yǎng)殖溫度調(diào)控提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所用中間球海膽于2020 年8 月采自大連市旅順口區(qū)龍王塘海域，暫養(yǎng)15 d 后進行實驗。

1.2 方法

實驗設(shè)6 個溫度（10℃、14℃、18℃、22℃、24℃和26℃）、三種殼徑（2 cm、4 cm 和6 cm）的中間球海膽，每組120 只海膽。預實驗結(jié)果表明，26℃下，殼徑6 cm 的中間球海膽生存不能超過7 d，因此本實驗額外增加一個24℃下6 cm 中間球海膽處理組。共設(shè)16 個處理組，每組均設(shè)3 個平行。

養(yǎng)殖實驗在控溫循環(huán)水槽中進行，海水經(jīng)沙濾罐過濾，鹽度為30～31。每兩天投喂一次石莼，同時吸取水槽底部糞便，換水1/5，以確保溫度波動在0.2℃之內(nèi)。實驗進行5 周，每周稱量一次海膽體質(zhì)量，計算平均增重率（WGR）。

WGR（%）=（Wt－W0）/W0×100，

式中：W0和Wt分別為實驗初始和結(jié)束時海膽的體質(zhì)量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)不同溫度下不同殼徑中間球海膽的增重率數(shù)據(jù)構(gòu)建模型，使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行顯著性分析，利用Origin 2016 軟件建立二次曲線回歸模型，采用Design expert 10.0 建立軟件響應(yīng)曲面圖。通過校正系數(shù)來分析模型可信度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下不同殼徑中間球海膽體質(zhì)量生長情況

三種殼徑中間球海膽在五種溫度條件下養(yǎng)殖35 d 時，體質(zhì)量生長數(shù)據(jù)如表1 所示。在水溫10～26℃條件下，殼徑2 cm、4 cm 和6 cm 中間球海膽均在14℃時生長最快。不同殼徑海膽在26℃時，體質(zhì)量均出現(xiàn)負增長。值得注意的是，殼徑6 cm 海膽從22℃開始，體質(zhì)量出現(xiàn)負增長，在26℃僅能存活7 天。

表1 不同溫度下不同殼徑中間球海膽體質(zhì)量生長情況Tab.1 Weight gain of sea urchin Strongylocentrotus intermedius with different diameter at different temperatures

2.2 不同溫度對殼徑2 cm 中間球海膽生長的影響

二次回歸方程擬合溫度對殼徑2 cm 中間球海膽的增重率曲線模型方程為Y=-0.0744X2+2.3915X-13.1362（圖1），式中，Y 為因變量增重率（%），X 為溫度（℃）。

圖1 殼徑2 cm 中間球海膽增重率擬合曲線Fig.1 Fitting curve of weight gain rate of sea urchin Strongylocentrotus intermedius with diameter of 2 cm

該模型的決定系數(shù)為0.9799，較好地預測了殼經(jīng)2 cm 中間球海膽在不同溫度下的生長。從圖1可知，該模型曲線為拋物線狀，顯示出殼徑2 cm 中間球海膽存在最適生長溫度。較低溫度會抑制中間球海膽生長，隨著溫度的升高，中間球海膽生長逐漸加快；超過最適溫度，隨著溫度繼續(xù)升高增重率降低。當溫度超過生長極限溫度后，增長率則為負值，體質(zhì)量開始下降。該模型計算發(fā)現(xiàn)，殼徑2 cm的中間球海膽最適生長溫度為16.1℃，生長極限溫度為25.1℃。由圖2 可知，10℃組中間球海膽增重率顯著（P＜0.05）低于14℃和18℃組；22℃組中間球海膽增重率極顯著（P＜0.01）低于14℃和18℃組；26℃組中間球海膽各周體質(zhì)量增重率和其他溫度組出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。中間球海膽體質(zhì)量在26℃組出現(xiàn)負增長，在第4 周出現(xiàn)死亡，且第5 周死亡率達100%。

圖2 殼徑2 cm 中間球海膽增重率柱形圖Fig.2 Bar chart of weight gain rate of sea urchin S.intermedius with diameter of 2 cm

2.3 不同溫度對殼徑4 cm 中間球海膽生長的影響

通過二次回歸方程擬合溫度對殼徑4 cm 中間球海膽的增重率曲線（圖3）得出的模型方程為：Y=-0.0542X2+1.6719X-8.4182。式中，Y 為因變量增重率（%），X 為溫度（℃）。

該模型的決定系數(shù)為0.9798，說明該模型可較為準確預測殼徑4 cm 中間球海膽受溫度影響的生長。由圖3 可知，構(gòu)建的模型曲線為拋物線狀，表明殼徑4 cm 中間球海膽存在最適溫度。水溫較低會抑制中間球海膽生長，隨著溫度的升高，中間球海膽生長逐漸加快；超過最適溫度后，隨著溫度升高，增重率降低；當溫度超過海膽生長極限溫度后，增重率為負值，體質(zhì)量逐漸降低。該模型計算結(jié)果表明，殼徑為4 cm 的中間球海膽最適生長溫度為15.4℃，生長極限溫度為24.5℃。由圖4 可知，14℃組海膽增重率與18℃組海膽增重率無顯著差異，其余各溫度組間增重率差異顯著（P＜0.05）。26℃組中間球海膽體質(zhì)量呈現(xiàn)負增長，海膽在第三周出現(xiàn)死亡，第四周死亡率為100%。

圖3 殼徑4 cm 中間球海膽增重率擬合曲線Fig.3 Fitting curve of weight gain rate of sea urchin S.intermedius with diameter of 4 cm

圖4 殼徑4 cm 中間球海膽增重率柱形圖Fig.4 Bar chart of weight gain rate of sea urchin S.intermedius with diameter of 4 cm

2.4 不同溫度對殼徑6 cm 中間球海膽生長的影響

二次回歸方程擬合溫度對殼徑6 cm 中間球海膽的增重率曲線（圖5）得出模型方程為：Y=-0.0324 X2+0.8801X-4.2041。式中，Y 為因變量增重率（%），X 為溫度（℃）。該模型的決定系數(shù)為0.9580，說明該模型可較為準確預測殼徑6 cm 中間球海膽受溫度影響的生長情況。由圖5 可知，與殼徑2 cm 和4 cm 組中間球海膽相比，殼徑6 cm 組中間球海膽更適應(yīng)低溫環(huán)境。超過最適溫度后，隨著溫度的上升，海膽增重率逐漸降低；當溫度超過生長極限溫度后，海膽出現(xiàn)負增長，體質(zhì)量逐漸減輕，直至死亡。該模型計算結(jié)果顯示，殼徑6 cm 的中間球海膽最適生長溫度為13.6℃，生長極限溫度為21.0℃。由圖6 可知，22℃、24℃、26℃組中間球海膽體質(zhì)量呈負增長。其中，24℃組中間球海膽在第二周開始出現(xiàn)死亡，到第五周，死亡率為10%；26℃組中間球海膽在第一周出現(xiàn)死亡，第7 d 死亡率達100%。各溫度組中間球海膽增重率差異極顯著（P＜0.01）。

圖5 殼徑6 cm 中間球海膽增重率擬合曲線Fig.5 Fitting curve of weight gain rate of sea urchin S.intermedius with diameter of 6 cm

圖6 殼徑6 cm 中間球海膽增重率柱形圖Fig.6 Bar chart of weight gain rate of sea urchin S.intermedius with diameter of 6 cm

2.5 溫度和殼徑對中間球海膽生長的影響

利用響應(yīng)曲面法的構(gòu)建不同溫度下不同殼徑中間球海膽增重率（WGR）的模型方程為：WGR%=-6.1175+0.2177×D+1.5362×T+0.0054×DT-0.1414×D2-0.0511×T2。式中，D 為中間球海膽殼徑（cm）；T 為養(yǎng)殖水體溫度（℃）。

由表2 可知，方差分析顯示，該模型的R2為0.9369，回歸模型極顯著（P＜0.01），表明溫度和規(guī)格對中間球海膽增重率的擬合方程有效，選擇恰當，可以解釋93.69%響應(yīng)值變化。

表2 溫度和殼徑對中間球海膽增重率的回歸模型方差分析Tab.2 ANOVA analysis of regression model of temperature and diameter to weight gain rate of sea urchin Strongylocentrotus intermedius

對生長預測模型各項系數(shù)顯著性差異檢驗結(jié)果表明，溫度和殼徑極顯著（P＜0.01）影響中間球海膽的增重率。其中溫度的一次項系數(shù)大于殼徑的一次項系數(shù)，溫度對中間球海膽的生長影響大于殼徑。

由圖7 可知，隨著殼徑的變化，中間球海膽最適生長溫度與耐受極限溫度也隨之變化。即隨著中間球海膽殼徑的增加，耐受高溫的能力和最適生長溫度也不斷降低。2 cm 殼徑中間球海膽可耐受25℃的高溫，而殼徑4 cm 和6 cm 的海膽耐受溫度分別降至24.5℃和21.0℃。

圖7 不同殼徑中間球海膽生長最適和極限溫度Fig.7 The optimum and extreme temperature for growth of sea urchin S.intermedius with different diameter

由圖8 可知，不同殼徑中間球海膽生長受溫度的影響規(guī)律基本一致，均存在生長最適溫度和極限溫度。中間球海膽增重率隨著溫度的升高而上升，超過最適溫度后，海膽增重率下降，當水溫超出耐熱極限后，中間球海膽體質(zhì)量減輕直至死亡。

圖8 溫度和殼徑對中間球海膽生長的響應(yīng)曲面Fig.8 Response surface plot of temperature,diameter and their interaction in growth of sea urchin S.intermedius

2.6 模型驗證

本文所建立的不同溫度下不同殼徑中間球海膽生長預測模型擬合度較好，通過響應(yīng)曲面模型優(yōu)化實驗條件，查明殼徑2 cm、4 cm 和6 cm 中間球海膽最適生長溫度下的最大增重率分別為5.47%、4.36%和2.14%。為驗證模型的可靠性，按照所得最優(yōu)條件，用300 只中間球海膽開展驗證實驗。實測中間球海膽增重率為5.73%、4.04%和1.87%，與理論值吻合程度為91.99%，表明模型合理有效。

3 討論

3.1 中間球海膽生長最適溫度與極限溫度

溫度通過調(diào)節(jié)機體能量代謝而影響海洋生物生長發(fā)育[13-17]。本研究結(jié)果顯示，中間球海膽生長與水溫存在顯著相關(guān)性。中間球海膽增重率隨溫度的升高逐漸增加；最適水溫下，中間球海膽生長增重最快；超過最適溫度，隨著溫度的升高增重率逐漸下降；當溫度高于海膽耐受極限溫度后，體質(zhì)量則出現(xiàn)負增長。常亞青等[1]研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，中間球海膽的攝食率逐步加大，超過適宜水溫后攝食率降低，溫度達到耐熱極限后，幾乎不攝食，攝食率隨溫度的變化趨勢與生長隨溫度的變化趨勢一致。趙艷等[18]研究表明，溫度影響中間球海膽的耗氧率和排氨率，在15～25℃范圍內(nèi)，海膽耗氧率和排氨率隨溫度的升高而增加。溫度也顯著影響（P＜0.05）馬糞海膽Hemicentrotus pulcherrimus 的攝食率[19]。排氨率隨水溫的升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，在15.6℃時馬糞海膽排氨率最大。在17～32℃范圍內(nèi)，紫海膽Anthocidaris crassispina 耗氧率隨溫度的升高而增加，排氨率則呈先升高后降低[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，中間球海膽不同發(fā)育階段所耐受的溫度有所不同，在其他海洋生物研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)[21-24]。殼徑越大的中間球海膽生長的最適溫度和耐受極限溫度越低。其中，殼徑2 cm 中間球海膽最適生長溫度為16.1℃，殼徑4 cm 和6 cm 的中間球海膽最適生長溫度分別降至15.2℃和13.6℃；殼徑2 cm 中間球海膽耐受極限高溫25.1℃，高于殼徑4 cm 和6 cm 中間球海膽生長的極限溫度24.5℃和21.0℃。殼徑4 cm 和6 cm 為性成熟的中間球海膽，高溫使性成熟的生物有氧代謝能力減弱，用于生產(chǎn)配子的額外能量消耗導致耐熱性降低[25]，預計這會導致生物耐受性的下降[26]。高溫還影響性激素的生產(chǎn)和釋放，直接損害性腺的發(fā)育[27]，因此體型越大的海膽對高溫的耐受性越低。

3.2 不同溫度下中間球海膽生長預測模型

利用統(tǒng)計學方法分析環(huán)境因子對生物的影響并建立預測模型，不僅可以解析生物的生長規(guī)律，還可以預測環(huán)境因子變化對生物生長的影響[27-30]。以往關(guān)于環(huán)境因素影響海洋生物生長的研究中，大多僅對實驗結(jié)果進行簡單的顯著性統(tǒng)計分析，鮮有開展相關(guān)模型構(gòu)建及預測工作。本文基于不同溫度下不同殼徑中間球海膽生長監(jiān)測數(shù)據(jù)，利用多項式擬合和響應(yīng)曲面法，建立不同溫度條件下中間球海膽生長預測模型，分析不同殼徑中間球海膽生長最適和極限溫度，有助于深入了解溫度與中間球海膽生長的相關(guān)性。

本研究所設(shè)置的五個溫度梯度，基本覆蓋了中間球海膽?zhàn)B殖水溫的波動范圍。選取三種殼徑中間球海膽，分別代表了稚膽、成膽和種膽不同的生長階段。在水溫與魚類生長相關(guān)性研究中，大部分模型可以用二次曲線或其他多元回歸方程來表示[31]。在本實驗中，中間球海膽生長對不同溫度的響應(yīng)均可用二次回歸曲線擬合。文中所建立的不同溫度對三種殼徑中間球海膽生長預測模型，以及溫度和殼徑對中間球海膽增重率預測模型，R2分別為0.9799、0.9878、0.9580 和0.9369，構(gòu)建模型R2均大于0.9369，表明本實驗?zāi)Ｐ陀行栽?3.69%以上。養(yǎng)殖中間球海膽海區(qū)環(huán)境復雜，實驗室養(yǎng)殖數(shù)據(jù)構(gòu)建模型一般有較大局限性，通過驗證實驗，實際增重率與理論增重率吻合度也高于91.99%。本模型能較好地預測工廠化養(yǎng)殖中間球海膽生長對溫度的適應(yīng)狀態(tài)，可為中間球海膽工廠化養(yǎng)殖提供一定的理論依據(jù)。