馬曉良，梅敬威，徐佳鳴

（1.杭州市第一人民醫(yī)院建德分院［建德市第二人民醫(yī)院］腫瘤內(nèi)科，浙江 建德 311600；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科）

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）是成人顱腦腫瘤中最常見的原發(fā)性腫瘤，具有生存期短、復(fù)發(fā)率高等特點。臨床上雖然綜合使用手術(shù)切除、術(shù)后放化療及免疫治療等手段，但目前中位生存時間仍只有15～17個月，5年存活率僅為5.1%［1］。樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC）作為抗原提呈細(xì)胞，目前在腫瘤生物免疫治療上引起越來越多的重視［2］。近年來免疫治療在腫瘤領(lǐng)域令人矚目的研究進展為GBM的治療帶來曙光。本文將DC提呈腫瘤抗原相關(guān)的GBM免疫治療研究進展作一綜述。

1 GBM和中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫應(yīng)答

GBM在原發(fā)性腦惡性膠質(zhì)瘤中約占一半，基于目前的生存期短和復(fù)發(fā)率高等特點，有必要研究出更加有效的抗腫瘤治療方案。由于血腦屏障的存在，缺乏傳統(tǒng)的淋巴回流系統(tǒng)，GBM腫瘤微環(huán)境中活化的T淋巴細(xì)胞及抗原提呈細(xì)胞數(shù)量有限［3］。有研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，存在著多種促血管生成和免疫抑制調(diào)節(jié)因素，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是各種腫瘤病理生理調(diào)節(jié)的關(guān)鍵介質(zhì)。Louveau等［4］在小鼠的體外實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)了硬膜竇內(nèi)淋巴回流系統(tǒng)，腦部的抗原提呈細(xì)胞（小膠質(zhì)細(xì)胞）可離開中樞進入頸部淋巴結(jié)；同時GBM腫瘤細(xì)胞的生長可以破壞血腦屏障，有利于淋巴細(xì)胞進出腦組織，即便是血腦屏障完整，淋巴細(xì)胞在趨化因子的作用下也可穿透血腦屏障。

2 GBM的腫瘤微環(huán)境

與其他實體腫瘤相比，GBM罕見轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的其他部位；且GBM有較少的淋巴細(xì)胞浸潤，以上這些特征提示GBM免疫微環(huán)境的復(fù)雜性［4］。雖然獨特，但GBM患者的整體免疫狀態(tài)是受抑制的。腫瘤是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，由腫瘤干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、微小血管、浸潤性單核細(xì)胞群和常駐免疫細(xì)胞構(gòu)成。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐巨噬細(xì)胞，負(fù)責(zé)對抗感染以及對傷害的反應(yīng)。在GBM中，骨髓來源的單核細(xì)胞（BMDMs）隨著腫瘤細(xì)胞分泌的趨化因子如集落刺激因子1（CSF1）和CCL2而遷移到腫瘤細(xì)胞中［5］。一旦進入腫瘤內(nèi)部，BMDMs發(fā)展免疫抑制表型，分泌生長因子和細(xì)胞因子，有助于促進腫瘤的生長和擴散［6］。由于基因表達的相似性，在小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間，很難區(qū)分是BMDMs還是小膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成了膠質(zhì)瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（GAMs）。細(xì)胞因子可以削弱T細(xì)胞毒性、抑制T細(xì)胞及DC的成熟和促進Treg增殖，后者又通過直接細(xì)胞接觸或分泌免疫抑制因子抑制T細(xì)胞功能。此外，膠質(zhì)瘤組織中存在一些骨髓來源的抑制性細(xì)胞（MDSC）。在膠質(zhì)瘤體外研究模型中，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中DC、成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等可通過發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，加速腫瘤的生長［7-8］。

3 DC的免疫學(xué)特性

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞可以釋放一些免疫抑制因素導(dǎo)致DC的功能改變，使腫瘤細(xì)胞逃避。健康者的DC含量明顯多于腫瘤患者。DC與不同部位、不同類型的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后均密切相關(guān)，經(jīng)證實DC的數(shù)量與淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，可作為一個獨立的預(yù)后因素［9-10］。DC是體內(nèi)功能最強大的抗原提呈細(xì)胞，在免疫系統(tǒng)中能直接激活體內(nèi)輔助性T細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），也可使B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。腫瘤抗原體外致敏DC是通過對DC分離和純化得來的，其可以通過高水平刺激MHCⅠ類和MHCⅡ類分子導(dǎo)致T細(xì)胞活化；同時誘導(dǎo)分泌IFN-α、IFN-γ、IL-3、IL-12等因子產(chǎn)生相關(guān)免疫應(yīng)答；此外，還可以通過基因工程提高DC抗腫瘤免疫反應(yīng)［11］。國內(nèi)外動物實驗研究已證實，DC腫瘤疫苗能夠在動物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗腫瘤特異性免疫，明顯延長腫瘤動物模型的存活時間［12］。

4 DC疫苗的制備

傳統(tǒng)體外人DC的獲取方法為：取患者外周血，分離CD14+單核細(xì)胞，用重組人粒單核細(xì)胞集落刺激因子和人IL-4的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，第6天加入腫瘤壞死因子-α促進其成熟，第8天收獲未貼壁的懸浮細(xì)胞，即為成熟DC［13］。近年來，為了提高DC疫苗的獲得效率，降低成本，快速DC（Fast-DC）已經(jīng)開發(fā)，大大減少了體外培養(yǎng)時間?！癋astDC”是在2 d的培養(yǎng)后獲得的周期并保持誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)的基本能力［14］。與標(biāo)準(zhǔn)DC相比，F(xiàn)astDC的重要區(qū)別在于培養(yǎng)的產(chǎn)量更高，IL-12p70釋放降低，CCL19誘導(dǎo)的趨化因子升高，細(xì)胞內(nèi)抗原表達增強，腫瘤特異性CTL細(xì)胞的招募更有效［15］。在一項針對急性白血病的研究中（NCT01734304），F(xiàn)astDC負(fù)載腫瘤抗原的疫苗正在行臨床Ⅰ期試驗，截止到目前還沒發(fā)現(xiàn)FastDC 的不安全性［16］。Feuerstein 等［17］首 次提出，低溫冷凍可被用于保存成熟DC。在DC期間的超低溫保存疫苗制備是可行的，在一個小規(guī)模的臨床研究中，Nair等［18］從兒童髓母細(xì)胞瘤患者中實現(xiàn)了PBMCs來源功能性DC的凍存。另外，F(xiàn)itzpatrick等［19］研究發(fā)現(xiàn)，成熟DC可以被冷凍保存，凍存DC與新生成的DC相比，在存活率和細(xì)胞因子產(chǎn)生方面沒有顯著差異。綜上所述，DC的超低溫保存是一種實用的方法。

5 DC疫苗在GBM中的臨床應(yīng)用

5.1 酸洗脫抗原肽疫苗 由于GBM患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞存在明顯的多型性和異質(zhì)性，因而將DC與非選擇性腫瘤抗原行致敏作用可以大大提高免疫應(yīng)答效率。理論上，使用此類抗原可降低免疫逃逸的概率。然而此方法一個潛在的風(fēng)險就是可能導(dǎo)致自體免疫性疾病的發(fā)生，嚴(yán)重者可致實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎發(fā)生。來自腫瘤細(xì)胞酸洗脫的非特異性腫瘤抗原，可有效增加與MHC Ⅰ類分子結(jié)合的腫瘤表面肽的能力［20］。Liau等［21］首次用這種方法治療GBM患者，并利用從同種異體MHC Ⅰ類匹配的GBM中提取的腫瘤抗原對體外DC進行致敏，發(fā)現(xiàn)DC免疫耐受良好，沒有產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，腫瘤微環(huán)境中CD3+T細(xì)胞含量明顯增多。Yu等［22］通過對約20例GBM患者使用 50～100 μg酸洗脫的腫瘤肽致敏的DC疫苗，每兩周接種3次，每次細(xì)胞數(shù)約1×106個，所有患者均未出現(xiàn)疫苗相關(guān)自身免疫反應(yīng)及劑量相關(guān)毒性反應(yīng)；與體內(nèi)未發(fā)生CTL免疫應(yīng)答患者相比，有超過一半的患者體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤特性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，且生存率明顯延長；此外，在接種疫苗后接受腫瘤切除的患者中，有一半的患者發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)有CD3+T細(xì)胞浸潤，主要由CD8+/CD45RO+記憶性T細(xì)胞組成。

5.2 腫瘤裂解物抗原 隨著酸洗脫腫瘤抗原的初步研究，利用整個腫瘤裂解物作為腫瘤抗原來源的研究也在臨床開展。由于與酸洗脫相關(guān)的技術(shù)挑戰(zhàn)（包括對大腫瘤樣本的要求）和難以持續(xù)獲得切除腫瘤樣本的短期培養(yǎng)物，全腫瘤裂解物方法很快成為首選方法。腫瘤裂解液主要通過從手術(shù)室獲得腫瘤標(biāo)本后行快速反復(fù)凍融（通常為5～6次），產(chǎn)生腫瘤碎片；離心后，收集無細(xì)胞上清液，并用于與自體DC共培養(yǎng)；腫瘤抗原被吞噬，最終呈現(xiàn)在MHCⅠ類和Ⅱ類分子上。最初的研究主要集中在復(fù)發(fā)性GBM患者，后來開始研究新診斷GBM患者。然而，迄今為止，所有結(jié)果均來源于單中心非隨機對照臨床試驗。有研究在2008年對56例復(fù)發(fā)性GBM患者進行了2期臨床研究［23］。所有入組患者在接種疫苗前都接受了最大范圍手術(shù)切除病灶，2例患者出現(xiàn)Ⅳ級腦水腫，但除此之外，疫苗總體耐受性良好。第2階段研究的中位總生存期為9.6個月，11%的患者存活時間超過3年；對于年齡不到35歲的患者，若能夠?qū)δ[瘤進行全切除，結(jié)果更好［23］。Hunn 等［24］研究表明，替莫唑胺聯(lián)合腫瘤裂解物致敏DC疫苗6個月無病進展期比例為22%。在2018年的一項關(guān)于自體腫瘤裂解物致敏DC疫苗的Ⅲ期臨床試驗中，Liau等［25］研究發(fā)現(xiàn)，在GBM的標(biāo)準(zhǔn)治療中增加自體腫瘤裂解物致敏DC疫苗不但具有可行性、安全性的特點，還能延長患者的無進展生存時間和總體生存時間。

5.3 腫瘤特異性抗原疫苗 腫瘤相關(guān)抗原（TAA）已在癌癥治療的各種臨床試驗中進行了驗證，但個體化TAA免疫的特異性T細(xì)胞反應(yīng)模式仍有待進一步探索［26］。腫瘤特異性抗原疫苗主要包括單抗原疫苗和多抗原疫苗。EGFRv Ⅲ是一個理想的免疫治療靶點，它是由產(chǎn)生腫瘤特異性抗原的亞基缺失引起的，而這種抗原在正常組織中是不存在的。它存在于大約30%的GBM中。目前臨床前研究表明，其對顱內(nèi)腫瘤有明顯的抗腫瘤活性，用EGFRv Ⅲ肽致敏的DC治療EGFRv Ⅲ陽性腫瘤，進行了第1階段劑量遞增臨床研究［27］。在這項研究中，新診斷的GBM患者在最大安全切除和標(biāo)準(zhǔn)放射治療后，接受了3次劑量的DC疫苗，患者接受了高達5.7×107DC，未觀察到劑量限制性毒性或嚴(yán)重不良反應(yīng)；大多數(shù)患者在接種后都表現(xiàn)出EGFRv Ⅲ特異性免疫反應(yīng)，83%的患者（10/12）在體外產(chǎn)生了EGFRv Ⅲ特異性T細(xì)胞增殖反應(yīng)，56%（5/9）產(chǎn)生了EGFRv Ⅲ特異性陽性反應(yīng)、遲發(fā)型超敏皮膚試驗；中位進展時間和自診斷之日起的總生存率分別為10.2個月和22.8個月［27］。近年來WT1抗原相關(guān)腫瘤免疫治療在GBM患者體內(nèi)研究得到學(xué)者青睞［28-30］。在另一項Ⅰ期研究中，Sakai等［31］報道了10例復(fù)發(fā)性GBM患者的結(jié)果，這些患者接受了自體DC與突變型Wilms腫瘤1（WT1）抗原行致敏反應(yīng)，免疫耐受良好，無1例患者出現(xiàn)3級以上不良反應(yīng)；6例患者（60%）的WT1特異性CTL細(xì)胞增加了2倍以上。巨細(xì)胞病毒（CMV）抗原存在于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，但不存在于正常大腦中，使其成為理想的免疫靶點［32］。有研究表明通過輸注CMV抗原特異性T細(xì)胞后，用高劑量的替莫唑胺進行淋巴濾過，耐受性良好，但CMV血清陽性不能保證腫瘤對CMV特異性T細(xì)胞的易感性，這表明CMV抗原表達存在異質(zhì)性；此外，這些T細(xì)胞的效應(yīng)器功能減弱，這表明在進行大規(guī)模臨床研究之前，需要進一步調(diào)節(jié)T細(xì)胞以防止其功能障礙［33］。Wen等［34］通過 整合 MAGE-1、HER-2、AIM-2、TRP-2、gp100和 IL13Rα2等6種抗原從而制作DC疫苗（ICT-107），接受ICT-107治療的GBM患者總體生存時間可延長2個月，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；但無病生存期可明顯延長，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

5.4 融合細(xì)胞疫苗及其他免疫治療 DC融合疫苗與DC負(fù)載抗原蛋白、抗原肽、腫瘤細(xì)胞裂解產(chǎn)物、輻照腫瘤細(xì)胞等制備的疫苗相比，不僅能更好的通過MHC Ⅰ途徑進行抗原處理，將TAA通過內(nèi)在途徑傳遞給DC，從而產(chǎn)生高質(zhì)量的抗原特異性T細(xì)胞；而且還能通過抗原的交叉激活表達MHC Ⅰ和MHC Ⅱ限制的TAA。既往腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)通常為單一抗原，容易形成腫瘤抗原表達下調(diào)而致免疫耐受，而融合細(xì)胞是多克隆CD4+T細(xì)胞的有力刺激者，在SCID鼠體內(nèi)應(yīng)用多克隆CTL后可以使腫瘤消退。但目前臨床研究較少，效果不明顯。

有關(guān)DC疫苗的Meta分析表明，雖然DC疫苗的耐受性良好，但與對照干預(yù)組相比，基于DC的疫苗接種在中位總生存率、中位無病進展期、無病進展期率或總生存率方面沒有明顯改善；部分研究表明DC疫苗可增加新診斷的GBM的生存期，部分患者中位生存期超過2年或3年，然而，以DC為基礎(chǔ)的疫苗接種（在第7至10周內(nèi)每周進行體內(nèi)接種，然后每月進行1次）顯示，對照組和疫苗組在12個月時的無病進展期（28.4%vs 24.5%，P=0.9975）或中位總生存率無統(tǒng)計學(xué)差異［35］。因而DC疫苗未來仍有較大的挑戰(zhàn)。

6 小結(jié)與展望

在體外將自體DC細(xì)胞負(fù)載腫瘤抗原行免疫治療在未來GBM及其他實體腫瘤的免疫治療中仍然是富有前景的一項治療手段。從目前的臨床試驗前期結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)此項治療的安全性及有效性，部分研究結(jié)果對GBM患者綜合治療給予極大的鼓舞。然而，疫苗的制備、疫苗的成分及患者自身因素等諸多因素仍制約著此研究。此外，包括GBM在內(nèi)的所有實體腫瘤，如何針對自體免疫抑制因素行相關(guān)改進，提高免疫治療效率，值得研究者進一步深入探討。更多提高DC疫苗療效的免疫佐劑有待在今后的免疫治療中發(fā)揮重要作用?；贒C的免疫治療在GBM治療中可謂機遇和挑戰(zhàn)并存。前述多項研究結(jié)果均提示GBM免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用療效可期，開發(fā)新型免疫治療手段，并對現(xiàn)有研究結(jié)果進行詳細(xì)分層和科學(xué)評價，或?qū)镚BM的免疫治療帶來新的思路。