方譯萱 鄒心如 胡舒寧 季俐俐

肺癌的發(fā)病率和死亡率均位于全球癌癥前列[1]，大約85%的肺癌患者被診斷為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）[2,3]。NSCLC起病隱匿，早期癥狀不明顯，大部分患者在初診時已經(jīng)出現(xiàn)局部惡化或者轉(zhuǎn)移癥狀，手術與放化療作為治療手段作用有限，預后較差，5年總體存活率低下[4]。因此，對NSCLC發(fā)病機制和治療措施的研究迫在眉睫。

細胞核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor, NRF2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1, KEAP1）信號通路是體內(nèi)應對過度氧化應激的重要防御通道，可以保護細胞不受應激傷害預防癌變，因此NRF2最初被認證為腫瘤抑制因子[3]。但癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)（The Cancer Genome Atlas, TCGA）及相關臨床數(shù)據(jù)[3,5,6]顯示NSCLC中常出現(xiàn)NRF2突變，尤其在肺鱗癌（lung squamous carcinoma, LUSC）中這一現(xiàn)象更頻繁，超過1/3的LUSC患者發(fā)生NRF2通路異?；罨RF2的生物活性調(diào)控機制以及它在腫瘤發(fā)展過程中的促癌作用一直是近年來腫瘤學研究的熱點。研究[7]指出瘤細胞通過NRF2表達上調(diào)保護其在活性氧增高環(huán)境下存活而促進腫瘤增殖，并且有研究[8]發(fā)現(xiàn)NRF2是參與腫瘤代謝重編程的重要因子，可指揮瘤細胞利用葡萄糖和谷氨酰胺以加速腫瘤細胞增殖。針對NSCLC患者的研究[9-11]表明，NRF2通路持續(xù)激活可誘導腫瘤細胞的惡性增殖及對抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥而導致治療手段作用有限，使患者預后不良。以上證據(jù)表明NRF2可能在NSCLC（尤其是LUSC）的發(fā)生發(fā)展中起到促癌作用。鑒于NRF2在NSCLC發(fā)展過程中的重要作用，聚焦NRF2的治療策略也逐漸受到重視，以NRF2為靶點的治療方案將為NSCLC患者開發(fā)新型個體化抗癌療法提供更全面、更深入的見解。

本文主要圍繞NRF2/KEAP1信號通路的基本結構與反應途徑以及NRF2促進NSCLC增殖的機制進行綜述。此外，還將對目前NRF2抑制劑的研發(fā)進展進行闡述，旨在為以NRF2為靶點的NSCLC治療方法提供新思路。

1 NRF2、KEAP1基本結構及經(jīng)典反應途徑

1.1 NRF2基本結構 NRF2于1994年被首次發(fā)現(xiàn)，是一種含堿性區(qū)域亮氨酸拉鏈（basic-region leucine zipper, bZIP）結構的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子[12,13]，包含7種NRF2-ECH同源結構域（NRF2-ECH homology, Neh），依次命名為Neh1-Neh7[3]。Neh1是調(diào)節(jié)NRF2活性的主要部位，可通過CNCbZIP結構與小肌肉腱膜纖維肉瘤蛋白（small masculoaponeurotic fibrosarcoma proteins, sMAF）組成二聚體，使NRF2可以識別并結合細胞核DNA中抗氧化反應元件（a ntioxidant response element, ARE）序列，繼而啟動下游靶基因轉(zhuǎn)錄活化；Neh2位于N端，該區(qū)域含有與KEAP1結合的DLG和ETGE兩個高度保守序列；Neh3存在于C端，能與轉(zhuǎn)錄共激活因子CHD6結合，是轉(zhuǎn)錄激活的必要條件；Neh4和Neh5可協(xié)同Neh3共同促進NRF2活化；Neh6結構域中含有DSGIS和DSAPGS高度保守序列，與β-轉(zhuǎn)導素重復蛋白（β-transducin repeat-containing protein, β-TrCP）識別并結合以促進NRF2的泛素化降解；Neh7與維甲酸X受體α（retinoic X receptor α, RXRα）相互作用，抑制NRF2靶基因轉(zhuǎn)錄[3,14-16]。

1.2 KEAP1基本結構 KEAP1屬于BTB-Kelch蛋白家族，在細胞質(zhì)與Cullin3（CUL3）組成E3泛素連接酶復合體，隨后與NRF2 Neh2部位結合降解NRF2[3,14,15]。KEAP1包含三個功能區(qū)域，分別為BTB、IVR和DGR區(qū)域[14]，每一個結構域?qū)σ种芅RF2活性具有重要作用。BTB區(qū)域參與結合CUL3泛素連接酶，使KEAP1發(fā)生同源二聚化[3,16]；IVR區(qū)域與含有E3連接酶復合物和Roc1的CUL3蛋白相互作用，還具有核輸出信號的共有序列，有利于KEAP1在細胞質(zhì)中的定位，同時該區(qū)域存在豐富的半胱氨酸殘基調(diào)節(jié)KEAP1活性[16,17]；DGR又稱為Kelch，該區(qū)域與NRF2 Neh2的DLG或ETGE序列結合，處于氧化應激時，DLG序列便從DGR區(qū)域中釋放，阻斷KEAP1對NRF2的降解[3,17,18]。

1.3 NRF2/KEAP1信號通路經(jīng)典反應途徑 當細胞處于非應激狀態(tài)時，由于KEAP1 DGR區(qū)域與NRF2 Neh2結構域中的DLG/ETGE序列結合，促使KEAP1與CUL3形成E3泛素連接酶復合體，使NRF2在26S蛋白酶體中發(fā)生泛素化降解[3,15,16,19]，此時NRF2處于低活性低表達狀態(tài)。當細胞遭遇氧化應激刺激時，KEAP1結構中第151位氨基酸（Cys 151）受到共價修飾導致其功能失活，NRF2脫離KEAP1并轉(zhuǎn)移到細胞核與下游多個基因啟動子區(qū)域ARE序列結合[14,20]，繼而誘導抗氧化基因如依賴還原型輔酶I/II醌氧化還原酶[NAD(P)H: quinone oxidoreductase, NQO1]等表達增加[15,19]，清除體內(nèi)多余活性氧（reactive oxygen species,ROS），維持氧化還原平衡，使得細胞各項生物活動正常進行。

2 NRF2/KEAP1信號通路調(diào)節(jié)肺癌細胞增殖的機制

2.1 NRF2信號通路與PI3K/AKT/mTOR信號通路 磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K）/AKT/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）是調(diào)節(jié)細胞生長、代謝的主要通路[21]，常在腫瘤細胞中異常激活，導致腫瘤細胞惡性增殖，是引起腫瘤耐藥的重要因素[22]。近幾年在結直腸癌（colorectal carcinoma,CRC）、NSCLC等惡性腫瘤細胞以及一些正常細胞如神經(jīng)元細胞、人食管上皮細胞和腎小球系膜細胞中均發(fā)現(xiàn)了NRF2通路與PI3K/AKT/mTOR通路的交聯(lián)作用，表明兩者的協(xié)同作用廣泛存在于多種類型細胞中，并且兩條通路共同作用使細胞更容易在應激環(huán)境下存活并增殖[23-27]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，當PI3K/AKT/mTOR通路處于持續(xù)激活時，NRF2活性進一步增強，誘導細胞發(fā)生代謝重編程，促進A549細胞異常增殖。而在NRF2突變的LUSC細胞中可以發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT/mTOR通路的異?；罨藭r運用mTOR抑制劑可以顯著抑制NRF2突變LUSC細胞增殖[28]，以上說明NRF2通路與mTOR通路相互影響共同推動腫瘤發(fā)展。RagD是mTOR通路激活的關鍵因子[29,30]，已有研究[28,31]表明NRF2可以通過調(diào)節(jié)NSCLC細胞中RagD轉(zhuǎn)錄活性激活mTOR通路促進細胞增殖。除上述機制外，PI3K/AKT/mTOR通路還可以通過其他方式調(diào)節(jié)NRF2信號轉(zhuǎn)導。例如，零價鐵納米顆粒（Zero-valent-iron nanoparticle, ZVINP）可以通過激活NSCLC中腺苷酸活化蛋白激酶（AMPactivated protein kinase, AMPK）/mTOR通路，啟動細胞內(nèi)SCF/β-TrCP機制，增強對NRF2的降解作用，下調(diào)腫瘤的自我更新能力，抑制NSCLC細胞的惡性增殖[32]。此外，最近的一項研究[33]發(fā)現(xiàn)肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）細胞中存在一種新型NRF2靶基因即CHML/Rep2，該基因介導mTOR轉(zhuǎn)位到溶酶體膜，在溶酶體膜上激活并啟動下游靶基因磷酸化，從而驅(qū)動蛋白質(zhì)翻譯過程，而Rep2發(fā)生缺失則影響mTOR依賴的蛋白合成過程，降低細胞增殖。由此可見，NRF2與PI3K/AKT/mTOR信號通路的相互作用對NSCLC的惡性進展起到明顯推動作用，可以為未來靶向兩種通路的聯(lián)合治療提供新的建議。

2.2 NRF2信號通路與細胞周期因子 有文獻[34]闡明細胞周期與腫瘤發(fā)展緊密相關，特定細胞周期因子的失調(diào)可能直接促進腫瘤細胞增殖。Malhotra等[35]利用染色質(zhì)免疫共沉淀技術（chromatin immunoprecipitation,ChIP）對NR F2基因組進行分析后發(fā)現(xiàn)細胞周期調(diào)控抑制因子Cdkn1a和Cdkn2b是NR F2的靶基因。他們以NRF2WT、NRF2-/-和KEAP1-/-三種細胞為研究對象，誘導細胞Cdkn1a和Cdkn2b表達，結果顯示KEAP1-/-細胞的增殖速率相比另外兩種NRF2低表達或不表達的細胞顯著提升[35]。細胞周期相關激酶20（cell cycle-related kinase 20, CDK20）是新發(fā)現(xiàn)的細胞周期調(diào)控因子，在肺癌細胞中CDK20可與NRF2競爭結合KEAP1促進癌細胞持續(xù)增殖，最終使得腫瘤細胞對抗腫瘤藥物產(chǎn)生抵抗[36]。研究[37]發(fā)現(xiàn)NRF2是推動細胞周期從G2期向M期轉(zhuǎn)變的重要調(diào)節(jié)因子，當NRF2功能受損時，細胞無法正常進入M期，有絲分裂過程被迫停止，細胞增殖中斷。研究[38]顯示miR-6077可以直接靶向CDKN1A和KEAP1保護NSCLC免受順鉑誘導的細胞周期阻滯和鐵死亡影響，使細胞產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象，該結果進一步表明細胞周期可與NRF2通路協(xié)同調(diào)節(jié)NSCLC惡性發(fā)展?？傮w而言，NRF2與細胞周期間相互作用的探討已經(jīng)逐步成為熱點，但NRF2與細胞周期相互調(diào)節(jié)的具體機制目前還處于起步階段，未來還需要更多的研究去探討深層機制。

2.3 NRF2信號通路與細胞代謝重編程 考慮到瘤細胞的高增殖率，腫瘤細胞通常會大量消耗微環(huán)境中的各種營養(yǎng)物質(zhì)，因此癌細胞需重新規(guī)劃其代謝，以確保在營養(yǎng)缺乏和壓力的微環(huán)境下生存和增殖，這種現(xiàn)象我們通常稱為細胞代謝重編程[39,40]。近幾年NRF2被認為是驅(qū)動腫瘤細胞代謝重編程的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，NRF2通過上調(diào)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD）、磷酸葡萄糖脫氫酶（phosphogluconate dehydrogenase, PGD）等表達，增加細胞葡萄糖攝取，并引導細胞進入磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway, PPP）促進細胞增殖[10]。NRF2也可以通過調(diào)節(jié)從頭合成核苷酸代謝途徑相關酶如磷酸核糖焦磷酸酰胺轉(zhuǎn)移酶（phosphoribosyl pyrophospha te amidotransferase, PPAT）、亞甲基四氫葉酸脫氫酶2（me thylenetetrahydrofolate dehydrogenase 2, MTHFD2）為細胞生長和增殖提供必需的核苷酸原料[10]。有趣的是，NRF2在PI3K/AKT/mTOR通路持續(xù)激活或者PTEN基因缺失的條件下活性顯著提高，可進一步增強代謝基因表達，促進腫瘤細胞增殖[8]，這一現(xiàn)象不僅表明NRF2參與細胞代謝過程重新分配腫瘤細胞所需營養(yǎng)，也再次證實了NRF2與PI3K/mTOR通路之間的交聯(lián)作用。此外，Galan-Cobo等[41]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者同時存在KRAS基因突變和絲氨酸/蘇氨酸激酶STK11（serine/threonine kinase STK11, LKB1）缺失時，細胞在激活NRF2/KEAP1信號通路的同時啟動谷氨酰胺代謝程序，增強NSCLC對谷氨酰胺抑制劑的敏感性。這些研究結果表明NSCLC中NRF2是參與腫瘤細胞代謝的重要信號轉(zhuǎn)錄因子。雖然細胞代謝是一個復雜的過程，目前對于氧化應激通路NRF2如何協(xié)同其他通路共同促進腫瘤細胞代謝增殖的機制研究尚未完全清楚，但是NRF2參與腫瘤細胞代謝增殖的作用為靶向治療NSCLC患者提供了新的依據(jù)。

2.4 NRF2信號通路與鐵死亡 鐵死亡在腫瘤生長過程中所起的作用已經(jīng)越來越受到大眾的關注。鐵死亡這一概念最早由Di xon于2012年提出[42]，是一種不同于細胞壞死、凋亡、自噬的新型細胞程序性死亡方式。細胞發(fā)生鐵死亡時會出現(xiàn)細胞內(nèi)游離鐵增加、脂質(zhì)過氧化物蓄積以及細胞線粒體形態(tài)變化三種主要的特征性改變[42]。溶質(zhì)載體7家族成員11（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）和谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX4）既是調(diào)控鐵死亡的關鍵因子，也是NRF2的下游靶點[43]。研究[44]發(fā)現(xiàn)NSCLC中NRF2/KEAP1信號通路激活，SLC7A11表達隨之上調(diào)，細胞內(nèi)谷氨酸含量增多，使得腫瘤細胞微環(huán)境發(fā)生改變，進而誘導細胞對鐵死亡抵抗性增加，最終導致細胞增殖失控、惡性進展加快。Gai等[45]發(fā)現(xiàn)NSCLC細胞可通過異位表達金屬硫蛋白1D假基因（metallothionein 1D pseudogene,MT1DP）抑制NRF2活性而使細胞對鐵死亡誘導劑Erastin誘導的鐵死亡敏感，腫瘤細胞活性下降。然而也有部分NSCLC細胞對Erastin誘導的鐵死亡不敏感并出現(xiàn)失控性增殖，此時聯(lián)合運用Erastin和乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）可通過調(diào)節(jié)NRF2核易位，減少胞內(nèi)谷胱甘肽含量，增加脂質(zhì)過氧化物，抑制細胞活力，最終使此類細胞對鐵死亡敏感性增強，抑制細胞過度增殖[46]。最近研究[32]發(fā)現(xiàn)ZVI-NP可以增強NRF2的泛素化降解過程，從而提升細胞內(nèi)ROS水平使之發(fā)生過度氧化應激而誘導A549等肺癌細胞發(fā)生鐵死亡，從而有效抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。從上述研究結果來看，鐵死亡作為一種新發(fā)現(xiàn)的細胞死亡形式，將打破肺癌治療的瓶頸，為腫瘤治療提供一種新策略。但是，NRF2通路參與鐵死亡調(diào)控的機制還有待進一步研究，NRF2作為鐵死亡相關基因的重要調(diào)節(jié)器，其在肺癌的惡性進展過程中具體發(fā)揮了何種作用還需要更多的研究去驗證。

2.5 NRF2信號通路與線粒體功能 一系列證據(jù)[47,48]表明NR F2/K E A P1信號通路與線粒體功能之間存在關聯(lián)。線粒體是細胞重要的生命活動場所，為細胞的生長提供能量和營養(yǎng)物質(zhì)，而線粒體功能紊亂會導致細胞壞死或凋亡，從而中斷細胞增殖[49]。生理狀態(tài)下，NR F2/K EAP1信號軸可與多種功能蛋白相互作用加強NR F2介導的線粒體功能，如PI3K、A KT、p62等可與NRF2競爭結合KEAP1，使NRF2不被降解并激活其介導的相關線粒體功能[50]。目前認為，NRF2過度表達引起的致癌作用部分源于線粒體功能加強和代謝重編程，線粒體功能增強使得腫瘤細胞增殖所需的營養(yǎng)得到充分補充，而當NRF2基因突變或缺失則會引起氧化應激損傷和線粒體代謝紊亂[50]。有研究[47]發(fā)現(xiàn)NR F2抑制劑鴉膽子苦醇（Brusatol, BRU）通過增強細胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平大量消耗谷胱甘肽（glutathione, GSH），破壞線粒體膜電位平衡，損害線粒體功能，使得肺癌細胞生長停滯在G0期/G1期，最終使細胞發(fā)生顯著凋亡。目前，有關NR F2與線粒功能相互作用調(diào)節(jié)細胞生長的機制研究還鮮有報道，如果能夠完全闡明兩者之間的聯(lián)系可能會給NRF2介導的細胞增殖調(diào)控機制帶來新的認知。

3 NRF2抑制劑的研發(fā)

由于NRF2通路在NSCLC中普遍激活，并且研究[51]證明NRF2突變可促進癌細胞對藥物產(chǎn)生抵抗而影響患者治療，因此抑制肺癌細胞NRF2表達將會為緩解肺癌惡性進展提供新的視角。隨著科技水平的提升，很多NRF2抑制劑也逐漸揭開“面紗”。我們目前所熟知的NRF2抑制劑主要從草本植物中提煉而來，包括黃酮類化合物、生物堿等[51]，這些抑制劑在提高肺癌細胞的藥物敏感性方面效果顯著。例如，Tang等[52]研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物木樨草素（luteolin, LUT）通過急劇降低A549細胞中NRF2的mRNA和蛋白水平表達，導致NRF2無法與其下游靶基因ARE序列結合，并大量消耗細胞內(nèi)谷胱甘肽，最終使A549等細胞增殖活力下降并對化療藥物敏感性增強。此外，將LUT與順鉑聯(lián)合使用會對腫瘤細胞生長產(chǎn)生更明顯的抑制效用[52]。然而LUT并未在動物實驗和人體臨床實驗中進行更深入的研究，因而想要真正了解LUT對人體是否有其他副作用以及能否投入臨床使用還需要更多的實驗來檢驗。BRU是2011年被確認的一種NRF2抑制劑，該藥物從鴨膽子屬植物中提取純化[53]。研究[54]發(fā)現(xiàn)BRU可以通過損傷A549細胞DNA以及促進ROS生成從而提升A549對放化療藥物敏感性。Ren等[53]進一步發(fā)現(xiàn)BRU與順鉑等化療藥物聯(lián)合使用明顯誘導細胞發(fā)生凋亡，相比單獨使用化療藥物，BRU的加入顯著抑制了肺腫瘤的生長。研究[55]發(fā)現(xiàn)BRU可直接靶向Skp1抑制NSCLC細胞生長和侵襲，是治療NSCLC的潛力藥物。然而有報道分析[53,56]指出BRU具有抑制廣譜蛋白翻譯的特性，能對大多數(shù)蛋白質(zhì)尤其是短半衰期蛋白均起到降低表達的作用，這種無差別抑制作用使得BRU無法作為NRF2的特異性靶向藥物使用。雖然天然NRF2抑制劑在眾多細胞實驗中取得了顯著進展，但在與人體環(huán)境更為相似的體內(nèi)實驗中還處于緩慢發(fā)展階段，很多天然抑制劑能否被用于臨床還需要更多研究才能證明。隨著科研技術的發(fā)展，一些新型合成的NRF2抑制劑逐步進入大眾視野。Singh研究團隊[57]通過對臨床化合物的高通量篩選，發(fā)現(xiàn)ML385能與轉(zhuǎn)錄因子NRF2的DNA結合域特異性結合，阻斷其與下游靶基因啟動子區(qū)相互作用而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達，并且研究發(fā)現(xiàn)相對于NRF2野生型，NRF2突變型肺癌細胞在ML385刺激后表現(xiàn)出明顯的NRF2通路抑制效應[57]，同時ML385在與卡鉑等化療藥物聯(lián)合使用后抗腫瘤效果更顯著，ML385可進一步增強肺癌細胞對化療藥物的敏感性[57,58]。因此ML385被預測將作為NRF2特異性抑制劑成為NSCLC尤其是NRF2突變肺癌患者的新靶向藥。然而作為一種有治療前景的新型藥物，還需要更多的體內(nèi)實驗及后續(xù)臨床實驗來驗證其作為抗腫瘤藥物的有效性和安全性，同時ML385其抗腫瘤的具體分子機制還有待于更進一步的研究。

4 結論與展望

NR F2可以聯(lián)合多種機制參與并協(xié)調(diào)腫瘤細胞的生長過程，是腫瘤生長與增殖的重要調(diào)控因素。近年來隨著醫(yī)療技術的發(fā)展，許多增殖相關的基因被證實受到NR F2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但由于NR F2信號通路的復雜與多變，迄今為止尚不能完全解讀其調(diào)控細胞增殖的具體分子機制，仍然需要進一步探索。NR F2抑制劑的研發(fā)為NSCLC的治療提供了新的方向，但由于這類藥物缺乏可靠的臨床證據(jù)，未來能否運用到肺癌患者的治療中還需要更多的數(shù)據(jù)佐證。令人期待的是，靶向NRF2突變的藥物研發(fā)，將會是一種有潛力的NSCLC特異性治療方案，未來需要專門針對NRF2突變NSCLC患者開展臨床研究以實現(xiàn)更優(yōu)化的精準治療。