孟桂智，劉寶寶，李雅輝，馬燕芬，王興平，馬 云，蔡小艷

（寧夏大學農(nóng)學院/寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

microRNA （miRNA） 是一類含有18～24 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA 片段，屬于轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子［1］。 研究人員在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了Lin-4， 它只編碼小RNA 而不編碼蛋白質(zhì)，這類物質(zhì)后來被稱為miRNA；Lin-4 通過與其靶mRNA 的3′端非編碼區(qū)結(jié)合抑制靶基因的表達從而發(fā)揮作用［2］。 Zhang 等［3］研究發(fā)現(xiàn)大米中的miR-168a 能夠被消化道吸收進入肝臟，靶向作用于LDLRAP1，導致小鼠血漿中的低密度脂蛋白含量升高，由此引發(fā)人們對跨界miRNA 的研究興趣。 隨后發(fā)現(xiàn)， 金銀花中的miR-2911 可以抑制PB2 和NS1 基因的表達從而有效抑制流感病毒的復制，降低小鼠肺組織中的病毒滴度［4］。 隨著研究的不斷推進發(fā)現(xiàn)，動物源性的miRNA，如雞蛋中的miRNA 具有跨物種調(diào)控人體功能的作用［5］，并且發(fā)現(xiàn)牛奶外泌體中的miRNA 有類似功能［6］。 后期也有研究表明動物乳汁外泌體中的miRNA 也具有一定的調(diào)控作用， 例如牦牛乳來源的外泌體miRNA 可在缺氧環(huán)境中調(diào)節(jié)腸上皮細胞增殖［7］。與此相關的miRNA 結(jié)構(gòu)、跨物種后穩(wěn)定性、靶基因結(jié)合等方面的研究逐漸增加。 筆者對植物和動物miRNA 跨物種調(diào)控的研究進展進行系統(tǒng)和全面總結(jié)， 以期為后期深入探究其跨物種功能機制提供參考。

1 動植物miRNA 的結(jié)構(gòu)及結(jié)合靶基因的方式

1.1 miRNA 生物合成過程

動物體內(nèi)編碼miRNA 的基因主要存在于細胞核中，編碼基因首先經(jīng)RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ進行轉(zhuǎn)錄， 形成一個具有特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），經(jīng)腺苷酸化后形成多聚腺苷酸尾巴和類似mRNA 的帽子結(jié)構(gòu)。 pri-miRNA 在細胞核內(nèi)被Drosha 酶剪切后去掉兩邊多余的序列形成miRNA 前體 （pre-miRNA），pre-miRNA 被Exportin-5 轉(zhuǎn)運蛋白呈遞至細胞質(zhì)中，在Dicer 的作用下進一步剪切形成具有不完全配對的雙鏈RNA， 最后在RNA 解旋酶的作用下形成成熟miRNA 和miRNA*，成熟miRNA 可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合，從而形成miRNA 誘導的復合物RISC，可使基因沉默［8］。

植物中miRNA 的形成過程與動物miRNA 形成略有差異，植物體內(nèi)不含Drosha 酶，由與其具有相似功能的DCL1 代替， 因此，pri-miRNA 經(jīng)DCL1 剪切形成pre-miRNA，pre-miRNA 在DCL1酶剪切后形成長度為20 bp 左右的成熟miRNAmiRNA* 雙鏈復合物； 由HASTY （具有類似Exportin-5 轉(zhuǎn)運蛋白功能）從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，最后在Helicase 酶的作用下形成單鏈成熟的miRNA 并與AGO 等蛋白結(jié)合，形成有功能的復合物［1，9］。 動植物miRNA 生成過程雖存在差異，但都形成有功能的復合物發(fā)揮其穩(wěn)定的生物學功能。

1.2 miRNA 結(jié)構(gòu)特點及跨物種存在的穩(wěn)定性

miRNA 是生物體內(nèi)普遍存在的一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA， 其前體具有特殊的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)不僅包括傳統(tǒng)的堿基配對形式G：C、A：T（U）配對，還存在大量的G：U 堿基配對。 成熟miRNA 的5′端為磷酸基團，3′端為羥基， 動物的成熟體miRNA 及其前體序列在進化上相對保守，而植物miRNA 僅僅是其成熟體較為保守。 動物miRNA 前體的序列長度為60～80 個核苷酸，而植物miRNA 前體的長度變化較大，從幾十個堿基到幾百個堿基［10-11］。

動植物miRNA 在結(jié)構(gòu)上存在的最大區(qū)別是植物miRNA 3′末端具有2′-O-甲基化修飾， 不僅能增強miRNA 的穩(wěn)定性，還能保護甲基化修飾的miRNA 不會被核酸外切酶降解。 此外，甲基化修飾的miRNA 對氧化劑高碘酸鈉具有抗性［12-14］，因此，可利用這一特性區(qū)分動植物miRNA。 甲基化修飾的miRNA 不易被降解， 體現(xiàn)在植物miRNA跨物種存在于動物體內(nèi)，例如用地黃水煎劑灌喂小鼠，在小鼠的血液中發(fā)現(xiàn)了地黃源性的miRNA［15］。通過模擬人類消化系統(tǒng)處理煮熟后的大米和大豆， 雖然大米和大豆源性的miRNA 含量存在衰減，但仍然具有生物學活性［16］，這一現(xiàn)象的發(fā)生主要是因為植物中的miRNA 具有甲基化修飾，對熱穩(wěn)定，并且耐受消化道的酸性環(huán)境，動物采食消化后被小腸上皮細胞吸收側(cè)吸收， 通過上皮細胞分泌側(cè)分泌的囊性小泡或外泌體進入血液， 從而到達動物的多個器官［17-18］。

外泌體（exosomes，Exos）是由部分未被溶解酶降解的多囊體與細胞質(zhì)膜相融合， 使得多囊體中的小囊泡胞吐到細胞外的物質(zhì)［19-20］。 外泌體可以包被蛋白質(zhì)、miRNA 和mRNA， 被外泌體包被的miRNA 比游離的miRNA 穩(wěn)定性更強，用核糖核酸酶處理外泌體，其標志基因CD24 和GAPDH 的表達產(chǎn)物仍能被檢測到， 說明外泌體包被可保護miRNA 不受RNase 降解［13，21］。 外泌體的膜成分與其起源的細胞具有一定的同質(zhì)性，使得外泌體的信號傳遞具有一定的特異性，在細胞凋亡、腫瘤遷移、病毒擴散、免疫調(diào)控等方面都有重要作用［22-26］。 例如母乳中的miRNA 被微泡或外泌體包被，可抵抗核糖核酸酶、凍融循環(huán)和低酸堿度（pH=1）。 對牛乳進行巴氏消毒處理前后miRNA 基本保持不變，說明乳中miRNA 仍然具有活性，可參與調(diào)節(jié)嬰兒免疫系統(tǒng)發(fā)育［27-29］。 盡管外泌體是生物體內(nèi)細胞間通信和母嬰間通信的工具， 但它們也會被運輸?shù)酵耆吧奈锓N體內(nèi)特別是在人體內(nèi)， 例如結(jié)腸癌細胞（Caco-2）主要通過內(nèi)吞作用有效吸收牛奶外泌體［30］。這一現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)為miRNA 可跨物種調(diào)控提供了理論支持。

1.3 miRNA 與靶基因的結(jié)合方式

miRNA 主要通過與靶mRNA 結(jié)合調(diào)控靶基因的表達。 在植物中，miRNA 與mRNA 幾乎完全互補配對，miRNA 主要通過5′端的2～8 位堿基與其靶mRNA 互補配對［31］。 當植物miRNA 和目的mRNA 配對不完全時，miRNA 會抑制目的mRNA的翻譯，當miRNA 與mRNA 完全互補時，引起目的mRNA 在互補區(qū)域內(nèi)發(fā)生特異性斷裂， 剪切發(fā)生在miRNA 的5′端到3′端第10～11 位核苷酸，mRNA 被降解后失去編碼蛋白質(zhì)的功能， 從而導致基因沉默［32-34］。 在動物中，多數(shù)miRNA 以不完全互補方式與其靶mRNA 的3′UTR 區(qū)結(jié)合，從而阻礙該mRNA 的翻譯， 但不影響mRNA 的穩(wěn)定性［35］。

動物miRNA 主要作用于靶mRNA 的3′UTR區(qū)， 從而通過改變靶mRNA 上核糖體密度或特異性降解新合成的多肽鏈抑制mRNA 的翻譯，此外，miRNA 還有可能作用于靶mRNA 的5′UTR 區(qū)發(fā)揮功能［36］。與動物miRNA 相比，植物miRNA 與靶mRNA 的轉(zhuǎn)錄區(qū)基本上為完全互補， 其作用方式主要是使靶mRNA 降解從而抑制mRNA 翻譯，但也存在例外， 如植物中的miR-172 與其靶序列AP2 mRNA 雖然高度互補， 但引起AP2 蛋白表達受抑，而AP2 mRNA 的水平?jīng)]有降低［37］。

動植物miRNA 跨物種調(diào)控的方式可能存在些許差異， 例如在植物miR-168a 跨界調(diào)控動物肝臟LDLRAP1 蛋白的表達中，miR-168a 發(fā)揮作用的方式與哺乳動物miRNA 相似， 但miR-168a與LDLRAP1 編碼區(qū)靶基因序列近乎完全互補，這又顯示它的作用方式類似植物miRNA，說明當植物miRNA 可以跨界調(diào)控動物時， 結(jié)合了動植物miRNA 的作用方式［3］。 動物miRNA 跨物種調(diào)控主要是因為動物中的部分miRNA 具有同源性，因此，它們的作用方式主要是動物miRNA 的作用方式， 例如miR-148a 是提高奶牛產(chǎn)奶量的馴化基因， 并且與人類miR-148a 的核苷酸序列完全相同， 允許牛奶和消費者基于miRNA 的跨物種交流［6，38-39］。

2 動植物miRNA 發(fā)揮類似的生物學功能

動植物miRNA 均能參與調(diào)節(jié)細胞生長分化、生物個體發(fā)育、組織分化、控制細胞增殖和凋亡、病毒感染、能量代謝、免疫應答、疾病發(fā)生發(fā)展等。正是由于動植物miRNA 可發(fā)揮類似的生物學功能，動植物miRNA 可跨物種調(diào)控才成為可能。

2.1 細胞分化

動物中miR-17 和miR-20a 均能有效促進C2C12 成肌細胞和原代牛衛(wèi)星細胞的分化，miR-18a 可能在C2C12 細胞分化中起負調(diào)控作用，而miR-19 和miR-92a 對細胞分化的影響不大［40］；植物miR-172 通過靶向作用APETALA2 類基因參與調(diào)控植物開花誘導、花器官形態(tài)、果實成熟、葉片和根生長等各器官的發(fā)育過程［41］。

2.2 細胞增殖與凋亡

動物miR-138-5p 靶向作用于PD-L-1 抑制乳腺癌細胞的增殖和運動，誘導細胞凋亡［42］。植物miR-319 調(diào)控TCP 轉(zhuǎn)錄因子參與多種發(fā)育途徑，包括葉片發(fā)育和衰老、器官彎曲、激素合成和信號轉(zhuǎn)導等，其中，TCP4 參與調(diào)控細胞增殖，當TCP4活性的小幅增加通過顯著減少細胞增殖實現(xiàn)時，對葉片細胞數(shù)量有直接影響［43］。

2.3 免疫應答

動物miR-181a 可能通過TLR4 受體通路調(diào)節(jié)細胞因子的表達， 進而參與抗血吸蟲感染的免疫調(diào)節(jié)［44］； 棉花miR-477 通過靶向作用于GhCPB60A 提高對黃萎病的抗性［45］。

3 動植物miRNA 跨物種后具有組織特異性

植物miRNA 跨物種進入動物體內(nèi)具有一定的組織特異性，miRNA 通過胃腸道進入動物體后通常存在于組織和體液中， 表達豐度低， 在宿主miRNA 中僅占0.001%［46］。 6 名健康受試者連續(xù)食用5～7 d 的素食， 發(fā)現(xiàn)糞便中的植物源性miR-168 水平明顯升高，在淺層黏膜、結(jié)腸黏膜和腹水中檢測到植物源性miR-168［47］。 給小鼠飼喂甘藍后，miR-172 在不同器官中的范圍為0.05%～4.50%，在胃腸道、血液、脾臟、肝臟和腎臟中均可檢測到，在胃中最高可被吸收4.5%［48］。 給豬飼喂新鮮玉米后， 血清和組織中可檢測到玉米miRNA，血清中玉米miRNA 濃度在0.01～0.15 fmol/g，心臟、肝臟、脾臟等組織中的濃度為0.001～0.500 fmol/g［49］。 灌喂人工合成玉米miR-164a-5p、miR-167e-5p 和miR-168a-3p 24 h 后， 豬組織中3 種玉米miRNA 濃度在0.05～0.80 fmol/g；各組織間玉米miRNA 含量存在差異，miR-164a-5p 在眼肌中含量最高（0.21 fmol/g），在肺臟中最低（0.11 fmol/g），miR-167e-5p 在心臟中濃度最高 （0.79 fmol/g），在背部皮下脂肪中最低（0.16 fmol/g）［50］。 這一現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于植物囊泡上的糖蛋白與微囊泡細胞的表面相容性差［51］。

人飲用牛奶后血液中牛乳外泌體含量升高，表明通過腸道上皮細胞可100%運輸牛乳成分，并在血液中停留長達9 h，在肝臟和脾臟等器官停留長達24～48 h［30］。 牛乳外泌體中的miRNA 可以進入人類的循環(huán)系統(tǒng)［52］。 在小鼠模型中的時間進程分析表明，在攝入后3 h，外泌體miRNA 仍分布在肝臟、脾臟、心臟和肺中［53］。 以上研究表明植物miRNA 跨物種進入動物體內(nèi)的組織特異性更高，而動物miRNA 組織特異性不是很明顯，但存在時間較長，兩者都可穩(wěn)定存在。

4 動植物miRNA 跨物種調(diào)控的研究進展

早期研究發(fā)現(xiàn)，細胞可分泌miRNA 并進入受體細胞進行基因表達調(diào)控這一 “跨界調(diào)控”［2］，后期研究發(fā)現(xiàn)食源性miRNA 可靶向作用于動物mRNA 從而發(fā)揮重要作用。

4.1 植物源性miRNA 跨物種調(diào)控

植物miRNA 跨物種調(diào)控目前已有很多報道，例如中草藥、西藍花、大豆、苜蓿、辣木等植物中的miRNA 均有跨物種調(diào)控的作用，主要涉及對癌癥以及病毒的調(diào)控。

中草藥洪景天中的HJT-sRNA-m7 可與該草藥煎液中的油溶性化學物質(zhì)形成復合脂質(zhì)體，促進HJT-sRNA-m7 在細胞中的攝取， 中藥煎液中的衍生物可能會與sRNA 形成脂質(zhì)體復合物，從而進入肺泡和胃細胞， 有效減少纖維化標志基因和蛋白在體外肺泡細胞和體內(nèi)小鼠肺組織的表達［54］。 有研究發(fā)現(xiàn)，金銀花中的miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒復制， 加速感染者的陰性轉(zhuǎn)化； 首先在細胞層面使miR-2911 過表達，用SARS-CoV-2 感染細胞24 h 后，定量分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比miR-2911 抑制了93%的病毒復制，說明金銀花湯中的miR-2911 可以抑制SARSCoV-2 病毒的復制；隨后評估了金銀花湯中miR-2911 對新冠肺炎患者陰性轉(zhuǎn)化率的影響， 將75例中度新冠肺炎患者分為兩組， 一組為金銀花湯組 （miR-2911+）， 另一組為傳統(tǒng)的中藥治療組（miR-2911-），miR-2911+組的7 d 陰性轉(zhuǎn)化率為83.3%；說明金銀花湯中的植物miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒復制并加速感染者的陰性轉(zhuǎn)化，并且有極大可能幫助治療感染，阻止新冠肺炎大流行［55-57］。 辣木植物中的miRNA 可誘導減少細胞內(nèi)HIV p24 蛋白和病毒DNA 整合，降低病毒的感染率［58］。

西藍花中高表達的miR-156a 能結(jié)合至JAM-A 蛋白的3′UTR 區(qū)抑制鼻咽癌細胞株上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化［59］；苜蓿miR-5754 和大豆miR-4995通過靶向作用于腫瘤相關的長非編碼RNA 轉(zhuǎn)移相關的基因MALAT1 和NET 1 減少癌細胞的產(chǎn)生［60］；植物miR-159 的合成模擬物能夠通過靶向編碼Wnt 信號轉(zhuǎn)錄因子的TCF7 抑制哺乳動物癌細胞增殖［61］； 植物源性miR-156a 通過靶向作用Wnt/β-catenin 通路中Wnt10b 抑制哺乳動物腸上皮細胞的增殖［62］； 此外， 還發(fā)現(xiàn)植物源性miR-167e-5p 通過下調(diào)β-連環(huán)蛋白的基因和蛋白水平抑制哺乳動物腸上皮細胞增殖［63］。 這些現(xiàn)象都表明植物miRNA 可跨物種調(diào)控，為后期治療疾病或提高免疫力提供新的思路。

此外，有研究發(fā)現(xiàn)植物miRNA 還可以通過母體傳遞給胎兒。 通過qPCR 在小鼠胎兒中也發(fā)現(xiàn)了植物miRNA，說明miRNA 可能通過胎盤轉(zhuǎn)移至胎兒［64］。研究者對金銀花miR-2911 和流感病毒的成熟miRNA 進行追蹤， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)母體血漿中miRNA 均顯著增加，在胎兒中也顯著升高，說明miRNA 可以通過胎盤轉(zhuǎn)移至胎兒，可為胎兒健康發(fā)育和治療母體子宮疾病提供一種新的研究策略［64］。 熊貓乳汁外泌體中存在竹子源性miRNA，并且通過靶基因富集分析發(fā)現(xiàn)表達量排名前十位的外源性miRNA 主要參與基本的細胞代謝和神經(jīng)發(fā)育，表明外源性miRNA 在大熊貓幼仔出生后的發(fā)育過程中發(fā)揮潛在作用［65］。 給妊娠90 d 的經(jīng)產(chǎn)金華母豬飼喂玉米后，在母豬血清、肝臟和胎兒肝臟、 脾臟等組織中均能檢測到玉米miRNA，說明母豬采食玉米后玉米miRNA 可傳遞給胎兒［13］；在泌乳期母豬的乳汁外泌體中也檢測到了植物miRNA［66］。

4.2 動物源性miRNA 跨物種調(diào)控

動物miRNA 跨物種調(diào)控主要是人通過采食動物性產(chǎn)品例如牛奶和雞蛋， 參與調(diào)控以及在一種動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)另一種動物的miRNA 調(diào)控。

乳汁中的miRNA 主要通過外泌體進入人體，并進入循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用。 例如母乳中的miR-223 可靶向作用T 細胞和粒細胞群對嬰兒免疫系統(tǒng)產(chǎn)生作用［52，67］；妊娠期間大量攝入牛乳中的必需支鏈氨基酸和miR-21 會使得胎盤和胎兒過度生長［68］； 雞蛋攜帶的miRNA 可進入人的外周組織，影響外周血單核細胞中的基因表達［5，51］。 豬乳外泌體miRNA 通過抑制小鼠腸上皮細胞中的TLR4/NF-κB 和p53 通路減弱LPS 誘導的細胞凋亡，從而保護腸上皮細胞免受LPS 誘導的損傷［69］；水牛的牛奶外泌體衍生的miRNA 與免疫反應和代謝過程有關［70］。

5 展望

通過以上論述發(fā)現(xiàn)，動植物miRNA 由于自身的特殊結(jié)構(gòu)或外泌體的包被， 被動物吸收進入攝食者體內(nèi)仍具有一定的穩(wěn)定性和組織特異性，且可跨物種調(diào)控攝食者的靶基因表達和生理功能。植物中的小分子物質(zhì)對于攝食者是否都發(fā)揮正向調(diào)控作用或展現(xiàn)出積極的一面， 目前尚未完全闡明，因此，需要更多的研究驗證。 目前已有研究表明在服用中草藥后可提高機體抵抗力或治愈疾病， 這一作用機制可從植物跨界調(diào)控這方面的研究進行闡述，但在動植物跨界過程中，攝食者的個體差異對于跨物種調(diào)控的影響有多大， 目前的研究還較少，需要更多深入的研究進行闡明。動植物miRNA 可跨界調(diào)控的研究有重要意義： 一方面，在植物分子育種中通過選育特定高表達植物miRNA 的新品系或新品種，可充分利用自然界豐富的遺傳資源， 使遺傳物質(zhì)在植物和動物之間進行交流，為植物分子育種提供新思路和新方向；另一方面，動植物miRNA 可在攝食者體內(nèi)穩(wěn)定存在并發(fā)揮作用，提取這些特殊的miRNA 或人工合成miRNA 可用于治療疾病和補充營養(yǎng)，改善動物生產(chǎn)性能，其應用潛力和價值值得深入探討。 為此，對動植物miRNA 的調(diào)控功能進行更全面深入地了解， 將對疾病治療和提升動物生產(chǎn)性能有重要作用。