李運(yùn)娜，王 冠，賈 皓，戴曉光，蘇勝杰，王旭紅

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的急性傳染病。ASFV是非洲豬瘟病毒科的唯一成員，可使不同年齡的家豬和野豬感染。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將ASF規(guī)定為法定報(bào)告的疫病，該病不是人畜共患病，對(duì)公共衛(wèi)生安全的影響較小，但給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

ASFV是一種DNA蟲(chóng)媒病毒，可以通過(guò)直接接觸或者軟蜱傳播。ASFV基因組長(zhǎng)達(dá)190 kb，病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，5個(gè)病毒結(jié)構(gòu)層分布200多種蛋白，包括50多種結(jié)構(gòu)蛋白，150多種非結(jié)構(gòu)蛋白。由于其病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜，變異度高，具有免疫逃避機(jī)制，給疫苗的研發(fā)帶來(lái)一定困難［1-3］。ASFV可在豬群中快速流行和傳播。此外，該病毒在環(huán)境中的穩(wěn)定性較高，可存活數(shù)月甚至數(shù)年。這都給疫病的控制帶來(lái)了重大的挑戰(zhàn)。有效控制ASF疫情擴(kuò)散、研制安全有效的疫苗是當(dāng)前面臨的最大挑戰(zhàn)，該文對(duì)ASF疫苗的研究情況進(jìn)行論述。

1 滅活疫苗

滅活疫苗是經(jīng)物理或者化學(xué)方法處理，消除ASFV致病性保留其抗原性的安全疫苗。由于滅活疫苗的技術(shù)路線相對(duì)成熟，最早應(yīng)用在ASF疫苗的研制上，但該疫苗并不能提供有效的保護(hù)性［4-5］。Blome等［6］將免疫佐劑PolygenTM或EmulsigenR-D（這些佐劑不僅能刺激體液免疫反應(yīng)，還能刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)［7-8］）加入ASF滅活疫苗，再次評(píng)估其保護(hù)性。利用添加佐劑的ASF滅活疫苗免疫豬，6周后用同源強(qiáng)毒ASFV攻擊免疫豬，雖然所有的免疫豬都產(chǎn)生了特異性抗體（可能該抗體并不具備中和活性），但均表現(xiàn)急性經(jīng)過(guò)，疫苗并不具備保護(hù)作用。該研究表明即使加入免疫佐劑，滅活疫苗對(duì)ASFV的感染仍然無(wú)有效的保護(hù)作用。

2 減毒活疫苗

研究認(rèn)為減毒活疫苗是最有希望用于預(yù)防ASF的疫苗，目前主要研究的有天然弱毒株疫苗、基因缺失弱毒株疫苗以及傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗。減毒活疫苗能誘導(dǎo)免疫動(dòng)物產(chǎn)生細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答，對(duì)免疫動(dòng)物能夠提供較高水平的保護(hù)。

2.1 天然弱毒株疫苗

有研究表明，接種OURT88/3［9］、NH/P68［10］或者Lv17/WB/Rie1［11］后，免疫豬對(duì)同型強(qiáng)毒的攻擊有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其中OURT88/3致弱毒株經(jīng)鼻內(nèi)免疫保護(hù)率高達(dá)100%，免疫豬僅表現(xiàn)輕微短暫的臨床癥狀；NH/P68致弱毒株，對(duì)于同源毒株（Lisbon60）或者異源毒株（Armenia07）的攻擊，提供了100%的保護(hù)，但在免疫豬中有著明顯的副作用；Lv17/WB/Rie1減毒株口服免疫野豬，對(duì)于強(qiáng)毒株的攻擊保護(hù)率可達(dá)到92%，免疫野豬沒(méi)有表現(xiàn)出任何臨床癥狀。雖然該疫苗對(duì)同型強(qiáng)毒株有高水平的保護(hù)作用，但該疫苗生產(chǎn)困難，且安全性令人擔(dān)憂，可產(chǎn)生高熱、肺炎、運(yùn)動(dòng)障礙、母豬流產(chǎn)等副作用。

2.2 基因缺失弱毒株疫苗

通過(guò)基因敲除技術(shù)獲得的基因缺失毒株，不但毒力減弱而且能夠抵抗同源毒株的攻擊［12］。目前，研究主要集中在刪除免疫逃避基因或與病毒復(fù)制有關(guān)的基因。

對(duì)于ASF弱毒株，之前的研究已經(jīng)表明，從不同的毒株里刪除同一基因會(huì)有不同的結(jié)果，例如：從BA71病毒株中刪除編碼CD2v蛋白的EP402R基因，則病毒致病性減弱的同時(shí)會(huì)引起保護(hù)性反應(yīng)；而從Georgia/2010株刪除同一基因，病毒的毒力并未減弱［13-14］。從Georgia07株同時(shí)刪除9GL和UK基因，對(duì)于同毒株的攻擊提供100%的保護(hù)，而且疫苗的安全性比單獨(dú)刪除9GL基因更高。這可能是因?yàn)樘囟ɑ虮粍h除后功能得到了平衡［15］，因此，在研發(fā)ASF基因缺失弱毒株疫苗時(shí)，為了減弱毒力，減少副作用，提高保護(hù)性，要考慮不同的毒株刪除的基因不同或者對(duì)同一毒株同時(shí)刪除幾個(gè)基因。

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建的ASF基因缺失弱毒株HLJ/18-7GD，缺失7個(gè)基因，在SPF豬、商品豬和懷孕母豬體內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)后毒力被減弱，不能轉(zhuǎn)為強(qiáng)毒株。當(dāng)豬只被致命的ASFV攻擊時(shí)，該弱毒株（HLJ/18-7GD）為豬提供了完全保護(hù)。該疫苗具有較好的保護(hù)性和安全性，有望在控制ASFV傳播方面發(fā)揮重要作用［16］。

2.3 傳代培養(yǎng)弱毒株疫苗

ASFV在細(xì)胞內(nèi)傳代培養(yǎng)后，致病性大大減弱，這為ASF疫苗的成功研制帶來(lái)了新的希望。ASFV經(jīng)Vero細(xì)胞傳代培養(yǎng)后致病性逐漸減弱，但抗原性和穩(wěn)定性也發(fā)生了改變，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)的毒株免疫豬后，并沒(méi)有產(chǎn)生有效的抗體。但實(shí)驗(yàn)室研制的ASFV弱毒株（血清Ⅰ型：LK-111株、Katanga-350株；血清Ⅱ型：KK-202株；血清Ⅲ型：MK-200株；血清Ⅳ型：FK-32/135株；血清Ⅴ型：TSP-80/300株；血清Ⅵ型：TS-7/230株；血清Ⅶ型：UK-50株；血清Ⅷ型：RK-30株）經(jīng)豬骨髓細(xì)胞傳代培養(yǎng)后接種豬，對(duì)強(qiáng)毒株的攻擊可以提供有效的保護(hù)［17］。

ASFV傳代培養(yǎng)弱毒株是未來(lái)有望推向市場(chǎng)的候選方向之一，俄羅斯研制的傳代細(xì)胞適應(yīng)株（Arriah CV-1株）被歐盟作為未來(lái)重點(diǎn)研究的候選株［18］。

3 亞單位疫苗

亞單位疫苗是最安全的特異性抗原疫苗。研究表明，ASFV結(jié)構(gòu)蛋白基因p30、p54、p72、pp62和膜蛋白基因CD2v具有良好的抗原性，能夠參與病毒感染的多個(gè)階段，構(gòu)建的亞單位疫苗能夠促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但對(duì)于強(qiáng)毒株的攻擊保護(hù)作用較弱。

p54和p30結(jié)構(gòu)蛋白分別參與病毒的吸附和內(nèi)吞作用，兩者能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體。用p54或p30抗原免疫豬并不能產(chǎn)生保護(hù)作用；用p54和p30抗原同時(shí)免疫豬可以延遲臨床癥狀的出現(xiàn)，6頭免疫豬中的3頭免受E75毒株的攻擊；桿狀病毒表達(dá)的p54、p30融合蛋白免疫豬，對(duì)于E75毒株的攻擊可產(chǎn)生保護(hù)性作用［19］；該病毒表達(dá)的p54、p30、p72蛋白免疫豬雖然可以使機(jī)體產(chǎn)生抗體，但對(duì)于Pr4株不能提供保護(hù)作用［20］。

ASFV粒子的復(fù)雜性和細(xì)胞內(nèi)外兩種感染形式導(dǎo)致難以產(chǎn)生有效的病毒中和抗體。也許識(shí)別抗原的中和表位與非中和表位有利于設(shè)計(jì)更有針對(duì)性的免疫反應(yīng)提高疫苗的保護(hù)性。

4 DNA疫苗

研究表明，ASFDNA疫苗能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的CTL免疫反應(yīng)，具有良好的開(kāi)發(fā)潛力。

ASFDNA疫苗在大動(dòng)物體內(nèi)具有較差的免疫原性，將編碼ASFV的2個(gè)基因（pCMV-PQ）的DNA疫苗免疫豬，實(shí)驗(yàn)豬并未產(chǎn)生免疫反應(yīng)，該DNA疫苗卻能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫反應(yīng)。將該DNA疫苗融合編碼ASF白細(xì)胞抗原2的基因片段，可以增強(qiáng)豬的免疫反應(yīng)，但對(duì)于強(qiáng)毒株的攻擊仍不能提供保護(hù)作用［21］。

將重組蛋白pCD2-E、重組質(zhì)粒pcDNA312R共同免疫豬后，在體內(nèi)可刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，但對(duì)于強(qiáng)毒株Arm07的攻擊并無(wú)保護(hù)作用［22-23］。將編碼ASFV胞外區(qū)HA與p54、p30的基因片段構(gòu)建DNA疫苗，雖然增強(qiáng)了豬的體液和細(xì)胞應(yīng)答，但沒(méi)有保護(hù)能力［24］。將泛素基因和p54、p30基因共同免疫豬后，可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，即使沒(méi)有特異性抗體存在也能提供部分保護(hù)，說(shuō)明DNA疫苗可通過(guò)修飾攜帶的抗原增強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答［25-26］。也有研究表明，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在ASFV攻擊時(shí)起到了重要的保護(hù)作用。進(jìn)一步的研究可以考慮在抗體介導(dǎo)的保護(hù)反應(yīng)和細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)反應(yīng)中建立一種關(guān)聯(lián)。

5 病毒活載體疫苗

用腺病毒、偽狂犬病病毒、牛痘病毒或者新城疫病毒作為載體構(gòu)建的疫苗，可以更好地刺激細(xì)胞免疫和CTL效應(yīng)［27-29］，但其免疫保護(hù)效力需要進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

Chen等［30］通過(guò)反向遺傳學(xué)構(gòu)建并表達(dá)了ASFV p72蛋白的重組新城疫病毒，并在小鼠模型中評(píng)估其體液和細(xì)胞免疫原性。用rNDV p72免疫小鼠時(shí)產(chǎn)生了高滴度的特異性的IgG抗體，并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和分泌干擾素-γ、白細(xì)胞介素-4，該疫苗對(duì)豬的保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。以腺病毒為載體表達(dá)的多種抗原（p32、p54、p72、pp62）免疫野豬后，誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IgGs、IFN-γ、CTL反應(yīng)，但對(duì)于ASFV-Georgia2007/1株的鼻內(nèi)攻擊，并不提供保護(hù)作用［31］。

6 小結(jié)與展望

研究人員雖然在ASF疫苗的研發(fā)上付出了很大的努力，但在上市之前仍然有很多問(wèn)題需要解決。ASF滅活疫苗已被證明是無(wú)效的［4-5］。開(kāi)發(fā)有效的亞單位疫苗需要尋找特定的保護(hù)性病毒抗原，以及合適的抗原傳遞系統(tǒng)免疫動(dòng)物。減毒活疫苗雖然可以引起強(qiáng)而持久的免疫反應(yīng)，但該疫苗的安全性亟待解決，包括它的副作用（皮膚損傷、關(guān)節(jié)腫脹等）和在農(nóng)場(chǎng)傳播的可能性；減毒活疫苗的另一個(gè)問(wèn)題是缺乏穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系，因?yàn)锳SFV優(yōu)先在原代單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞中復(fù)制。與亞單位疫苗、減毒活疫苗相比，DNA疫苗具有副作用少安全性高的優(yōu)點(diǎn)，但具有較差的免疫原性，雖然能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)但不能提供免疫保護(hù)作用。

目前，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所構(gòu)建的ASF弱毒疫苗（HLJ/18-7GD株）遺傳穩(wěn)定，接種后對(duì)育肥豬無(wú)不良影響，對(duì)田間商品豬保護(hù)率在80%以上；由于繁殖母豬生產(chǎn)周期為3～5年，對(duì)繁殖母豬的影響有待進(jìn)一步觀察。該疫苗限于全進(jìn)全出商品育肥豬，暫不用于繁殖用的母豬及種公豬［32］。該疫苗有望成為商品疫苗預(yù)防ASF。