李紅，譚君，牟云，高劍峰*

（1 石河子大學(xué)藥學(xué)院/新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003;2 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003）

小球藻是一種真核、單細(xì)胞綠色微藻，廣泛分布于淡水、土壤和荒漠中[1]。它是一種光合自養(yǎng)生物，已廣泛用于與微藻能源生產(chǎn)相關(guān)的研究[1-2]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)小球藻的研究多集中于淡水小球藻，而關(guān)于沙漠藻類(lèi)的研究很有限。沙漠小球藻生長(zhǎng)在極其干旱的環(huán)境中，酷熱時(shí)最高氣溫67.2 ℃，晝夜溫差40 ℃以上，蒸發(fā)量大，冬季寒冷，降水量少[3]。Lewis等[4]發(fā)現(xiàn)，沙漠綠藻從水生綠藻至少獨(dú)立進(jìn)化了5次。因此，沙漠小球藻適應(yīng)了極其惡劣的干旱環(huán)境，使其成為研究單細(xì)胞水平抗逆分子生物學(xué)的絕佳材料[5]。

近些年來(lái)，對(duì)沙漠微藻的研究主要集中在微生物結(jié)皮的藻類(lèi)組成、結(jié)皮形成的特征和功能[4,6]，以及沙漠微藻的分類(lèi)、培養(yǎng)方法、油脂富集上[6-8]。對(duì)干旱脅迫下微藻包括小球藻生長(zhǎng)特性的研究較少[9-10]。聚乙二醇（PEG）具有較高的親水性，被廣泛用作微藻水分脅迫劑模擬干旱環(huán)境進(jìn)行研究[5,11]。丁振等[11]研究發(fā)現(xiàn)聚乙二醇模擬干旱脅迫會(huì)抑制發(fā)狀念珠藻的生長(zhǎng)。牟云等[5]研究發(fā)現(xiàn)，PEG-6000抑制小球藻生物量的增長(zhǎng)和可溶性蛋白的合成。

為了弄清楚干旱脅迫與小球藻生長(zhǎng)特性之間的關(guān)系，本研究以新疆沙漠來(lái)源小球藻TLD2A1、TLD6B、GTD7c-2、GTD8A1為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)比較4株小球藻在模擬干旱脅迫條件下，其OD680值、致死率、生物量、比生長(zhǎng)速率受到的影響，篩選出了對(duì)干旱脅迫耐受性最優(yōu)的沙漠小球藻菌株，并優(yōu)化了菌株的持續(xù)干旱脅迫條件。本研究將為后期沙漠小球藻耐干旱脅迫的生理學(xué)和分子生物學(xué)研究提供材料和基礎(chǔ)，也為小球藻耐旱藻種的選育應(yīng)用，及其生態(tài)功能的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種來(lái)源

供試TLD2A1、TLD6B、GTD7c-2、GTD8A1的4株沙漠藻種由本實(shí)驗(yàn)室從新疆古爾班通古特、塔克拉瑪干沙漠收集，從沙樣中分離、純化并鑒定為小球藻（Chlorellasp.）[6,12-13]。

1.1.2 培養(yǎng)基

小球藻的培養(yǎng)采用BBM培養(yǎng)基[14]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 小球藻干旱脅迫處理

干旱脅迫處理：將初始OD680≈0.1，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4株小球藻藻種按照20%的等體積比例接種量接種于300 mL BBM培養(yǎng)基中，并添加PEG-6000使培養(yǎng)基中PEG-6000的濃度分別保持在0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·mL-1，以模擬不同水平的干旱脅迫處理，并最終補(bǔ)充培養(yǎng)基至500 mL，同時(shí)以不添加PEG-6000的小球藻培養(yǎng)液為對(duì)照，所有實(shí)驗(yàn)每個(gè)重復(fù)3次。接種后放置于光照強(qiáng)度72 μmol·m-2·s-1，光暗周期12 h/12 h，溫度23 ℃的光照箱中進(jìn)行一批次培養(yǎng)，每天定時(shí)搖勻3次，防止其貼壁生長(zhǎng)，培養(yǎng)周期為24 d。分別在第0、6、12、18、24 d的同一時(shí)間測(cè)定每組藻細(xì)胞OD680和生物量等指標(biāo)。

1.2.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

細(xì)胞密度用光密度表示，每隔48 h取藻液樣品3 mL用分光光度計(jì)測(cè)量吸光度（OD680），繪制不同培養(yǎng)條件下4株小球藻的生長(zhǎng)曲線[7]。微藻致死率計(jì)算參照劉婷婷等[15]的方法，致死率=[（對(duì)照組測(cè)定值OD值-實(shí)驗(yàn)組測(cè)定OD值）/對(duì)照組測(cè)定OD值]×100%。每隔6 d取藻液樣品50 mL，8 000 r·min-1離心15 min，去離子水渦旋洗滌藻體3遍（每次5～10 s），離心棄上清，于80 ℃下烘干24 h，測(cè)干重得生物量[16]。比生長(zhǎng)速率計(jì)算使用Wang等[17]的方法。

（1）

式中μ為比生長(zhǎng)速率（mg·L-1·d-1），N0為前一次取樣時(shí)的生物量（mg·L-1），N1為本次取樣時(shí)的生物量（mg·L-1），t0和t1是對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間，此處t1-t0=6（d）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0和Excle進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間采用單因素方差分析確定組間差距，并進(jìn)行LSD 檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖采用SigmaPlot 12.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬持續(xù)干旱脅迫對(duì)4株沙漠小球藻生長(zhǎng)的影響及比較

正常培養(yǎng)條件下，4株沙漠小球藻在第6 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第18 d前迅速增加，在第24 d時(shí)明顯減慢，進(jìn)入穩(wěn)定期，在第30 d左右出現(xiàn)衰亡（圖1）。同等培養(yǎng)條件下，小球藻TLD2A1的OD680值顯著低于其它3株（P<0.05），其余3株小球藻正常狀態(tài)下的生長(zhǎng)曲線相似，小球藻TLD6B、GTD8A1的OD680值大于其他2株藻，且穩(wěn)定?；?株小球藻的生長(zhǎng)曲線，后續(xù)脅迫實(shí)驗(yàn)選擇測(cè)定生長(zhǎng)的取樣時(shí)間點(diǎn)為第0、6、12、18、24 d。

*: P<0.05。圖1 4株小球藻正常狀態(tài)下生長(zhǎng)曲線

模擬持續(xù)干旱脅迫下，與對(duì)照組相比4株小球藻OD680值隨PEG-6000濃度的增大而顯著減?。▓D2，P<0.05），致死率隨著PEG-6000濃度的增大而顯著增大（圖3，P<0.05）。干旱脅迫后，小球藻TLD2A1的OD680值明顯小于其他3株藻；PEG-6000濃度為0.1 g·mL-1持續(xù)脅迫第12 d時(shí)，小球藻GTD7c-2的OD680值差異不顯著（P<0.05），但PEG-6000濃度為0.2 g·mL-1時(shí)，OD680值劇減到0.14～0.24；小球藻TLD6B的OD680值略大于GTD8A1（圖2）。當(dāng)PEG-6000的濃度大于等于0.3 g·mL-1時(shí)，4株小球藻在第24 d致死率達(dá)到61.2%～81.2%，小球藻細(xì)胞數(shù)量基本不增長(zhǎng)，說(shuō)明此干旱脅迫嚴(yán)重抑制了小球藻的生長(zhǎng)。

*: P<0.05。圖2 模擬持續(xù)干旱脅迫對(duì)4株小球藻生長(zhǎng)的影響（OD680）

*: P<0.05。圖3 模擬持續(xù)干旱脅迫對(duì)4株小球藻的致死曲線

模擬持續(xù)干旱脅迫下，與對(duì)照組相比4株小球藻生物量隨PEG-6000濃度的增大而顯著減小（P<0.05），隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大（圖4）；整體上，比生長(zhǎng)速率隨著PEG-6000濃度的增大而顯著減?。≒<0.05），隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后減?。▓D5）。干旱脅迫后，小球藻TLD2A1的生物量明顯小于其他3株藻；其中小球藻GTD7c-2的生物量略小于TLD6B、GTD8A1，但當(dāng)PEG-6000濃度為0.2 g·mL-1時(shí)，其生物量劇減到0.15～0.26；小球藻TLD6B、GTD8A1的生物量相近（圖4）。當(dāng)PEG-6000的濃度大于等于0.3 g·mL-1時(shí)，4株小球藻在前6 d的比生長(zhǎng)速率小于0，但此后比生長(zhǎng)速率均恢復(fù)正值，說(shuō)明此干旱脅迫初期小球藻的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重的抑制。此外，發(fā)現(xiàn)模擬持續(xù)干旱脅迫下，與對(duì)照組相比4株小球藻生物量的變化與OD680值的變化具有相似的趨勢(shì)，進(jìn)一步地說(shuō)明干旱脅迫抑制了小球藻的生長(zhǎng)。

*: P<0.05。圖4 持續(xù)干旱脅迫對(duì)4株小球藻生物量的影響

*: P<0.05。圖5 持續(xù)干旱脅迫對(duì)4株小球藻比生長(zhǎng)速率的影響

基于圖2—4，通過(guò)比較脅迫條件與正常培養(yǎng)條件下4株沙漠小球藻生長(zhǎng)的情況，模擬干旱脅迫下4株小球藻生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制。

總體來(lái)說(shuō)，菌株GTD7c-2干旱脅迫后生長(zhǎng)不穩(wěn)定；TLD2A1耐干旱脅迫，但生物量、比生長(zhǎng)速率最??；小球藻TLD6B生長(zhǎng)速率最大，生物量最大，顯示了極好的干旱脅迫耐受性，且生長(zhǎng)穩(wěn)定。因此，選擇小球藻菌株TLD6B作為進(jìn)一步研究干旱脅迫下沙漠小球藻生理特性的藻株。

2.2 小球藻TLD6B模擬持續(xù)干旱脅迫梯度的確定

根據(jù)模擬干旱脅迫下小球藻TLD6B生長(zhǎng)的狀況，從菌株資源開(kāi)發(fā)利用的角度，確定干旱脅迫下小球藻TLD6B培養(yǎng)液中PEG-6000濃度范圍為：0.0～0.3 g·mL-1。進(jìn)一步精細(xì)化確定模擬脅迫的梯度，PEG-6000濃度分別為0.0、0.05、0.1、0.2、0.3 g·mL-1，小球藻菌株TLD6B的生長(zhǎng)速率逐漸下降，但在持續(xù)干旱脅迫第24 d OD680值仍然達(dá)到0.125，致死率在9.58%～81.20%之間。初步確定小球藻TLD6B的耐旱范圍為0.0～0.3 g·mL-1的PEG-6000（圖6）。

圖6 持續(xù)干旱脅迫下小球藻TLD6B OD680測(cè)量值和致死率的變化

OD680值、致死率兩項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果顯示，小球藻菌株TLD6B干旱脅迫耐受性是4株菌株中最優(yōu)的。輕度干旱脅迫（PEG-6000濃度小于等于0.05 g·mL-1）下，致死率小于19.24%；中度干旱脅迫（PEG-6000濃度為0.1～0.2 g·mL-1）下，致死率在20.96%～62.9%之間；重度干旱脅迫（PEG-6000濃度為0.3 g·mL-1）下，致死率在51.5%～81.2%之間。

3 討論

水分是影響微藻生理活性的重要因素，適量的水分是維持微藻生長(zhǎng)和生理代謝所必需的物質(zhì)[9]。沙漠小球藻長(zhǎng)年生長(zhǎng)在持續(xù)干旱、高鹽、水分流失迅速的沙漠環(huán)境，其生長(zhǎng)和繁殖主要依賴降雨和地表水[18]。這樣的缺水環(huán)境使它具有很強(qiáng)的抗旱適應(yīng)性[5]。研究表明[19]，嚴(yán)重干旱時(shí)會(huì)引起細(xì)胞代謝紊亂等，最終抑制藻體的生長(zhǎng)和發(fā)育。本研究顯示，在不同的PEG-6000濃度下，4株沙漠小球藻的OD680值、生物量、比生長(zhǎng)速率等生長(zhǎng)指標(biāo)隨著干旱脅迫水平的增大而顯著下降，致死率隨著干旱脅迫水平的增大而顯著增大。周娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會(huì)抑制發(fā)狀念珠藻生長(zhǎng)，牟云等[5]研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫會(huì)抑制沙漠小球藻生長(zhǎng)，與本研究一致。

干旱脅迫是限制藻類(lèi)生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要環(huán)境因子之一[5,11,19]，不同微藻對(duì)干旱脅迫的耐受性差異很大，這取決于藻種、發(fā)育階段以及脅迫的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，最終導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制和藻體受到損傷[19-20]。周娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)在不同的PEG-6000干旱脅迫下，在培養(yǎng)1～2 d內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)明顯下降，從第3 d開(kāi)始，細(xì)胞生長(zhǎng)速率開(kāi)始增加，10% PEG-6000干旱脅迫對(duì)發(fā)狀念珠藻細(xì)胞損傷最嚴(yán)重。本研究顯示，干旱脅迫下4株小球藻的OD680值、生物量、比生長(zhǎng)速率都隨脅迫水平的增大而顯著下降，模擬持續(xù)干旱4株小球藻比生長(zhǎng)速率在培養(yǎng)前6 d明顯下降，從第6 d開(kāi)始比生長(zhǎng)速率開(kāi)始增大，OD680值、致死率、生物量隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，這與周娟等[9]研究一致，說(shuō)明持續(xù)干旱脅迫初期4株小球藻的生長(zhǎng)受到了嚴(yán)重抑制，然后很快恢復(fù)增長(zhǎng)，也說(shuō)明4株小球藻具有適應(yīng)持續(xù)干旱脅迫的能力。

牟云等[5]研究發(fā)現(xiàn)沙漠小球藻TLD6B在PEG-6000添加量為30%時(shí)生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，本研究的4株沙漠小球藻都可以耐受0.3 g·mL-1PEG-6000的干旱脅迫，只是每株藻的耐受閾值不同，菌株TLD6B、GTD8A1、GTD7c-2耐受0.3 g·mL-1PEG-6000的干旱脅迫第24 d時(shí)，生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制[21]，菌株TLD2A1甚至可以耐受0.5 g·mL-1PEG-6000的干旱脅迫。沙漠小球藻生長(zhǎng)在干旱、高鹽的環(huán)境下，容易使細(xì)胞失水，造成滲透脅迫，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)[8,22]。而不同藻株受到的影響不同，進(jìn)而導(dǎo)致不同藻株生物量和質(zhì)量總體下降不同[19-20]。具體的沙漠小球藻胞內(nèi)生理特性變化有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，模擬干旱脅迫下4株沙漠小球藻的生長(zhǎng)都受到了不同程度的抑制，沙漠小球藻TLD6B對(duì)干旱脅迫的耐受性最優(yōu)，它可以耐受0.3 g·mL-1PEG-6000的干旱脅迫。本研究將為后期沙漠小球藻耐干旱脅迫的生理學(xué)和分子生物學(xué)研究提供材料和基礎(chǔ)，也為小球藻耐旱藻種的選育提供參考依據(jù)。