余函紋， 劉夢(mèng)麗， 李 景， 彭華勝， 韓邦興， 查良平, 2*， 桂雙英, 3, 4, 5*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)科學(xué)院中藥資源保護(hù)與開發(fā)研究所，安徽 合肥 230012；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012；6.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237010)

桔梗始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]。桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.的干燥根，有宣肺利咽、祛痰排膿的功效[2]。桔梗作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源類品種，也是著名的十大皖藥之一，主產(chǎn)于安徽、山東、內(nèi)蒙古等地區(qū)[3]。桔梗中含有多種生物活性成分，包括三萜皂苷、黃酮、酚、多糖等，其中三萜皂苷為桔梗的主要活性成分。桔梗皂苷具有抗炎[4-5]、抗氧化[6-7]、抗腫瘤[8-9]、護(hù)肝[10-11]等作用。

目前已從桔梗中分離并鑒定的三萜皂苷類成分有70余種，均為齊墩果烷型三萜皂苷，依據(jù)桔梗皂苷母核結(jié)構(gòu)變化規(guī)律可將桔梗皂苷分為桔梗酸類、桔梗二酸類和遠(yuǎn)志酸類3種主要類型[12]。桔梗皂苷生物合成主要包含3個(gè)階段。起始階段通過MVA途徑和MEP途徑生成萜類前體物質(zhì)二甲基烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和異戊烯焦磷酸(IPP)[13]。MVA途徑是植物中三萜生物合成的主要前體途徑[14-15]，乙酰輔酶A在乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(AACT)和HMG-CoA合成酶(HMGS)作用下生成3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)[16]。HMG-CoA又在HMG-CoA還原酶(HMGR)催化下生成MVA，MVA又在多種酶的相繼催化作用下生成IPP[17]。HMGS和HMGR是MVA途徑的關(guān)鍵酶，其基因的表達(dá)影響著酶的活性，從而影響著萜類物質(zhì)的生成。骨架形成階段是指DMAPP和IPP在一系列酶的催化下生成為2，3-氧化鯊烯，再經(jīng)過氧化鯊烯環(huán)化酶(OSC)環(huán)化生成萜類骨架。修飾階段是指CYP450和糖基轉(zhuǎn)移酶(UGT)對(duì)萜類骨架進(jìn)行氧化、置換、糖基化等一系列修飾以生成各種皂苷。

目前，HMGS和HMGR已在多種藥用植物中被克隆，如擬南芥[18-19]，丹參[20-21]，三七[22]等，但在桔梗物種中還未被克隆。張健等[23]對(duì)HMGS、HMGR基因在不同生長(zhǎng)年限的桔梗根中的差異表達(dá)情況進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HMGS和HMGR均在一年生桔梗根中表達(dá)最高。馬春花等[24]通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、功能注釋及基因組織特異性表達(dá)分析，共鑒定出19個(gè)與桔梗三萜皂苷合成相關(guān)的關(guān)鍵基因，其中HMGS和HMGR基因分別在葉和根中表達(dá)最高。

本研究基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)首次克隆得到桔梗MVA途徑的關(guān)鍵酶基因PgHMGS和PgHMGR的全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行相關(guān)生物信息學(xué)分析，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌進(jìn)行異源表達(dá)，為揭示桔梗三萜皂苷類物質(zhì)生物合成的分子機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料

兩年生桔梗樣品于2019年采自安徽省桐城市，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)彭華勝教授鑒定為桔?？浦参锝酃latycodongrandiflorum(Jacq.) A. DC.。收集的樣品經(jīng)液氮速凍后儲(chǔ)存于實(shí)驗(yàn)室-80 ℃冰箱。

Trans1-T1、E.coliTransetta(DE3)、T載體pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、無縫拼接、切膠回收試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司；pET-28a(+)、pET-32a(+)質(zhì)粒購自武漢淼靈生物科技有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自美國(guó)Sigma公司; 實(shí)驗(yàn)所需的各種酶購自英國(guó)Biolabs公司；實(shí)驗(yàn)所需引物由上海生工生物有限公司合成。

2 方法

2.1 轉(zhuǎn)錄組分析組裝與RNA提取 通過華大測(cè)序平臺(tái)對(duì)桔梗樣品進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾軟件SOAPnuke的過濾[25]，去除接頭、去除未知堿基N含量大于10%及低質(zhì)量的讀取，生成高質(zhì)量的干凈讀取。使用Bowtie2將干凈讀取比對(duì)到參考基因序列，之后再使用RSEM計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平[26-27]。

取約80 mg新鮮桔梗根，加液氮置球磨機(jī)上研磨成粉，采用CTAB法提取總RNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性，超微量紫外分光光度計(jì)ND2000測(cè)定桔?？俁NA的A260、A280值，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

2.2PgHMGS,PgHMGR基因克隆 通過從NCBI中調(diào)取其他物種HMGS、HMGR基因序列，作為為模板從桔梗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中調(diào)取桔梗HMGS、HMGR，通過去除不完整、重復(fù)序列，篩選得到一條PgHMGS和一條PgHMGR。通過Primer軟件設(shè)計(jì)基因特異性引物。上游引物PgHMGS-F 5′-ATGGCTTCTAACCCGAAGAATGTTG-3′，PgHMGR-F 5′-ATG GACGTCCGATCAACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-R 5′-TCAATGGCCATTGGCCACCGGTGCA- 3′，PgHMGR-R 5′-CTAAGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以反轉(zhuǎn)錄后的桔梗cDNA為模板，采用高保真酶Phusion進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。目的條帶使用切膠回收試劑盒回收。將切膠回收產(chǎn)物連接至T載pEASY-Blunt Zero，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，接種氨芐青霉素抗性固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將陽性克隆菌液送至蘇州金唯智公司測(cè)序。

2.3PgHMGS,PgHMGR基因的生物信息學(xué)分析 菌液測(cè)序的序列結(jié)果與原序列比對(duì)成功后，使用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)確定基因序列的ORF區(qū)并通過在線工具BLAST對(duì)其核苷酸序列和氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)分析以確認(rèn)克隆結(jié)果正確性；利用ExPASy(https://web.expasy. org/protparam/)預(yù)測(cè)基因編碼蛋白大小、氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位；NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)結(jié)合PyMOL軟件構(gòu)建蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cd d/wrpsb.cgi)分析蛋白序列的結(jié)構(gòu)域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/service s/TMHMM/)分析蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域；從NCBI中獲取其他植物HMGS和HMGR基因的氨基酸序列，運(yùn)用MEGA7.0軟件的ClustalW將PgHMGS和PgHMGR與其他植物氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)后構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹(bootstrap重復(fù)次1 000次)。

2.4PgHMGS,PgHMGR基因的原核表達(dá) 對(duì)測(cè)序后的序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)含有BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)的無縫拼接引物，上游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-F：5′-GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTTCTAACCCGAAGAA TGTTG-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-F 5′-AGGCCATGGCTG ATATCGGAATGGACGTCCGATC AACCACCATCA-3′；下游引物PgHMGS-28a(+)-BamH I-R：5′-CGACGGAGCTCGAAT TCGGA TCAATGG CCATTGGCCACCGGTGCA-3′，PgHMGR-32a(+)-BamH I-R 5′-CGACGGAGCTCG AATTCGGACTA AGCTTTGGAAACATCTTTGTTG-3′。以重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。用BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶對(duì)pET-28a(+)和pET-32a(+)進(jìn)行單酶切。目的基因片段與原核表達(dá)載體pET-28a(+)和pET-32a(+)使用無縫拼接試劑盒pEASY于50 ℃連接30 min，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Trans1-T1，接種到LB固體培養(yǎng)基上(卡那霉素或氨芐霉素抗性)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR陽性驗(yàn)證、測(cè)序及質(zhì)粒提取。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌。按1∶100的比例取轉(zhuǎn)化菌液加入LB液體培養(yǎng)基中(卡那霉素或氨芐霉素抗性)，37 ℃，振蕩培養(yǎng)，至OD600=0.4～0.6，在0.8 mmol/L IPTG條件下，20 ℃ 誘導(dǎo)12 h，pET-28a(+)，pET-32a(+)空載作為陰性對(duì)照。取1 mL菌液作為全菌離心(10 000×g，3 min，4 ℃)，1 mL PBS清洗后離心收集菌體(10 000×g，3 min)，余下菌液離心(5 000×g，3 min，4 ℃)后用5 mL His Buffer A(20 mmol/L Na3PO4·12H2O、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑)重懸，置冰浴中超聲破碎、離心(10 000×g，15 min，4 ℃)后獲得上清，上述樣品加入上樣緩沖液，沸水煮8 min，經(jīng)12% SDS-PAGE檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 基因克隆及序列分析 基于桔梗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得PgHMGS和PgHMGR基因的cDNA序列，利用DNAMAN軟件結(jié)合ORF Finder對(duì)PgHMGS和PgHMGR基因cDNA序列進(jìn)行分析，其ORF區(qū)分別為1 401、1 749 bp，分別編碼466、582個(gè)氨基酸。以桔梗cDNA為模板，PCR進(jìn)行目的基因擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小與目的基因大小一致(圖1)。將PgHMGS和PgHMGR基因提交到NCBI使用在線軟件BLAST進(jìn)行序列比對(duì)。PgHMGS和PgHMGR與GenBank中已注冊(cè)植物基因有較高的同源性，其中PgHMGS與三七HMGS(注冊(cè)號(hào)AGZ15317.1)的相似性為99.57%，PgHMGR與丹參HMGR(注冊(cè)號(hào)AEZ55672.1)的相似性為79.30%。

3.2 生物信息學(xué)分析 利用在線工具ExPASy對(duì)PgHMGS，PgHMGR基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，預(yù)測(cè)PgHMGS的相對(duì)分子質(zhì)量為51 384.26，編碼蛋白的理論等電點(diǎn)為5.83，不穩(wěn)定系數(shù)為38.83，脂肪指數(shù)為74.33，負(fù)電荷殘基總數(shù)為54，正電荷殘基總數(shù)為46；預(yù)測(cè)PgHMGR相對(duì)分子質(zhì)量為62 477.81，編碼蛋白的理論等電點(diǎn)為6.51，穩(wěn)定系數(shù)為39.25，脂肪指數(shù)為95.02，負(fù)電荷殘基總數(shù)為54，正電荷殘基總數(shù)為51；初步推測(cè)PgHMGS，PgHMGR為穩(wěn)定的酸性蛋白。利用在線軟件WoLF PSORT預(yù)測(cè)PgHMGS，PgHMGR分別定位于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

根據(jù)PgHMGS，PgHMGR基因的氨基酸序列，利用NPS在線軟件預(yù)測(cè)多肽鏈中氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)(圖2)。NPS預(yù)測(cè)結(jié)果表明，PgHMGS，PgHMGR蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)都由α-螺旋、延伸鏈、無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)占比最大。PgHMGS的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)包含214個(gè)氨基酸，占比為45.92%，α-螺旋包含186個(gè)氨基酸，占比為39.91%，延伸鏈包含66個(gè)氨基酸，占比為14.16%；PgHMGR的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)包含258個(gè)氨基酸，占44.38%，α-螺旋包含231個(gè)氨基酸，占39.69%，延伸鏈包含93個(gè)氨基酸，占15.98%。兩種基因二級(jí)結(jié)構(gòu)的規(guī)律均為無規(guī)卷曲>α-螺旋>延伸鏈。使用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)PgHMGS，PgHMGR進(jìn)行同源建模，構(gòu)建其3D結(jié)構(gòu)模型(圖2)。選擇芥菜Brassicajuncea(L.) Czern. et Coss. HMGS為模板(SMTL ID：2fa3.1)構(gòu)建PgHMGS模型[28]，序列相似性為82.14%，整體評(píng)分為0.89；選擇肝HMGR為模板(SMTL ID：2r4f.1)構(gòu)建PgHMGR模型[29]，序列相似性為57.14%，整體評(píng)分為0.79。

利用NCBI的 Conserved domains在線工具對(duì)PgHMGS，PgHMGR蛋白結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PgHMGS的4～466 aa具有PLN02577家族(羥甲基戊二酰輔酶A合酶)的保守結(jié)構(gòu)域，PgHMGR的171～574 aa具有HMG-CoA_reductase_classI家族(HMG-CoA還原酶)的保守結(jié)構(gòu)域(圖3)。利用TMHMM在線工具預(yù)測(cè)PgHMGS，PgHMGR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明，PgHMGS無跨膜結(jié)構(gòu)，屬于膜外蛋白。PgHMGR有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別位于54～76、96～118、77～95 aa位于膜內(nèi)，1～53、119～582 aa位于膜外(圖3)。

利用DNAMAN軟件對(duì)PgHMGS和PgHMGR的氨基酸序列與其他植物基因進(jìn)行氨基酸序列同源比對(duì)。將PgHMGS序列與三七PnHMGS(AIK21781.1)、洋常春藤HhHMGS(APY22353.1)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，三種HMGS基因的一致性為92.57%，都有保守的催化結(jié)構(gòu)域GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL。將PgHMGR序列與茶CsHMGR(AEO12148.1)、丹參SmHMGR(AEZ55672.1)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，三種植物HMGR基因的一致性為77.83%(圖4)，均具有HMG-CoA底物結(jié)合區(qū)域(TTEGCLVA)和NADPH結(jié)合保守區(qū)域(DAMGMNM、GTVGGGT)。

從NCBI中下載了其他植物的HMGS、HMGR的氨基酸序列，采用MEGA7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，來源于不同物種基因的蛋白被聚成雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物和菌類。其中，PgHMGS與五加科植物三七、洋常春藤HMGS聚為一支，表明同源性較高。PgHMGR與唇形科植物丹參、山茶科植物茶聚為一支，具有較高同源性。

3.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PgHMGS、pET-32a(+)-PgHMGR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，菌液PCR驗(yàn)證，陽性菌株測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)目的基因已成功插入表達(dá)載體。同時(shí)，pET-28a(+)和pET-32a(+)轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)作為陰性對(duì)照。在0.8 mmol/L IPTG，20 ℃誘導(dǎo)12 h條件下，觀察重組融合蛋白的表達(dá)。重組菌株表達(dá)后收集菌體并進(jìn)行破碎裂解，上清液進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳檢測(cè)。電泳結(jié)果顯示，pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR的菌株和上清液分別在45、70 kDA處出現(xiàn)條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致(圖6)。

4 討論

目前，植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究對(duì)植物活性成分合成途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[30]，期望通過分子手段來實(shí)現(xiàn)植物藥用成分的大量積累。桔梗的藥用價(jià)值來源于桔梗三萜皂苷類成分。乙酰輔酶A在HMGS、HMGR的相繼催化下生成MVA，MVA的生成是一個(gè)不可逆過程，因此HMGR被認(rèn)為是MVA途徑中的第一個(gè)限速酶[31]，對(duì)MVA途徑調(diào)控起重要作用。HMGS、HMGR基因的功能已經(jīng)得到證實(shí)。王家典等[32]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷公藤HMGR基因的過表達(dá)顯著增加了雷公藤懸浮細(xì)胞藤甲素和雷公藤紅素的含量。Kim等[33]采用HMGR競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑美維諾林處理四周生的人參不定根24 h后，人參不定根中人參總皂苷含量降低。芥菜HMGS基因在擬南芥中過表達(dá)上調(diào)了HMGR的表達(dá)，提高擬南芥的甾醇含量和脅迫耐受性，證明HMGS與HMGR可以相互協(xié)同共同來調(diào)節(jié)MVA代謝通路[34]。

本研究克隆得到PgHMGS和PgHMGR，其基因長(zhǎng)度分別為1 401、1 749 bp，推測(cè)分別編碼466、582 aa，均為酸性穩(wěn)定蛋白。生物信息學(xué)分析表明PgHMGS不具有跨膜結(jié)構(gòu)，為膜外蛋白，與厚樸[35]、桑黃[36]HMGS蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)PgHMGS在線粒體膜上起作用。PgHMGS與三七、洋常春藤HMGS氨基酸序列同源性比對(duì)結(jié)果顯示序列具有92.57%的高度相似性，且都具有由21個(gè)氨基酸組成的保守催化結(jié)構(gòu)域(GNTDIEGVDSTNACYGGTAAL)[37]，表明不同物種間的HMGS具有高度的保守性。通過分析發(fā)現(xiàn)PgHMGR具有兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，與茅蒼術(shù)[38]、羅漢果[39]HMGR蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。預(yù)測(cè)PgHMGR定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，推測(cè)該蛋白可能為某種物質(zhì)的膜受體或者參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的物質(zhì)運(yùn)輸[40]。PgHMGR與丹參、茶HMGR同源性比對(duì)顯示序列相似性為77.83%。通過序列分析發(fā)現(xiàn)，桔梗、丹參、茶3種植物的HMGR均包含1個(gè)底物HMG-CoA結(jié)合區(qū)域(TTEGCLVA)和2個(gè)NADPH結(jié)合區(qū)域(DAMGMNM和GTVGGGT)。PgHMGR發(fā)揮酶催化作用時(shí)，連同NADPH作為反應(yīng)供氫體一起催化HMG-CoA生成MVA，首先一分子的NADPH還原形成半縮硫醛中間體，然后分解、質(zhì)子化，最后NADPH替代NADP+將聚乙醛還原為MVA[41]。

解析藥用植物活性成分合成途徑，通過分子手段實(shí)現(xiàn)大批量藥用成分的生產(chǎn)，可以提高藥用植物利用率。本研究成功克隆桔梗MVA途徑的HMGS和HMGR基因并進(jìn)行生信分析，同時(shí)構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PgHMGS和pET-32a(+)-PgHMGR，將其導(dǎo)入大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，成功誘導(dǎo)出可溶性蛋白，為進(jìn)一步研究桔梗HMGS、HMGR基因的體外功能奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究桔梗中三萜類成分的生物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。