徐小穎， 逄 健， 張北雪， 馬善鵬， 姜宇珺， 才 謙

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

關(guān)白附為毛茛科植物黃花烏頭Aconitumcoreanum(Lévl.) Rapaics的干燥塊根及根莖[1]，其味辛、甘，有毒，歸肝、胃經(jīng)，具有祛風(fēng)痰、定驚癇、散寒止痛等功效，主治中風(fēng)癲癇、口眼歪斜、偏正頭痛等疾病[2]。烏頭屬植物中雙酯型的二萜類生物堿具有很強(qiáng)的毒性，其主要表現(xiàn)為神經(jīng)和心臟毒性。烏頭屬植物會興奮心臟的迷走神經(jīng)，造成竇房結(jié)自律性和傳導(dǎo)性降低，可能引起房室傳導(dǎo)阻滯，并有可能會直接作用于心肌細(xì)胞而導(dǎo)致死亡[3-5]。近年來，烏頭屬類藥物中毒事件時有發(fā)生，關(guān)白附未被收錄在2020年版《中國藥典》中，關(guān)于關(guān)白附的心臟毒性相關(guān)實驗研究較少，本實驗通過給予大鼠關(guān)白附混懸液，考察其對大鼠的心臟毒性。此外，附子作為明確具有心臟毒性的烏頭屬中藥，應(yīng)用后的不良反應(yīng)主要表現(xiàn)在對心臟和神經(jīng)的損害[6]。本實驗采用附子對大鼠的心臟毒性作為對比，將附子的心臟毒性作為參考來考察關(guān)白附的心臟毒性大小。根據(jù)2020年版《中國藥典》中附子的臨床使用劑量，本實驗選擇低劑量附子組進(jìn)行大鼠的心臟毒性實驗，使其與關(guān)白附低劑量組相對應(yīng)，并設(shè)置不同劑量關(guān)白附組，通過相關(guān)生化指標(biāo)、病理學(xué)變化的情況來考察關(guān)白附對心臟毒性是否具有劑量依賴性，以期為關(guān)白附臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 藥材 關(guān)白附Aconitumcoreanum(Lèvl.) Rapaics購于遼寧西豐，生附子購于安徽亳州，以上藥材均為當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶栽培，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室許亮教授鑒定為正品。

1.2 動物 健康雄性SPF級別SD大鼠50只，體質(zhì)量180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(遼)2015-0001。在溫度22～23 ℃、相對濕度40%～70%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由飲水飲食。

1.3 儀器 Fresco型臺式冷凍離心機(jī)(德國Heraeus公司)；CP225D型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KH-300B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；RM6240型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(成都儀器廠)。

1.4 試劑 肌酸激酶(CK)ELISA試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)ELISA試劑盒、B型腦鈉肽(BNP)ELISA試劑盒、羥丁酸脫氫酶(HBDH)ELISA試劑盒(上?？婆d生物科技有限公司，批號191125N)；4%組織細(xì)胞固定液(大連海晨貿(mào)易有限公司，批號P1110)。

2 方法

2.1 藥物制備及給藥劑量 分別稱取關(guān)白附粉末1.25、3.75、11.25 g(過170目篩)，加入20 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為0.062 5、0.187 5、0.562 5 g/mL的混懸液；稱取附子粉末1.875 g(過170目篩)，加入20 mL蒸餾水，配制成質(zhì)量濃度為0.093 75 g/mL的混懸液，所有藥液均現(xiàn)用現(xiàn)配。參照2020年版《中國藥典》[7]附子常用劑量為3～15 g，《現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典》收載的關(guān)白附臨床劑量為6 g，按體表面積法折算大鼠附子等效給藥劑量為0.937 g/kg，關(guān)白附低、中、高劑量為0.625、1.875、5.625 g/kg(約臨床等效劑量的1、3、9倍)。

2.2 分組及給藥 將雄性SPF級SD大鼠隨機(jī)分成空白組，關(guān)白附低、中、高劑量組，附子組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠分別灌胃給予附子混懸液及關(guān)白附低、中、高劑量混懸液，大鼠灌胃容量為10 mL/kg，空白組大鼠灌胃給予等體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)14 d。

2.3 大鼠心電圖檢測 在大鼠末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛(3 mL/kg)麻醉大鼠，仰面固定在實驗臺上，使用生物信號采集系統(tǒng)采集大鼠的心電圖信號，將正負(fù)電級分別插入大鼠右上肢和左下肢，將底線插入大鼠的右下肢，記錄各組大鼠30、45、60 min時Ⅱ?qū)?lián)的心電圖，記錄其P波、T波、PR間期、QT間期、QRS間期和大鼠的心率情況[8]。

2.4 HE染色觀察大鼠心臟組織病理學(xué)變化 停止心電圖采集后，大鼠經(jīng)腹主動脈取血，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心10 min，分離取血清，放置于-20 ℃保存待測。立即取出大鼠心臟，使用預(yù)冷生理鹽水將表面的血污沖洗干凈，用濾紙吸干心臟表面的水分，稱定心臟質(zhì)量，計算心臟指數(shù)，公式為心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量/體質(zhì)量[9]；取部分心臟組織，于4%中性甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋，切片(5 μm)，HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理改變情況[10]。對心臟組織病理切片進(jìn)行半定量分析，以炎性細(xì)胞對心肌細(xì)胞浸潤作為評價指標(biāo)，無炎性細(xì)胞浸潤記為0分；偶見或者少數(shù)炎性細(xì)胞浸潤記為1分；中等數(shù)量的炎性細(xì)胞浸潤記為2分；大量炎性細(xì)胞浸潤記為3分[11]。

2.5 ELISA法檢測大鼠血清BNP水平和CK、LDH、HBDH活性 嚴(yán)格按照相關(guān)試劑盒說明書檢測各組大鼠血清B型腦鈉肽(BNP)水平和肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)活性。

3 結(jié)果

3.1 關(guān)白附對大鼠心電圖的影響 灌胃給藥30 min后，與空白組比較，附子組大鼠T波振幅、QRS間期、S-T波間期以及大鼠心率升高(P<0.05)，關(guān)白附低劑量組大鼠心率升高(P<0.05)，關(guān)白附高劑量組大鼠T波振幅、S-T波間期、心率升高(P<0.05)，提示關(guān)白附的毒性作用存在一定量效關(guān)系；與附子組比較，關(guān)白附低劑量組大鼠S-T波間期降低(P<0.05)。灌胃給藥45 min后，與空白組比較，附子組大鼠P波振幅、QRS間期、S-T波間期、心率升高(P<0.05)，關(guān)白附低劑量組大鼠心率升高(P<0.05)，關(guān)白附高劑量組大鼠T波振幅、S-T波間期、心率升高(P<0.05)；與附子組比較，關(guān)白附低劑量組大鼠P波振幅、S-T波間期、心率降低(P<0.05)。灌胃給藥60 min后，與空白組比較，附子組大鼠QRS間期、S-T波間期、大鼠心率升高(P<0.05)，關(guān)白附低劑量組大鼠QRS間期降低(P<0.05)，關(guān)白附低、高劑量組大鼠心率升高(P<0.05)；與附子組比較，關(guān)白附低劑量組大鼠S-T間期、心率降低(P<0.05)。由表1～3可知，各劑量關(guān)白附均可引起大鼠的心電圖異常，但從心電圖變化沒有看出明顯的量效關(guān)系，低劑量關(guān)白附組與等效劑量附子組比較，附子毒性表現(xiàn)明顯，關(guān)白附毒性較小。

表1 各組大鼠30 min心電圖

表2 各組大鼠45 min心電圖

表3 各組大鼠60 min心電圖

3.2 關(guān)白附對大鼠心臟指數(shù)、血清BNP水平及CK、LDH、HBDH活性的影響 與空白組比較，附子組和關(guān)白附高劑量組大鼠心臟指數(shù)和血清LDH、HBDH活性升高(P<0.05)，關(guān)白附低劑量組大鼠血清HBDH活性升高(P<0.05)，關(guān)白附中劑量組大鼠血清LDH、HBDH活性升高(P<0.05)；與附子組比較，關(guān)白附低劑量組大鼠血清LDH、HBDH活性降低(P<0.05)，關(guān)白附高劑量組大鼠血清HBDH活性降低(P<0.05)，見表4。提示，關(guān)白附能對大鼠血清生化指標(biāo)產(chǎn)生影響，且呈劑量依賴性，與等效劑量的附子比較，低劑量關(guān)白附毒性較小。

表4 關(guān)白附對大鼠心臟指數(shù)、血清BNP水平及CK、LDH、HBDH活性的影響

3.3 關(guān)白附對心臟病理組織形態(tài)學(xué)的影響 空白組大鼠心肌整體著色較均勻，心肌纖維排列整齊有序，肌絲粗細(xì)相對均勻，沒有明顯炎性細(xì)胞浸潤；附子組大鼠心肌著色不均勻，心肌纖維排列紊亂，且間隙較寬，肌絲的粗細(xì)不等，部分區(qū)域的肌纖維有溶解、萎縮現(xiàn)象，伴有少量的出血；關(guān)白附低、中劑量組大鼠心肌纖維排列較整齊，心肌纖維間隙和肌絲粗細(xì)較均勻，僅見個別有炎性細(xì)胞的浸潤；關(guān)白附高劑量組大鼠心肌纖維排列紊亂，并伴有肌漿溶解，心肌纖維之間的間隙明顯增寬，肌絲粗細(xì)不等，間質(zhì)血管有擴(kuò)張現(xiàn)象，且伴有少量的出血，見圖1、表5。

表5 關(guān)白附對大鼠心臟組織病理變化的影響

4 討論

根據(jù)《神農(nóng)本草經(jīng)》等古籍的記載，毛茛科烏頭屬植物具有毒性，近些年來中毒事件也時有發(fā)生[12]。因此，合理使用烏頭屬藥材，需要對其毒性進(jìn)行更深入的研究。毛茛科烏頭屬植物是一類重要的藥用植物，具有較高的藥用價值，其主要有效成分是二萜類生物堿，烏頭類生物堿有抗心律失常和強(qiáng)心作用，但又表現(xiàn)出心臟毒性和神經(jīng)毒性。臨床使用烏頭屬藥材治療疾病必須充分考慮臨床用藥的安全性。

臨床上通常用功能學(xué)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行心臟毒性的評價，功能學(xué)主要分為心電圖、心電向量圖和心阻抗血流圖，形態(tài)學(xué)主要包括心肌組織的形態(tài)學(xué)和心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察[13]。本實驗從大鼠的心電圖，血清BNP水平和CK、LDH、HBDH活性以及心肌組織病理切片來觀察關(guān)白附連續(xù)給藥14 d對大鼠心臟毒性的影響，并且將低劑量關(guān)白附與等效劑量附子對大鼠心臟毒性進(jìn)行比較。心電圖數(shù)據(jù)顯示，空白組大鼠心電圖均表現(xiàn)正常；與空白組比較，附子組大鼠心電圖出現(xiàn)心率加快、抬高S-T段，引起P波振幅、T波振幅和QRS波群等改變；關(guān)白附低劑量組大鼠心電圖出現(xiàn)異常，但心律失?，F(xiàn)象不明顯，提示附子和關(guān)白附均能對大鼠造成心肌損傷，但與附子比較，等效劑量(低劑量)關(guān)白附對大鼠的心臟毒性較小。附子組和關(guān)白附各劑量組大鼠心率加快，其中附子組大鼠心率加快情況最明顯，關(guān)白附各劑量組隨著給藥劑量增加，心率呈加快趨勢，提示關(guān)白附心臟毒性呈劑量依賴性。

觀察大鼠心臟病理切片發(fā)現(xiàn)，附子組和關(guān)白附各劑量組大鼠均有心臟損傷，但關(guān)白附低、中劑量組大鼠心臟損傷較小，沒有明顯的病理改變，而高劑量組大鼠心肌組織有明顯病理改變。與關(guān)白附低劑量比較，等效劑量附子對大鼠心臟有明顯的病理損傷。

LDH、CK、BNP、HBDH是臨床上幾種缺血性心臟病經(jīng)典的生化標(biāo)記物，參與疾病發(fā)生和發(fā)展過程，可以作為臨床上評估心臟疾病危險性的重要信息，并為患者預(yù)后情況的變化提供重要預(yù)示[14-15]。本研究結(jié)果顯示，附子組和關(guān)白附各劑量組大鼠血清LDH、HBDH活性均高于空白組，提示附子和關(guān)白附均能對大鼠心肌細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒副作用；但與等效劑量附子比較，低劑量關(guān)白附對大鼠的心臟毒性較小。

綜上所述，關(guān)白附對大鼠心臟存在毒性影響，但與附子相比，關(guān)白附的心臟毒性較小。此外，關(guān)白附心臟毒性存在劑量依賴性，病損程度隨著劑量的增加而加重。本實驗通過關(guān)白附對大鼠心臟毒性效應(yīng)的研究，為關(guān)白附臨床安全用藥提供一定參考。