谷佳， 賀衛(wèi)和， 劉樂(lè)平， 劉超， 王文茂， 王煒， 覃麗

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院干細(xì)胞中藥調(diào)控與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，2.藥學(xué)院中藥民族藥物創(chuàng)新發(fā)展國(guó)際實(shí)驗(yàn)室，湖南省長(zhǎng)沙市410208；3.張家界莓茶工程技術(shù)研究中心 湖南乾坤生物科技有限公司，湖南省張家界市 427000)

肝癌分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，與慢性肝炎病毒感染、致癌物長(zhǎng)期暴露、過(guò)度飲酒等因素密切相關(guān)。研究表明，2020年全球肝癌發(fā)病率和死亡率在全部腫瘤中分別位居第6位和第3位[1]。中國(guó)每年死于肝癌人數(shù)占全球肝癌死亡病例數(shù)的47%[2]。肝癌的復(fù)發(fā)率高且預(yù)后較差，患者的5年生存率僅為5%～9%[3]。傳統(tǒng)中藥活性成分為近年來(lái)肝癌抗腫瘤藥物研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，二氫楊梅素屬黃酮類化合物，主要提取自葡萄科蛇葡萄屬植物，在降血脂、抗腫瘤等方面具有良好療效[4]。脂質(zhì)代謝紊亂在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[5]。研究表明，二氫楊梅素通過(guò)抑制脂質(zhì)生成和氧化應(yīng)激等途徑改善肝癌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積[6]。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究二氫楊梅素調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抗肝癌的可能作用機(jī)制，為后續(xù)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 二氫楊梅素的作用靶點(diǎn)獲取方法

在PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Dihydromyricetin”為關(guān)鍵詞檢索，得到二氫楊梅素Canonical SMILES號(hào)(CS)和3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式(格式保存為“SDF”)；利用3D結(jié)構(gòu)“SDF”文件在PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；利用Canonical SMILES號(hào)在SwissTarget(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫(kù)(選取“Prob”>0的靶點(diǎn))和TargetNet(http://targetnet.scbdd.com/)數(shù)據(jù)庫(kù)(選取“Prob”>0的靶點(diǎn))中預(yù)測(cè)靶點(diǎn)；在ChEMBL和TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)中以“dihydromyricetin”為關(guān)鍵詞檢索獲取靶點(diǎn)，至少有兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)到才使用，將符合條件的靶點(diǎn)進(jìn)行匯總，刪除重復(fù)項(xiàng)后利用Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)將其轉(zhuǎn)化為基因名。

1.2 肝癌和脂質(zhì)代謝的相關(guān)基因獲取方法

GeneCards(https://www.genecards.org/)(選取“score”>15的基因)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫(kù)中分別以“l(fā)iver cancer”和“l(fā)ipid metabolism”為關(guān)鍵詞檢索獲取基因，將符合條件基因匯總，刪除重復(fù)項(xiàng)后利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)將其轉(zhuǎn)化為基因名。

1.3 二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)找到二氫楊梅素作用靶點(diǎn)、脂質(zhì)代謝和肝癌相關(guān)基因的交集靶點(diǎn)并制作韋恩圖。將獲得的所有交集基因?qū)隨TRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并導(dǎo)出tsv文件，利用Cytoscape對(duì)交集基因進(jìn)行可視化分析并篩選出核心靶點(diǎn)基因。

1.4 GO、KEGG富集分析

將獲得的交集基因?qū)隦studio軟件，進(jìn)行GO、KEGG通路富集分析，將分析結(jié)果篩選匯總后繪制相關(guān)圖像。

1.5 分子對(duì)接驗(yàn)證

將二氫楊梅素3D結(jié)構(gòu)的“SDF”格式文件，利用Open Babel軟件轉(zhuǎn)化為“mol2”格式。通過(guò)PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心靶點(diǎn)基因蛋白結(jié)構(gòu)的“PDB”格式，利用PyMol 2.5.1軟件對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去水分子、去雜質(zhì)、提取配體等處理，并確定對(duì)接盒子大小，利用Autodock Vina將蛋白結(jié)構(gòu)的“PDB”格式文件和二氫楊梅素3D結(jié)構(gòu)的“mol2”格式轉(zhuǎn)為“pdbqt”格式，計(jì)算核心靶點(diǎn)基因與二氫楊梅素的最低結(jié)合能數(shù)值。利用PLIP(https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)確定蛋白與其配體之間的相互作用，PyMol軟件對(duì)結(jié)果可視化分析。

2 結(jié) 果

2.1 二氫楊梅素主要靶點(diǎn)、脂質(zhì)代謝和肝癌的相關(guān)基因獲取情況

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中得到二氫楊梅素的2D、3D化學(xué)結(jié)構(gòu)式和CS號(hào)經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)和基因名轉(zhuǎn)化，共獲得二氫楊梅素作用靶點(diǎn)179個(gè)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的基因查找和基因名轉(zhuǎn)化，共獲得脂質(zhì)代謝相關(guān)基因427個(gè)和肝癌相關(guān)基因1 246個(gè)。

2.2 二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析情況

利用Venny 2.1.0找到二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌相關(guān)靶點(diǎn)共15個(gè)(表1)，并得到韋恩圖(圖1)。將獲得的15個(gè)交集基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。利用Cytoscape對(duì)交集基因進(jìn)行可視化分析(圖3)，并以“Degree值”大于平均值(5.6)為標(biāo)準(zhǔn)篩選出核心靶點(diǎn)基因9個(gè)：雌激素受體1(estrogen receptor1，ESR1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activate-d receptor gamma，PPARG)、三磷酸腺苷黏合轉(zhuǎn)運(yùn)體B1(ABCB1)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、細(xì)胞色素P450 1A2(cytochrome p4501A2,CYP1A2)、芳香化酶(CYP19A1)、纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen altivator inhibitor 1,SERPINE1)、沉默信息調(diào)控因子1(silence information regulator 1，SIRT1)、CYP1B1。

表1 二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌靶點(diǎn)相關(guān)信息

圖1 二氫楊梅素-脂脂代謝-肝癌靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 交集基因互作網(wǎng)絡(luò)

圖3 交集基因可視化分析

2.3 GO、KEGG富集分析結(jié)果

通過(guò)GO功能富集分析結(jié)果顯示(圖4)，二氫楊梅素在分子功能(molecular function,MF)方面主要參與RNA聚合酶Ⅱ調(diào)控下DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合、DNA與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合等過(guò)程；在細(xì)胞組分(cellular component,CC)方面主要影響核內(nèi)膜；在生物過(guò)程(biological processes,BP)方面主要參與脂肪酸代謝、節(jié)律、類固醇代謝、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)等。

圖4 GO富集分析

KEGG通路的富集分析結(jié)果顯示，共富集到25條通路與二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌相關(guān)，包括卵巢類固醇生成、類固醇激素生物合成、化學(xué)致癌物-受體激活等，選取前10條繪制氣泡圖(圖5)。

圖5 KEGG富集分析

2.4 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果

核心靶點(diǎn)基因CYP1B1、CYP1A2、SIRT1、PPARG、SERPINE1、ESR1、ABCB1、PTGS2、CYP19A1與二氫楊梅素的最低結(jié)合能分別為-10.3、-9.1、-9.0、-7.9、-7.8、-7.4、-7.4、-7.3、-7.1 kcal/mol(圖6)。二氫楊梅素與核心靶點(diǎn)基因的結(jié)合能為負(fù)值即可證明受體與配體能自發(fā)結(jié)合，且所需能量越少，結(jié)合越穩(wěn)定。核心靶點(diǎn)基因與二氫楊梅素的結(jié)合能結(jié)果均小于-5.0 kcal/mol，結(jié)合效果較好。

圖6 二氫楊梅素與核心靶點(diǎn)基因蛋白分子對(duì)接結(jié)果

3 討 論

本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌的9個(gè)核心靶點(diǎn)基因，并且借助分子對(duì)接方法證明二氫楊梅素與上述核心靶點(diǎn)基因具有較好的結(jié)合活性。研究表明，雌激素可以降低肝臟脂酶的抑制作用，升高膽固醇、甘油三酯水平，影響脂肪的存儲(chǔ)與分布，調(diào)節(jié)血脂異常[7]。CYP19A1在雌激素合成中發(fā)揮重要作用。ESR1作為雌激素通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究報(bào)道，ESR1在肝癌病人體內(nèi)的表達(dá)較低[8]。ESR1可以促進(jìn)脂肪分解，調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，減輕肝臟脂肪變性，還可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與增殖[9-10]。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol-regulatory element binding proteins-1C，SREBP-1C)是調(diào)控肝臟脂質(zhì)新生的關(guān)鍵蛋白，在肝臟脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用[11]，下調(diào)CYP1A2、CYP1B1可以抑制SREBP-1C的表達(dá)，減少肝臟脂質(zhì)尤其是甘油三酯的合成，減輕肝損傷[12-13]。下調(diào)CYP1B1通過(guò)增強(qiáng)腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化調(diào)控肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因，包括抑制PPARG的表達(dá)[14]。下調(diào)PPARG可以減少脂肪酸合成，阻斷脂肪細(xì)胞的分化，減輕肝內(nèi)脂質(zhì)蓄積[15-16]。PTGS2及其合成產(chǎn)物在多種炎癥中發(fā)揮重要作用，干擾肝臟正常脂質(zhì)代謝，導(dǎo)致肝內(nèi)甘油三酯蓄積[17]。下調(diào)ABCB1可以降低肝臟細(xì)胞的多藥耐藥性，這對(duì)肝臟類疾病的藥物治療具有重大意義[18]。SIRT1可以通過(guò)調(diào)節(jié)胰島素分泌間接調(diào)節(jié)糖脂代謝[19]。研究報(bào)道，二氫楊梅素可能通過(guò)激活SIRT1-AMPK通路改善高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟脂質(zhì)沉積[20]，與本文預(yù)測(cè)相符。上述結(jié)果可以證明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在預(yù)測(cè)二氫楊梅素調(diào)脂抗肝癌的作用機(jī)制上具有可靠性。

本文借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)二氫楊梅素調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抗肝癌的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了研究與分析。初步推測(cè)二氫楊梅素可以通過(guò)作用于ESR1、PPARG、ABCB1、PTGS2、CYP1A2、CYP19A1、SERPINE1、SIRT1、CYP1B1等靶點(diǎn)，通過(guò)卵巢類固醇生成、類固醇激素生物合成、化學(xué)致癌物-受體激活等通路發(fā)揮抗肝癌的作用，且均與脂質(zhì)代謝相關(guān)，這為二氫楊梅素多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝抗肝癌提供了理論依據(jù)。