孫海航， 李建寧， 李 蕾， 唐光美， 周子森， 李思民， 樊芳玲， 官會(huì)林

(云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650500)

三七為我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，在跌打損傷、冠心病、心絞痛等疾病治療中得到廣泛應(yīng)用[1-2]，是云南白藥、復(fù)方丹參滴丸、片仔癀等中成藥的主要藥材成分[3]。在我國(guó)中醫(yī)藥行業(yè)中，三七具有重要影響，已經(jīng)成為僅次于人參的中藥材大品種[4]。隨著三七市場(chǎng)需求量不斷增大，適宜三七種植的新增土地?cái)?shù)量銳減，同時(shí)現(xiàn)存土地面臨著嚴(yán)峻的連作障礙影響。

土壤微生物不僅起到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解等作用，還是維持土壤生態(tài)平衡的重要一環(huán)。土壤微生物功能多樣性對(duì)植物的生長(zhǎng)具有重要意義，它可以通過在微生物利用土壤碳源的模式上體現(xiàn)出代謝水平與活性。對(duì)于土壤微生物的測(cè)定方法，由微生物醌法、分子生物學(xué)法轉(zhuǎn)變?yōu)锽iolog技術(shù)。Biolog-ECO法可通過對(duì)單一碳源利用的測(cè)定，來定量描述微生物群落功能多樣性，間接地表現(xiàn)出植物與土壤間的動(dòng)態(tài)平衡，由于其靈敏度高，分辨力強(qiáng)，目前已廣泛應(yīng)用于土壤微生態(tài)領(lǐng)域。

生物炭是有機(jī)材料在缺氧條件下熱降解產(chǎn)生穩(wěn)定的富碳產(chǎn)物[5]，具有發(fā)達(dá)的孔隙結(jié)構(gòu)、較大的比表面積、較高pH值、豐富官能團(tuán)等特征[6-7]。這些特征使得生物炭能夠降低土壤酸度[8-9]、提高土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)[8-10]、增加土壤持水性及養(yǎng)分有效性[11]、改善土壤微生物特性，為菌根和細(xì)菌生長(zhǎng)提供生態(tài)位等[12-13]。前期研究發(fā)現(xiàn)，生物炭能夠提高三七主根產(chǎn)量[14]，減低重金屬脅迫[15]，提高土壤有機(jī)質(zhì)等[16]。通過本研究，以期深化生物炭施加對(duì)三七連作土壤有機(jī)碳代謝過程的認(rèn)識(shí)。

1 材料

1.1 研究區(qū) 本研究在云南省野外科學(xué)研究站-苗鄉(xiāng)三七科學(xué)實(shí)驗(yàn)站(23°31′44.48″N，104°19′13.65″E)進(jìn)行，位于三七產(chǎn)區(qū)云南省文山州。當(dāng)?shù)啬昶骄鶜鉁?6.6 ℃，年降水量1 111 mm，土壤為酸性紅壤，富含鐵和鋁，實(shí)驗(yàn)小區(qū)已連續(xù)種植三七5年。

1.2 土壤采集 按照傳統(tǒng)三七栽培方法，于2018年2月將種植基地中生長(zhǎng)1年的三七籽條移栽到田間，在0～20 cm表土中均勻摻入1 kg/m2相同的復(fù)合肥(有機(jī)肥與化肥的混合物)及2種生物炭。選擇3塊間距2 m的試驗(yàn)地，進(jìn)行分類處理，不添加生物炭為對(duì)照A組，添加0.1%煙桿炭為B組，稻殼炭為C組。3組同步進(jìn)行田間管理、除草、灌溉，移栽后不再施肥。在生長(zhǎng)1.5年后，于2020年9月對(duì)三七成活率進(jìn)行調(diào)查，9月20日進(jìn)行根際土壤采樣，將其連根帶土放入袋中，根部用力抖動(dòng)，抖下來的土即為土體土壤，剩下的附著于根部薄層1～2 mm的土壤即為根際土壤。將采集的土壤研磨混勻，一部分通過2 mm篩，保存在4 ℃冰箱中，進(jìn)行微生物分析；一部分進(jìn)行風(fēng)干研磨過篩，對(duì)其進(jìn)行理化性質(zhì)分析；剩下置于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

2 方法

三七連作土壤理化性質(zhì)測(cè)定參照鮑士旦[17]報(bào)道的方法，其微生物群落功能分析采用Biolog-ECO實(shí)驗(yàn)[18]。稱取5 g已經(jīng)添加生物炭的土樣于滅菌三角瓶中，并加入45 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(K2HPO4/KH2PO4，pH 7.0)封口，放入搖床振蕩1 min后再冰浴1 min，重復(fù)3次，靜置2 min，取上層清液3 mL至已滅菌的50 mL三角瓶中，加入27 mL無菌0.1 moL/L磷酸緩沖液，稍加振蕩，重復(fù)上述操作至稀釋為1 000 mL。將Biolog-ECO生態(tài)測(cè)試板從冰箱內(nèi)取出，預(yù)熱到25 ℃，200 μL移液槍吸取150 μL待測(cè)液接種到Biolog-ECO生態(tài)測(cè)試板中，每板重復(fù)3次，將加好樣的Biolog-ECO生態(tài)測(cè)試板在28 ℃下培養(yǎng)，每隔24 h用Biolog酶標(biāo)儀在590 nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，記錄數(shù)據(jù)。

2.2 冗余分析 冗余分析用于分析土壤微生物碳源代謝功能與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系，因變量為31種碳源在120 h的吸光度，自變量為根際土壤各理化性質(zhì)。

3 結(jié)果

3.1 生物炭對(duì)三七根際土壤理化性質(zhì)的影響 生物炭加入三七連作土壤后，除有效鉀外，與A組比較，添加生物炭的處理均有差異，見表1。其中，B組處理土壤有效磷含量比A組降低22.1%，C組處理土壤有效鉀含量比A組降低10.15%，B、C組處理土壤pH值分別比A組提高6.20%和6.69%，B、C組微生物量碳含量與A組比較分別提升44.07%、32.41%。

表1 三七根際土壤理化性質(zhì)

3.2 生物炭對(duì)土壤微生物代謝活性的影響 AWCD反映了土壤微生物群落的代謝活性，是評(píng)判微生物群落對(duì)某一碳源的利用能力的重要指標(biāo)，在一定程度上可表征土壤微生物群落的數(shù)量和結(jié)構(gòu)特征。AWCD越大，土壤中微生物活性越高。

圖1顯示，培養(yǎng)時(shí)間在0～24 h內(nèi)AWCD幾乎沒有增長(zhǎng)，表明微生物對(duì)各碳源還未利用；在24～120 h內(nèi)AWCD快速增長(zhǎng)，表明微生物活性增強(qiáng)，對(duì)碳源利用率增加；在120 h后AWCD增長(zhǎng)變緩，趨于穩(wěn)定，表明此時(shí)能反映實(shí)際情況；在整個(gè)培養(yǎng)過程中，各組AWCD依次為C組>B組>A組。

圖1 三七根際土壤平均顏色變化率

3.3 生物炭對(duì)三七連作地土壤微生物生理碳代謝指紋圖譜的影響 微生物群落對(duì)這31種碳源的特征性利用稱作該微生物群落的代謝指紋圖譜，根據(jù)單個(gè)微平板上的指紋圖譜可獲得大量的代謝信息，有助于了解微生物群落代謝功能特征。按化學(xué)基團(tuán)的性質(zhì)，對(duì)ECO板上的31種碳源分成6類，即羧酸類、氨基酸類、碳水化合物類、聚合物類、胺類、酚類，并根據(jù)每類碳源120 h C-R平均值繪制曲線，見圖2。

注：A為對(duì)照組，B為施加煙桿炭，C為施加稻殼炭。G1～A3為碳水化合物類，A4～F4為氨基酸類，B1～H3為羧酸類，C1～F1為聚合物類，C3～D3為酚類，G4～H4為胺類。

由此可知，在B組中AWCD大于0.8的碳源有23種，其中碳水化合物類有8種，氨基酸類有6種，羧酸類有5種，聚合物類有2種，酚類有1種，胺類有2種，占總碳源的74.19%；在C組中AWCD大于0.8的碳源共有24種，其中碳水化合物類有8種，氨基酸類有5種，羧酸類有6種，聚合物類有2種，酚類有1種，胺類有2種，占總碳源的77.42%；在A組中AWCD大于0.8的碳源共有19種，其中碳水化合物類有4種，氨基酸類有5種，羧酸類有5種，聚合物類有3種，酚類有1種，胺類有1種，占總碳源的61.29%。

另外，施加生物炭后，微生物對(duì)31種碳源的利用能力增強(qiáng)，利用率分別提高2.9%、16.13%，即微生物活性增強(qiáng)，并且對(duì)碳水化合物類中的α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、葡萄糖-1-磷酸鹽，D-蘋果酸、苯乙基胺有明顯影響；施加煙稈炭后，對(duì)D-纖維二糖、α-D-乳糖、β-甲基-D-葡萄糖苷的利用能力比施加稻殼炭時(shí)增強(qiáng)；施加稻殼炭后，對(duì)葡萄糖-1-磷酸鹽、D-蘋果酸的利用能力強(qiáng)于施加稻殼炭時(shí)；稻殼炭對(duì)氨基酸類的利用最強(qiáng)。

3.4 生物炭對(duì)三七連作土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)的影響 Shannon指數(shù)是評(píng)估土壤微生物群落物種多樣性和豐富度的重要指標(biāo)，其數(shù)值越大，物種越多、越均勻。McIntosh指數(shù)反映了微生物碳源利用種類數(shù)的不同，能以此區(qū)分不同的碳源利用程度。豐富度指數(shù)反映了土壤微生物對(duì)碳源利用的總數(shù)目。

本實(shí)驗(yàn)選擇培養(yǎng)120 h數(shù)據(jù)，對(duì)上述多樣性指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。由此可知，B、C組Shannon指數(shù)高于A組(P<0.05)，表明添加生物炭不會(huì)對(duì)原有微生物的豐富度和多樣性造成損害；施加稻殼炭后土壤微生物對(duì)碳源利用的總數(shù)目最多，而施加煙稈炭后與不施加生物炭無明顯差異(P>0.05)。

3.5 生物炭對(duì)土壤微生物碳源代謝功能的影響途徑 根據(jù)3組根際土壤在120 h不同碳源C-R，采用Canoco 4.5進(jìn)行冗余分析，結(jié)果見表3、圖3。

表2 土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

由此可知，土壤中微生物量碳含量銨態(tài)氮含量及pH值可解釋軸1(35.2%)和軸2(10.5%)的變異，而且與土壤微生物功能多樣性呈正相關(guān)；B、C組土壤中銨態(tài)氮、微生物量碳含量、土壤pH值增加；土壤微生物量碳含量與pH可增加碳源代謝豐富度和Shannon指數(shù)，而土壤中銨態(tài)氮含量可增加碳源代謝豐富度和Shannon指數(shù)。

表3 微生物碳源代謝多樣性與土壤因子之間的相關(guān)性分析

圖3 土壤微生物群落多樣性與土壤因子冗余分析

4 討論

本研究發(fā)現(xiàn)3組土壤微生物對(duì)不同碳源的利用率共同表現(xiàn)為在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，但不同組土壤的平均吸光度存在差異。在試驗(yàn)進(jìn)行的24 h之后，加入生物炭的土壤表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。通過分析土壤微生物生理碳代謝指紋圖譜，可以知道添加生物炭后，土壤中微生物對(duì)D-木糖、D-甘露醇、L-精氨酸等碳源的利用率得到提升。微生物對(duì)不同碳源的利用產(chǎn)生不同的結(jié)果，稻殼炭通過對(duì)氨基酸類碳源利用的提升來加強(qiáng)土壤的礦化作用，提高對(duì)碳水化合物類和糖類的利用，來加強(qiáng)土壤微生物功能的多樣性。研究表明，水稻根系對(duì)土壤微生物的總體影響主要與微生物群落有關(guān)[22]。本研究中生物炭加入后，土壤微生物群落Shannon指數(shù)、豐富度有差異，表明生物炭增加根際土壤微生物群落的多樣性。微生物群落中優(yōu)勢(shì)菌群引發(fā)植物-土壤反饋調(diào)節(jié)，協(xié)助土壤中養(yǎng)分的循環(huán)，為三七提供良好的環(huán)境能量，促使植物可以充分吸收土壤中的養(yǎng)分。

土壤銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量顯著影響黑松人工林中不同碳輸入條件下土壤微生物碳源代謝功能多樣性[23]。三七在生長(zhǎng)過程中，根際分泌物中的酸類化合物使土壤的酸性逐漸加強(qiáng)，這使得土壤中微生物菌群的豐富度降低，有害病原菌的增加[24]。相關(guān)性分析表明施加生物炭后，土壤酸性減弱，根際土壤中銨態(tài)氮，微生物量碳的含量提升，與微生物碳源代謝呈正相關(guān)。這源于生物炭的吸附作用富集土壤礦質(zhì)元素，改變土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)。微生物對(duì)胺類和糖類利用增強(qiáng)，使土壤微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的礦化作用增強(qiáng)，保證三七正常生長(zhǎng)水平的攝入，提高三七成活率。

5 結(jié)論

施加生物炭可提高微生物群落的代謝活性，豐富微生物群落的多樣性。其中施加稻殼炭三七存活率最高，通過加強(qiáng)對(duì)氨基酸類碳源的利用來提升土壤微生物的礦化作用。土壤中微生物量碳、銨態(tài)氮含量及pH值的提高能加強(qiáng)微生物碳源代謝水平，促使三七吸收土壤養(yǎng)分。