趙福陽 劉冬雪 吳 越

（牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011）

前言

癌癥已經(jīng)成為了人類健康和生活的最大的威脅之一。目前，手術(shù)、化療和放療是治療這些惡性腫瘤的三大主要方法，其中化療被視為最常用的方法。然而，由于化療所用藥物不具備靶向識(shí)別能力，所以在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)也不可避免的損害正常組織和細(xì)胞，不僅嚴(yán)重的降低了癌癥治療效果，而且將導(dǎo)致人體免疫功能受損，嚴(yán)重影響機(jī)體康復(fù)。隨著納米科技的發(fā)展，越來越多的科研工作者致力于納米級(jí)藥物運(yùn)輸體系的研發(fā)，進(jìn)而改善藥效，降低對于正常組織的副作用。到目前為止，多鐘多樣的納米級(jí)藥物運(yùn)輸體系已被研發(fā)出來，其中介孔二氧化硅納米粒子（MSN）由于具有良好的生物降解能力、物理化學(xué)穩(wěn)定性、可調(diào)的孔尺寸、大的比表面積和孔體積、容易功能化等優(yōu)點(diǎn)成為最具潛力的納米載體。由于功能化的的介孔硅納米材料可以引入更多的控釋因素，很多人開始了基于介孔硅材料的靶向藥物控釋研究來改善局部目標(biāo)區(qū)域的療效。根據(jù)控制機(jī)制，可以將其分為外部刺激和內(nèi)部刺激。最近，已經(jīng)證明將內(nèi)部刺激和外部刺激結(jié)合起來能夠獲得更精準(zhǔn)的控釋性能。

最近發(fā)現(xiàn)，sp2雜化的碳納米材料，尤其是石墨締納米片，具有優(yōu)良的光、電、熱性能，廣泛用在藥物輸送、光熱治療及生物傳感器等方面。不僅如此，將不同的生物功能分子或無機(jī)納米粒連接于石墨帰表面，可賦予石墨稀納米材料新的性質(zhì)和功能,如祀向巧別功能或診斷功能,這也為多功能石墨稀基納米藥物的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。然而，為了推進(jìn)石墨蹄基納米藥物的進(jìn)一步發(fā)展，使其具有更強(qiáng)大的功能,還需要做更多的努力工作。例如，（1）如何將高鞭向識(shí)別、診斷、化療、熱療有機(jī)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)協(xié)同效果；（2）如何降低石墨帰的疏水性和毒性而同時(shí)又能維持其載藥（化療）和光熱轉(zhuǎn)換（光熱治療）效果；（3）如何改進(jìn)石墨賄載藥方式（弱的相互作用）導(dǎo)致的不穩(wěn)定的藥物負(fù)載和釋放；（4）如何増強(qiáng)石墨賄表面鍵合不同功能分子的能力（石墨烯表面的相對惰性使其共價(jià)鍵合功能分子困難）等。

基于石墨烯的光熱能力和磁性納米粒子靶向能力和介孔二氧化硅的藥物裝載能力，本文設(shè)計(jì)了以磁性石墨烯納米片為基底，MSN為殼的納米藥物載體。通過靜電吸附作用核載化療藥物奧沙利鉑（OP）。通過808 nm激光輻照，磁性石墨烯納米片吸收近紅外光（NIR），將其轉(zhuǎn)化為熱，即可實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷（光熱治療），又可加速介孔內(nèi)化療藥物的釋放，提高化療效果，從而實(shí)現(xiàn)光熱/化療的協(xié)同作用。

一、實(shí)驗(yàn)部分

1.試劑與儀器

FeCl3·6H2O、乙酸鈉、正硅酸四乙酯和十六烷基三甲溴化銨（CTAB）購買于上海阿拉丁試劑有限公司；胎牛血清（FBS）采買于浙江天杭生物科技股份有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）和高糖培養(yǎng)液（DMEM）培養(yǎng)基購買于碧云天生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)試劑配制用水為去離子水。

通過掃描電子顯微鏡（SEM，F(xiàn)EG-250，F(xiàn)EI，美國）對樣品形貌進(jìn)行表征；使用紫外-可見分光光度計(jì)（UV-Vis，Cary 5000，Agilent，美國）對藥物釋放進(jìn)行監(jiān)測。

2.實(shí)驗(yàn)過程

2.1 磁性石墨烯納米片的制備

通過探頭超聲1 h，大尺寸氧化石墨烯分散液破碎小尺寸氧化石墨烯納米片（GO）。將20 mg GO、200 mL乙二醇和 4 ml二甘醇混合后，超聲分散，之后依次加入300 mg聚丙烯酸鈉、300 mg 乙酸鈉和110 mg FeCl3·6H2O。磁力攪拌后，將混合液放置于高壓反應(yīng)釜，200 ℃保持 12 h。反應(yīng)結(jié)束后，乙醇清洗，得到磁性石墨烯納米片（Fe3O4@rGO）。

2.2 介孔硅包覆磁性石墨烯納米片的制備

離心將反應(yīng)物分散于由600 mg CTAB和300 mL 1 mM NaOH組成的混合溶液中。超聲混合后，加入3 mL TEOS/APTES/乙醇溶液（體積比6：1：24）中，60 ℃溫度下，攪拌24 h。磁力分離后，使用乙醇回流，去除CTAB，得到介孔硅包覆磁性石墨烯納米片（Fe3O4@rGO@MSN）。

2.3 光熱性能測試

將配制好的不同濃度的納米材料分散液進(jìn)行探頭超聲分散，置于石英比色皿中，置于808 nm激光（功率密度1 W/cm2）照射下，使用紅外成像儀對分散液的溫度變化進(jìn)行監(jiān)測，時(shí)間為10 min。

2.4 藥物裝載

避光條件下，將Fe3O4@rGO@MSN納米片（5 mg）與OP溶液（5 mL，1 mg mL-1）混合，攪拌24 h。離心后，使用PBS清洗數(shù)次，將OP/Fe3O4@rGO@MSN納米片重新分散于在PBS中。通過上清液中OP濃度，計(jì)算載藥率。

2.5 近紅外光響應(yīng)性藥物釋放測試

將納米分散液置于不同pH（和7.4）的PBS緩沖液，而后置于透析管（分子量截留為20 kDa）中，再將透析管沉于對應(yīng)的PBS緩沖液中，與不同時(shí)間點(diǎn)吸取定量透析液，并向母液內(nèi)補(bǔ)充等量緩沖液。通過UV-Vis分光光度計(jì)檢測上清液中DOX的釋放情況。接下來，使用相同操作測試808 nm激光照射（1 W/cm2，10 min）下DOX釋放情況。

2.6 體外細(xì)胞毒性及治療評價(jià)

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤A549細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)24 h后，將DMEM培養(yǎng)基替換為含有不同濃度Fe3O4@rGO@MSN納米片的新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基。將MTT溶液（20 μL，PBS緩沖液中的 5 mg/mL）加入到每個(gè)孔中，再孵育4 h。除去含MTT的細(xì)胞培養(yǎng)基后，每孔加入DMSO（150 μL）。然后通過酶標(biāo)儀測量490 nm處的吸光度。接下來，將上述納米分散液與A549細(xì)胞共孵育4 h后，將A549細(xì)胞分為5組：（1）Control；（2）NIR；（3）Fe3O4@rGO@MSN；（4）OP/Fe3O4@rGO@MSN；（5）OP/Fe3O4@rGO@MSN+NIR。其中Ⅱ和Ⅴ組NIR（1 W/cm2，10 min）照射后，繼續(xù)孵育20 h，使用MTT方法測試細(xì)胞存活率。

二、結(jié)果與討論

1.形貌表征

掃描電鏡結(jié)果顯示所制備的磁性石墨稀基介孔桂納米片的尺寸大約為150 nm，比微米級(jí)氧化石墨烯原料的尺寸要小，這是由于在合成過程中連續(xù)的強(qiáng)超聲及溶劑熱處理使氧化石墨烯片破碎的緣故。透射電鏡結(jié)果顯示磁性石墨烯納米片上均勻地分布著許多小的球形顆粒，它們連同石墨烯納米片一起被有序的介孔覆蓋。通過使用高分辨的TEM可證實(shí)球形顆粒是Fe3O4納米粒子尺寸約為13 nm。

2.光熱性能測試

為實(shí)現(xiàn)腫瘤的光熱治療，配制了不同濃度的Fe3O4@mSiO2分散液，使用具有組織穿透能力強(qiáng)的808 nm近紅外光，作為光源，用以測試光熱升溫效果。如圖1所示，808 nm（1 W/cm2，10 min）激光照射后，不同濃度Fe3O4@mSiO2分散液（50、100、200 μg/mL）的溫度分別升高到40.5、46.7、50.6 ℃，其溫度與濃度呈正相關(guān)，有利于DOX的釋放，并作用于腫瘤細(xì)胞。而作為對照的PBS，溫度僅升高4.3 ℃。

3.NIR控制藥物釋放測試

OP作為常用的化療藥物，對多種常見惡性腫瘤具有良好的治療效果。基于此，使用磁性納米粒子對藥物負(fù)載與控釋性能等方面進(jìn)行了研究，即以O(shè)P為模型藥物，設(shè)計(jì)研究該磁性納米材料對OP裝載與控制釋放能力。經(jīng)UV-Vis光譜測試，磁性石墨烯基介孔硅納米片對OP的裝載率約為22.4%。

藥物的定點(diǎn)釋放，不僅減少藥物的毒副作用，同時(shí)能夠提升化療效果。首先，使用pH 7.4為模擬正常人體生理環(huán)境，研究了磁性納米粒子中OP外釋放性能。經(jīng)24 h體外模擬釋放，在pH7.4的PBS介質(zhì)中，OP釋放率僅為10.2%，說明OP的釋放較低，對正常組織的傷害較低。隨后，測試了中性條件下808 nm激光照射條件下的OP釋放情況。802 nm激光（1 W/cm2）照射10 min后OP/Fe3O4@rGO@MSN納米粒子中OP的累積釋放率增加到42.5%分析認(rèn)為由于介質(zhì)材料的光熱效應(yīng)加速了藥物的釋放。以上數(shù)據(jù)表明，以此磁性納米粒子為載體可有效裝載抗腫瘤藥物OP，藥物釋放行為NIR依賴性。

4.體外細(xì)胞抗腫瘤實(shí)驗(yàn)

生物安全性是納米材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域能否應(yīng)用的重要的評價(jià)指標(biāo)之一，因此我們通過MTT實(shí)驗(yàn)，對Fe3O4@rGO@MSN納米片在A549細(xì)胞中的生物安全性進(jìn)行檢測。通過將Fe3O4@rGO@MSN 2納米分散液與A549細(xì)胞在不同的時(shí)間共同孵育后，A549細(xì)胞無中毒現(xiàn)象，即使將納米分散液的濃度達(dá)到400 μg/mL，材料與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞活性仍保持在89%以上（圖2），說明該磁性納米材料具有一定的生物相容性，可以基本滿足生物醫(yī)用的要求。接下來，我們通過相同的MTT法測試了體外抗癌情況。與對照組相比，單一NIR照射沒有顯著抑制A549細(xì)胞生長，即NIR對A549細(xì)胞沒有明顯殺傷作用。其它各實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出濃度依賴性細(xì)胞毒性。OP/Fe3O4@rGO@MSN（200 μg/mL）與A549細(xì)胞共孵育后，細(xì)胞存活率為72.1%。當(dāng)采用808 nm激光照射Fe3O4@rGO@MSN和OP/Fe3O4@rGO@MSN孵育的A549細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率分別下降到35.7%和6.5%，分析認(rèn)為是光熱療法和化療的協(xié)同效果所致。因此，所開發(fā)的Fe3O4@rGO@MSN不僅能利用起光熱效應(yīng)有效的消融癌細(xì)胞，還能將其作為藥物載體有效的負(fù)載抗癌藥物DOX進(jìn)行化療，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光熱效應(yīng)與化療作用相結(jié)合得到的協(xié)同治療效果，優(yōu)于光熱或化療的單一效果。

（a）不同濃度Fe3O4@mSiO2納米粒子與C6細(xì)胞共培養(yǎng)后的細(xì)胞存活率；（b）不同方法處理后的細(xì)胞存活：（Ⅰ）Control；（Ⅱ）NIR；（Ⅲ）Fe3O4@mSiO2；（Ⅳ）DOX/Fe3O4@mSiO2；（Ⅴ）DOX/Fe3O4@mSiO2+NIR

Fig.1 Cell viability tests：（a）Cell viability of co-cultivation of different concentrations of Fe3O4@mSiO2nanoparticles and cells；（b）Cell viability of different groups：（1）Control；（2）NIR；（3）Fe3O4@mSiO2；（4）DOX/Fe3O4@mSiO2；（5）DOX/Fe3O4@mSiO2+NIR

結(jié)語

本文采用熱溶劑法制備磁性石墨烯納米粒片，并利用溶膠凝膠法制備介孔硅包覆的磁性給石墨烯納米片。對制備的介孔硅包覆的磁性給石墨烯納米片的結(jié)構(gòu)、光熱性能和藥物裝載釋放行為進(jìn)行了表征和測試。通過形貌觀察發(fā)現(xiàn)所得的介孔硅包覆的磁性給石墨烯納米片為“三明治”片狀結(jié)構(gòu)。介孔硅的包覆具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）在磁性石墨烯片層結(jié)構(gòu)表面包覆介孔硅，在賦予石墨烯多孔功能的同時(shí)，又可提高磁性石墨烯片層結(jié)構(gòu)的親水性；（2）介孔硅表面的孔洞有利于提高OP的裝載率，并可降低在體內(nèi)循環(huán)的過程中的藥物提前釋放，對正常組織造成傷害；（3）當(dāng)納米載體到達(dá)病灶部位后，藥物的釋放速率可受到NIR影響。