曲艷波，張佳琪，裴 瀟，吳慧敏，張萬舉

(黃岡師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，湖北 黃岡 438000)

隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，越來越多的人在享受美好生活的同時(shí)有了延緩衰老的需求，市場上隨之出現(xiàn)了各類保健產(chǎn)品，這些產(chǎn)品的實(shí)際應(yīng)用效果和安全性是消費(fèi)者關(guān)心的重要問題，其中由純天然成分制成的保健產(chǎn)品尤為引入關(guān)注。自由基學(xué)說又稱自由基衰老理論，最早有美國科學(xué)家納姆·哈曼(Denham Harman)在1956年提出并發(fā)布。他認(rèn)為自由基是破壞生物大分子、導(dǎo)致細(xì)胞衰老和機(jī)體衰老的主要原因，衰老過程中的退行性變化，如組織細(xì)胞發(fā)生的變性、壞死等是由于細(xì)胞正常代謝過程中產(chǎn)生的自由基造成的。自由基學(xué)說能夠合理解釋機(jī)體衰老過程中出現(xiàn)的種種癥狀(老年斑、皺紋、免疫力下降等)，目前已被醫(yī)學(xué)界普遍接受，即衰老是來自機(jī)體遭受自由基侵害而發(fā)生的破壞性結(jié)果?；谠摾碚摚壳笆袌錾铣霈F(xiàn)了各類保健品，其主要原理均為通過清除自由基達(dá)到延緩衰老、美白皮膚等效果。

SammiWhite美肌丸白番茄膠囊中含有CaroWhite、Multi-AOx、橄欖油提取物和L-半胱氨酸等活性成分。其中CaroWhite的主要成分是兩種天然無色類胡蘿卜素(CLC)八氫番茄紅素和六氫番茄紅素，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，清除自由基的功效遠(yuǎn)勝于維生素E和其他類胡蘿卜素[1]。橄欖油提取物中卟啉化學(xué)結(jié)構(gòu)能形成 “分子絡(luò)合物”還原游離自由基而具有抗氧化活性[2]，是最有效的天然抗氧化劑之一。白番茄是來自以色列的特有品種，其中含有豐富的天然無色類胡蘿卜素(CLC)，對(duì)大多數(shù)動(dòng)物與人類胡蘿卜素是經(jīng)食物鏈傳遞、積累、代謝，呈現(xiàn)復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)，在機(jī)體內(nèi)具有清除自由基，抗氧化，生成維生素A，調(diào)控細(xì)胞信號(hào)通路上調(diào)抗氧化酶等特性以預(yù)防疾病促進(jìn)健康[3]，抗氧化能力是普通番茄的幾百倍，SammiWhite中白番茄占22%。

目前，已經(jīng)有多種方法應(yīng)用于化合物抗氧化能力評(píng)價(jià)，如氧自由基吸收能力法(ORAC)、次氯酸鹽自由基法、ABTS法、DPPH法等?？寡趸u(píng)價(jià)方法各有千秋，但相比較而言，DPPH法簡單易行，是常用的方法之一。DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，廣泛應(yīng)用于定量測定生物試樣、純化合物、提取物的體外抗氧化能力。本文選取SammiWhite美肌丸白番茄膠囊為研究對(duì)象，采用超聲輔助提取其抗氧化成分，并采用DPPH法對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行了研究，為純天然成分制備延緩衰老的保健產(chǎn)品提供一定的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

主要儀器：TU1901紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海力辰儀器科技有限公司；H2500R高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DS-5510DTH，上海生析超聲儀器有限公司；DZF-6020真空干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；ME104E電子分析天平，梅特勒托利多集團(tuán)。

主要試劑：DPPH(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；抗壞血酸Vc(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲醇(AR)，武漢欣申試化工科技有限公司；乙醇(AR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SammiWhite抗氧化成分的提取

取市售SammiWhite硬膠囊20粒，去膠囊皮收集內(nèi)容物，用研缽碾細(xì)，然后稱取樣品3.5 g置于250 mL燒杯中，加入一定量的甲醇充分混勻，料液比例為1:30(g/mL)。將溶液加熱至55 ℃超聲提取15 min，連續(xù)提取三次，合并離心液，采用離心機(jī)離心5 min得上清液(5000 r/min)，合并上清液并采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，最后將濃縮后得到的固體提取物真空干燥12 h，得到SammiWhite膠囊提取物(標(biāo)記為SW)。

2.2 DPPH法抗氧化活性研究

DPPH法是研究化合物體外抗氧化活性的經(jīng)典方法之一，具有操作簡潔、計(jì)量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛采用。此法主要依據(jù)DPPH自由基有單電子，在紫外517 nm處有最大吸收，且其醇溶液呈紫色的特性[4]。自由基清除劑可以捕獲DPPH中的單電子而使其顏色變淺，最大吸收波長處的吸光度變小，且其變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系，即自由基清除能力越強(qiáng)，吸光度越小[5-6]。被測化合物的抗氧化活性通常用抑制率來表示，抑制率越大，抗氧化活性越強(qiáng)。

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取DPPH 0.0022 g于100 mL容量瓶中，無水甲醇定容得儲(chǔ)備液，濃度為0.022 mg/mL。分別用移液槍取1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL儲(chǔ)備液，置于10 mL具塞試管中，用甲醇定容至10 mL，配成濃度分別為0.0022 mg/mL、0.0044 mg/mL、0.0066 mg/mL、0.0088 mg/mL、0.0110 mg/mL的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定上述各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并擬合回歸方程。

DPPH殘留率[7]的計(jì)算公式為：REM=c/c0×100%。式中:c為加入抗氧化劑穩(wěn)定后DPPH的質(zhì)量濃度;c0為DPPH的原始質(zhì)量濃度。

2.2.2 抗氧化活性測定

根據(jù)殘留率公式計(jì)算出DPPH殘留率，設(shè)為縱坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的樣品添加量設(shè)為橫坐標(biāo)。繪制出不同濃度梯度樣品清除DPPH的殘留率曲線，并添加回歸方程式。根據(jù)回歸方程式，計(jì)算出當(dāng)DPPH殘留率為50%時(shí)，抗氧化劑樣品添加量的大小，即半數(shù)清除濃度(IC50)[8-9]。

(1)配置DPPH溶液：準(zhǔn)確稱取DPPH 2.2 mg，用無水甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得濃度為0.022 mg/mL的DPPH溶液，避光保存，備用。

(2)配置樣品溶液：精密稱取SW 500 mg，用無水甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為5 mg/mL的供試品母液。用移液管在容量瓶中分別吸取1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL母液，并分別將其稀釋成濃度為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL共五種不同系列的供試品溶液。

(3)配置抗壞血酸溶液：按上述步驟來配制濃度分別為0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL的抗壞血酸溶液，作為陽性對(duì)照。

(4)SW清除DPPH自由基實(shí)驗(yàn)：分別量取不同濃度的供試品溶液0.1 mL加入10 mL具塞試管中，加入配置好的DPPH溶液3.9 mL，避光反應(yīng)30 min，以無水甲醇為空白對(duì)照，測定其在517 nm處的吸光度，每種樣品液作三次平行，取平均值。

(5)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：重復(fù)上一步，分別量取不同濃度的抗壞血酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測定其在517 nm處的吸光度，每種樣品液作三次平行，取平均值。

(6)清除自由基半數(shù)有效量的計(jì)算和自由基清除能力的評(píng)價(jià)：根據(jù)化合物清除DPPH自由基的曲線，計(jì)算得到DPPH自由基原始質(zhì)量濃度減少至50%時(shí)化合物的用量為半數(shù)有效量(IC50)。自由基清除能力AE=1/IC50，根據(jù)AE的大小判斷抗氧化劑清除自由基的能力的大小。

3 結(jié)果與討論

3.1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分光光度法測定不同濃度的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm處的吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)做圖，繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1所示。做線性回歸分析，得到其線性回歸方程為：y=36.2727x-0.0660 (R=0.9996)，表明DPPH自由基濃度與其吸光度呈明顯正相關(guān)關(guān)系。

圖1 DPPH自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 抗氧化活性分析

DPPH溶液中加入不同濃度的SW溶液和Vc溶液，避光反應(yīng)30 min后，在波長517 nm處測其吸光度，根據(jù)DPPH殘留率計(jì)算公式計(jì)算DPPH自由基的殘留率，結(jié)果見表1。以DPPH自由基殘留率為縱坐標(biāo)，SW及Vc溶液的濃度為橫坐標(biāo)，繪制殘留率濃度關(guān)系曲線(圖2)。根據(jù)線性分析，SW清除 DPPH自由基的殘余率的回歸方程為y=-56.2073x+16.6967(R=0.9997)，而Vc清除 DPPH自由基的殘余率的回歸方程為y=-63.104x+20.348(R2=0.9996)。比較兩種物質(zhì)對(duì)DPPH自由基的清除能力可知，SW和Vc均對(duì)DPPH自由基有較好的清除效果，且清除率與其濃度呈正相關(guān)。根據(jù)方程計(jì)算可得SW清除DPPH自由基的IC50為0.288 mg/mL，AE值為3.472，而對(duì)照品Vc清除DPPH自由基的IC50為0.338 mg/mL，AE值分別為2.959。比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，SW清除DPPH自由基能力高于對(duì)照品Vc，表現(xiàn)出較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。

圖2 DPPH的殘留率曲線

表1 DPPH與SM/Vc相互作用后的殘留率

DPPH法是判定化合物體外抗氧化活性的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法。本研究結(jié)果表明SammiWhite膠囊提取物(SW)隨著劑量的增加，DPPH自由基清除率相應(yīng)增加，該劑量依賴關(guān)系提示SW能夠與DPPH自由基結(jié)合生成DPPH-SW，從而消耗DPPH，降低DPPH自由基含量，達(dá)到清除自由基的功效[10]。SW能夠清除DPPH自由基，具有抗氧化活性，可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行更深入的研究，以達(dá)到開發(fā)相關(guān)產(chǎn)品的目的。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲提取法從美白產(chǎn)品SammiWhite中得到提取物(SW)，通過DPPH法研究了SW的抗氧化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SW具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系，SW對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除濃度IC50值為0.288 mg/mL，AE值為3.472，優(yōu)于對(duì)照品Vc。保健產(chǎn)品的有效性和安全性越來越受關(guān)注，本研究能夠?yàn)橄嚓P(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供一定的參考信息。