鐘青燕 熊小波 曾 婷 王大永 吳勇聰 袁德健 蔡 稔 嚴(yán)提珍

[1 柳州市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳科，廣西柳州市 545001； 2 柳州市出生缺陷預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西柳州市 545001； 3 柳州市婦幼保健院兒童保健科，廣西柳州市 545001； 4 蘇州新波生物技術(shù)有限公司，江蘇省蘇州市 201203； 5 珀金埃爾默醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品(上海)有限公司，上海市 215400]

智力障礙包括一系列以低智商、適應(yīng)性行為和功能受限為特征的癥狀[1-2]。在全世界人群中智力障礙的患病率約為1%，嚴(yán)重智力障礙的患病率約為0.6%[3]。遺傳因素是智力障礙發(fā)生的主要影響因素，由這一因素導(dǎo)致的智力障礙患者占85%[4]。其中，脆性X綜合征(fragile X syndrome,FXS)是智力障礙常見的遺傳因素。FXS的主要臨床表現(xiàn)為不同程度的智力低下、孤獨(dú)癥、特殊面容(長(zhǎng)臉、大耳朵、尖下巴)、男性巨睪等。FXS發(fā)病的主要分子機(jī)制是脆性X智力低下1( fragile X mental retardation 1,FMR1)基因5′端非編碼區(qū)的三核苷酸重復(fù)序列CGG過度擴(kuò)增[5]。既往關(guān)于FMR1基因的缺失和點(diǎn)突變的研究顯示[6-7]，F(xiàn)MR1基因位于X染色體q27.3,全長(zhǎng)38 kb，由17個(gè)外顯子和16個(gè)內(nèi)含子組成，編碼FMR1蛋白，在其上游約250 bp處有一個(gè)CpG島。美國人類遺傳學(xué)學(xué)會(huì)指南[8]根據(jù)FMR1基因CGG序列的重復(fù)次數(shù)將其基因型劃分為正常型、中間型(灰區(qū))、前突變型和全突變型。其中，重復(fù)次數(shù)6～44次為正常型，F(xiàn)MR1基因可以正常表達(dá)，無臨床表現(xiàn)；重復(fù)次數(shù)45～54次為中間型，無明顯臨床表現(xiàn)，子代可擴(kuò)增為前突變型；重復(fù)次數(shù)55～200次為前突變型，約有20%攜帶前突變型FMR1基因的女性會(huì)發(fā)生卵巢功能不全或卵巢早衰，攜帶前突變型FMR1基因的部分男性和少部分女性由于X染色體失活，在成人期會(huì)出現(xiàn)脆性X相關(guān)性震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征；重復(fù)次數(shù)大于200次為全突變型，在男性FMR1基因發(fā)生全突變會(huì)導(dǎo)致CpG島異常甲基化，抑制FMR1基因正常表達(dá)，導(dǎo)致FMR1嚴(yán)重減少或缺乏，表現(xiàn)為典型的FXS，也有 30%～50%攜帶全突變型FMR1基因的女性表現(xiàn)輕重程度不等的智力低下。由于FXS的臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，且青春期之前的兒童臨床表現(xiàn)不明顯，因此需要借助基因診斷的方法對(duì)患兒進(jìn)行早期診斷、早期干預(yù)。本研究運(yùn)用PCR微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)聯(lián)合Southern印跡雜交法對(duì)FMR1基因進(jìn)行CGG重復(fù)次數(shù)檢測(cè)， 分析不明原因智力障礙兒童FXS的發(fā)病率，以期為本地區(qū)智力低下人群的FXS發(fā)生率研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 納入2017年12月到2020年5月期間在柳州市婦幼保健院就診的所有不明原因智力障礙兒童(180例)及部分FMR1基因突變患兒的家系成員(2個(gè)家系共5例)。180例兒童中男童145例、女童35例，年齡為1.39～11.92(3.81±1.77)歲。智力障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)：智力水平落后于同齡人平均智商兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上，即智商≤70分；存在適應(yīng)性行為缺陷。本研究經(jīng)柳州市婦幼保健院審查倫理委員會(huì)審批通過(20160227042)，研究對(duì)象和/或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA樣本準(zhǔn)備：使用核酸提取試劑盒(蘇州新波生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AQ20201001)，在Chemagic 360全自動(dòng)核酸提取儀(蘇州新波生物技術(shù)有限公司)上提取受試者外周血(200 μL)基因組DNA，提取的基因組DNA用于PCR檢測(cè)。另使用QIAamp DSP全血DNA提取試劑盒(Qiagen公司，批號(hào)：166016522)提取基因組DNA，用于Southern印跡雜交。所有實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.2 PCR微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)：使用FMR1基因檢測(cè)試劑盒(PCR微流控芯片毛細(xì)管電泳法，蘇州新波生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：AR20200901)進(jìn)行FMR1基因突變分析。對(duì)受試者基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括FX反應(yīng)液15 μL、FX稀釋液3.8 μL、FX聚合酶0.2 μL、DNA模板1 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性35 s，61 ℃退火35 s，72 ℃延伸4 min，共25個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸純化，純化后的PCR產(chǎn)物在LabChip GX Touch微流控毛細(xì)管電泳儀(蘇州新波生物技術(shù)有限公司，型號(hào)：LabChip GX Touch)上進(jìn)行PCR產(chǎn)物片段大小分析。本研究同時(shí)采用已知重復(fù)次數(shù)的參考樣本(質(zhì)控DNA，5個(gè)不同CGG重復(fù)次數(shù)的DNA片段，29/43/56/100/375 CGG重復(fù)次數(shù))構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣本通過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到更高精度的CGG重復(fù)數(shù)。

1.2.3 Southern印跡雜交法：將所有FMR1基因全突變型病例樣本送到中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳研究中心進(jìn)行Southern印跡雜交檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 PCR微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測(cè)結(jié)果 180例患兒中，檢出FMR1基因全突變型4例(均為男童)、中間型1例、正常型175例，F(xiàn)XS檢出率為2.22%(4/180)；正常型的CGG重復(fù)次數(shù)范圍是12～44次，最常見的CGG重復(fù)次數(shù)是28次和29次。4例FMR1基因全突變型的家系中，家系1先證者CGG重復(fù)次數(shù)為190/248/370次，母親為25次和134次，妹妹為39次和148/218/554次，姨媽為29次和29次；家系2先證者CGG重復(fù)次數(shù)為859次(此家系僅檢測(cè)了患者)；家系3先證者CGG重復(fù)次數(shù)為529次，母親為31次和76次，姐姐為29次和130次；家系4先證者CGG重復(fù)次數(shù)為525次(此家系僅檢測(cè)了患者)。4例FMR1基因全突變型病例家系的臨床表現(xiàn)及基因檢測(cè)結(jié)果見表1，家系1的PCR微流控毛細(xì)管電泳檢測(cè)結(jié)果圖譜見圖1。

2.2 Southern印跡雜交法檢測(cè)結(jié)果 FMR1基因全突變型病例的樣本經(jīng)Southern印跡雜交檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果都顯示有>5.8 kb條帶(全突變條帶)，與PCR微流控毛細(xì)管電泳檢測(cè)基因分型結(jié)果完全一致，見表1。

表1 4例全突變型患兒及家系的臨床表現(xiàn)和檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

1977年Sutherland[9]最早采用G顯帶技術(shù)發(fā)現(xiàn)并證明了X染色體q27.3上存在脆性位點(diǎn)。該方法操作煩瑣、費(fèi)時(shí)、可靠性差，已逐漸被替代。1991 年Verkerk 等[10]應(yīng)用定位克隆法在X染色體q27.3附近發(fā)現(xiàn)了FMR1基因，使FXS的診斷進(jìn)入分子水平階段。目前Southern印跡雜交法是FXS基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法所需樣本量大、檢測(cè)通量低、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，因而不適合用于常規(guī)篩查。最初的PCR只能檢測(cè)正常和小片段前突變等位基因，對(duì)于大片段前突變型和全突變型基因，由于GC含量增高容易導(dǎo)致極高的Tm值，以及CGG重復(fù)次數(shù)增多容易形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而不能很好地完成擴(kuò)增。隨著人們對(duì)FXS相關(guān)基因不斷地了解和認(rèn)識(shí)，PCR技術(shù)得到了不斷的優(yōu)化，這一難題逐步得到解決。本研究引用PerkinElmer專利技術(shù)，用一對(duì)跨越FMR1基因啟動(dòng)子5′非編碼區(qū)CGG重復(fù)序列的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得包含全部CGG重復(fù)序列的PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)過核酸純化試劑盒的純化后，使用全自動(dòng)微流控芯片毛細(xì)管電泳儀通用試劑盒，在全自動(dòng)微流控芯片毛細(xì)管電泳分析儀上分析DNA片段的大小，同時(shí)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出CGG重復(fù)次數(shù)，能實(shí)現(xiàn)對(duì)FMR1基因5′非編碼區(qū)CGG重復(fù)序列的精確定量，從而準(zhǔn)確區(qū)分正常型、中間型、前突變型、全突變型，可有效識(shí)別CGG重復(fù)次數(shù)高達(dá)1 400次的全突變型，整個(gè)過程僅需6 h，高效快速，方法簡(jiǎn)便易操作，適用于大規(guī)模人群篩查。本研究中，4例FMR1基因全突變型病例的樣本經(jīng)Southern印跡雜交法驗(yàn)證，均顯示有>5.8 kb條帶(全突變條帶)，提示兩種檢測(cè)結(jié)果一致，表明PCR微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)能有效檢出FMR1基因全突變型。

本研究采用PCR微流控毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)180例不明原因智力障礙兒童進(jìn)行FMR1基因突變分析，結(jié)果顯示正常型CGG重復(fù)次數(shù)范圍為12～44次，最常見的等位基因重復(fù)次數(shù)是28次和29次，與Chen等[11]報(bào)告的結(jié)果相似。本研究中，180例不明原因智力障礙兒童的FXS檢出率為2.22%，與Zhong等[12]在中國東、西、南、北、中部地區(qū)5個(gè)城市的1 127例智力低下患者中的FXS檢出率(2.8%)相近。不同國家或地區(qū)報(bào)告的智力低下人群的FXS發(fā)生率差異較大：歐美發(fā)達(dá)地區(qū)的發(fā)生率一般在1%～4%之間[13-14]，巴基斯坦發(fā)生率為4.8%[15]；而在我國，葉志純等[16]報(bào)告湖南省先天性智力低下兒童的FXS發(fā)生率高達(dá)8.05%，羅詩坤等[17]報(bào)告華南和華中等地區(qū)不明原因智力障礙患者的FXS發(fā)生率高達(dá)9.4%。產(chǎn)生這些差異的主要原因，筆者認(rèn)為有以下幾點(diǎn)：(1)雖然FXS影響全球所有種族，但由于種族差異，不同人群的患病率可能有所不同。(2)根據(jù)上述研究結(jié)果可以看出，發(fā)達(dá)國家智力低下人群的FXS發(fā)生率總體上低于發(fā)展中國家，可能原因是發(fā)達(dá)國家較早開展此方面的研究，比較重視智力障礙人群的遺傳史和家族史，較早制定相應(yīng)的指南規(guī)范，使得FXS得到較好的預(yù)防和控制，因此發(fā)生率相對(duì)更低。(3)各研究所納入的人群不一樣，F(xiàn)XS發(fā)生率差異比較大。本研究和Zhong等[12]納入的人群均為不明原因智力障礙的兒童，而葉志純等[16]納入的人群為臨床上高度懷疑為FXS的患者，且發(fā)育商在0～55分之間，羅詩坤等[17]納入的人群是已經(jīng)排除了染色體病、基因組病和遺傳性代謝病的不明原因智力障礙患者，這大大縮小了納入人群范圍，故與本研究的發(fā)生率相差比較大。

總之，在不明原因智力障礙兒童中存在一定比例的FXS患兒。目前尚無有效治療FXS的方法，用葉酸輔以營養(yǎng)神經(jīng)和神經(jīng)康復(fù)治療可改善FXS患者的智力狀況，年幼者效果更好。臨床上應(yīng)對(duì)疑似FXS的患兒進(jìn)行基因診斷，盡早明確診斷后可以早期給予藥物、行為、言語、心理等干預(yù)，從而提高患兒的生活自理能力，改善患兒的生活質(zhì)量，減輕社會(huì)負(fù)擔(dān)。同時(shí)，應(yīng)對(duì)患兒家族成員進(jìn)行基因診斷，為其提供遺傳咨詢和生育指導(dǎo)，避免此類患兒的出生。