趙晉鋒，余愛麗，李顏方，杜艷偉，王高鴻，王振華

（山西農(nóng)業(yè)大學谷子研究所，特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點實驗室，山西 長治 046011）

鈣離子(Ca2+）作為植物細胞第二信使，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)的許多生理生化過程中發(fā)揮重要作用[1]。植物細胞內(nèi)的Ca2+感應(yīng)蛋白能感知由外界脅迫引起的Ca2+含量變化，并把鈣信號傳遞給靶標蛋白以啟動級聯(lián)反應(yīng)使植物應(yīng)對各種逆境脅迫[2]。鈣調(diào)磷酸酶B蛋白(calcineurin B-like proteins,CBL)是植物中重要的Ca2+感受器，其保守核心區(qū)域含4個EF-hand結(jié)構(gòu)，每個EF-hand結(jié)構(gòu)含有2個α-螺旋，由12個典型氨基酸殘基構(gòu)成的環(huán)連接，形成螺旋-環(huán)-螺旋典型結(jié)構(gòu)[3]。另外，CBL的C端含有1個保守氨基酸殘基組成的PFPF基序，其中絲氨酸殘基可被CIPK磷酸化，其他殘基可作為分子調(diào)控的開關(guān)[4-6]。CBL通常與其靶蛋白CIPK(CBLinteracting protein kinase,CIPK）構(gòu)成CBL-CIPK信號途徑，在植物逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[7]。植物CBL是多基因家族，目前在許多植物中都發(fā)現(xiàn)了CBL基因家族，如擬南芥、水稻，玉米，高粱、楊樹、棉花、苜蓿、甘草、黃瓜、梨等[8-14]。擬南芥AtCBL4參與SOS途徑，把多余的Na+排出細胞以提高植物對鹽脅迫的耐受性[15]，水稻、谷子中的同源CBL4基因也參與SOS途徑，并行使AtCBL4相類似的功能[16-17]。玉米ZmCBL4可以顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性[18]；GhCBL2和GhCBL3在調(diào)節(jié)棉纖維的伸長方面發(fā)揮重要作用[19]；AtCBL1和AtCBL9參與調(diào)控擬南芥在低鉀狀態(tài)下K+吸收和轉(zhuǎn)運[20]；AtCBL2和AtCBL3參與擬南芥胚和種子發(fā)育以及高水平離子脅迫響應(yīng)[21-22]；水稻OsCBL2與大麥HvCBL2表達受赤霉素(gibberellins，GA）誘導(dǎo)上調(diào)，在籽粒糊粉細胞的糊粉體中特異表達，在糊粉體的形成中具有正調(diào)節(jié)作用[23]；擬南芥AtCBL1/9參與植物響應(yīng)干旱脅迫信號途徑[24]，AtCBL9參與磷酸化硝酸鹽轉(zhuǎn)運體CHL1，使其從低親和性轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂H和性來發(fā)揮調(diào)控作用[25]；AtCBL1/9還參與擬南芥活性氧信號調(diào)節(jié)過程[26]；AtCBL2不僅負調(diào)控細胞膜上的H+-ATPase，而且參與了光信號途徑[27]。越來越多的研究表明，CBL在植物逆境脅迫應(yīng)答以及調(diào)節(jié)植物的生長和發(fā)育，硝酸鹽、銨和鐵的吸收和運輸，維持K+、H+穩(wěn)態(tài)，活性氧信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。

谷子[Setaria italica(L.)P.Beauv.]起源于我國，是抗旱、耐瘠、廣適的C4禾本科重要糧食和飼草作物，在我國糧食生產(chǎn)及安全方面占有重要地位。CBL基因參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育，尤其在響應(yīng)植物逆境應(yīng)答發(fā)面發(fā)揮重要作用，因此谷子CBL基因值得進一步研究。本課題組前期利用生物信息學方法鑒定了谷子CBL基因家族，并證明了SiCBL4可以和SiCIPK24互作調(diào)控植株的耐鹽性[17]。在此基礎(chǔ)上，本文重點分析SiCBL3在非生物逆境脅迫下的表達情況，旨在進一步揭示其在谷子逆境應(yīng)答中的功能。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷子材料為豫谷1號，保存于山西農(nóng)業(yè)大學谷子研究所生物技術(shù)課題。旱棚生長管理同大田；組培室溫度為(22±2)℃,濕度60%,光照周期為16 h光照/8 h黑暗，光照強度約為130μmol·m-2·s-1。

1.2 材料處理

在谷子幼苗三葉一心期進行PEG(20%PEG-6000)、鹽(250 mmol·L-1NaCl)、ABA(100μmol·L-1)、低溫(4℃)和高溫(42℃)脅迫處理，處理后0、1、3、6、12和24 h整株取樣。旱棚對照生育期內(nèi)正常澆水，干旱處理在進入相應(yīng)生育階段前1周開始，其他時間采用自然控水[28]。

1.3 SiCBL3基因特征分析

參考趙晉鋒等[28]方法，對SiCBL3基因結(jié)構(gòu)、蛋白特征及啟動子區(qū)域順式元件等參數(shù)進行分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成及引物設(shè)計

用生工生物工程(上海)股份有限公司TRIzol試劑盒提取植物總RNA，第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。引物利用Primer Primer 5.0設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本文使用引物序列詳見表1。

1.5 亞細胞定位

使用引物A、B(表1）擴增SiCBL3，反應(yīng)體系20.0μL,包含10.0μL 2×PCR Mix、正反向引物(10μmol·L-1)各1.0μL、1.0μL cDNA模板、1.0μLTaqDNA Polymerase，無菌水補足至20μL。程序為95℃2.5 min；95℃15 s，60℃30 s,72℃45 s,30個循環(huán)；72℃10 min，4℃保存。目的片段回收后與線性化PCAMBIA2301-KY-GFP載體骨架重組，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞涂布于含有卡那霉素(Kan,50μg·mL-1)的LB固體平板，37℃倒置培養(yǎng)。單克隆菌株于含有相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、260 r·min-1過夜培養(yǎng)，將經(jīng)PCR檢測的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司測序驗證。用生工生物工程(上海)股份有限公司質(zhì)粒提取試劑盒提取含GFP空載體與含目的基因載體的質(zhì)粒DNA并純化備用。擬南芥原生質(zhì)體準備參照Zhang等[29]描述方法，擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考Gu描述方法[30]。利用Nikon C2-ER激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照。

表1 本文實驗使用引物Table 1 Primers used in this study

1.6 熒光實時定量PCR分析

以谷子β-actin基因(Seita.7G294000)為參照進行Real-time PCR，反應(yīng)體系20μL,包含10μL 2×熒光染料混合液、0.4μL正向引物(10μmol·L-1)、0.4μL反向引物(10μmol·L-1)、2μL cDNA模板、7.2μL無菌水。程序為95℃，3 min；95℃，5 s，60℃，10 s,72℃，15 s,45個循環(huán)。試驗設(shè)計3次重復(fù)，采用相對定量2-ΔΔCT方法[31]計算相對表達。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiCBL3基因特征參數(shù)

Phytozome數(shù)據(jù)庫顯示，SiCBL3基 因ID為Seita.3G375800，位于3號染色體的47 858 843～47 863 510 bp位置，基因組序列長4 667 bp，有2個轉(zhuǎn)錄本(Seita.3G375800.1和Seita.3G375800.2)，長度分別為1 492和1 364 bp，蛋白質(zhì)編碼區(qū)（coding sequence，CDS）序列均為678 bp，編碼226個氨基酸。2個轉(zhuǎn)錄本在編碼區(qū)均含7個內(nèi)含子以及3個典型的EF-hand功能域；而轉(zhuǎn)錄本2在5’非翻譯區(qū)還含有1個內(nèi)含子。SiCBL3分子式為C1163H1829N301O352S7，預(yù)測編碼蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為25.88 kD,等電點為4.87，不穩(wěn)定指數(shù)(the instability indexⅡ)為33.51，脂 肪 系 數(shù)(aliphatic index)為95.69，平均疏水指數(shù)(grand average of hydropathicity)為-0.240。SiCBL3基因啟動子區(qū)域順勢元件分析發(fā)現(xiàn)植物激素應(yīng)答、逆境應(yīng)答、光應(yīng)答和其他應(yīng)答等順勢元件(表2)。

表2 SiCBL3基因啟動子區(qū)域順式元件預(yù)測Table 2 Putative cis-elements in the promoter of SiCBL3

2.2 SiCBL3蛋白亞細胞定位分析

利用攜帶BamHⅠ酶切位點的PCAMBIA2301-KY-GFP為載體骨架構(gòu)建SiCBL3亞細胞定位載體。通過酶解液法得到轉(zhuǎn)基因擬南芥原生質(zhì)體。觀察SICBL3-GFP表達結(jié)果(圖1），發(fā)現(xiàn)與GFP對照相比SICBL3-GFP表達強度較弱，推測其發(fā)光位于液泡膜上。

圖1 SiCBL3亞細胞定位Fig.1 Sub-cellular localization of SiCBL3

2.3 SiCBL3苗期逆境脅迫及組織表達分析

如圖2所示，SiCBL3在苗期所有逆境脅迫處理下表達量均有所上調(diào)。ABA脅迫下，在1、3、6 h表達量明顯提升，在6 h達峰值，為對照的2.74倍，隨后下降到對照相近水平；鹽脅迫下，表達量呈升降升降趨勢，在12 h達峰值，為對照的2.15倍；高溫脅迫下呈升降趨勢，在6 h達峰值，為對照的12.79倍；低溫脅迫下呈升降升趨勢，在3 h達峰值，為對照的2.93倍；PEG脅迫下呈降升降趨勢，在12 h達峰值，為對照的2.57倍。

圖2 SiCBL3苗期不同逆境脅迫表達分析Fig.2 Expression analysis of SiCBL3 under different stresses in seedling

不同組織器官表達分析(圖3)表明，SiCBL3在倒2葉、莖桿、穗軸、幼穗、成穗、葉鞘中表達量相對較高，分別為旗葉表達量的12.04、3.37、2.37、2.25、2.07、2.63倍，在根中表達量相對較低，為旗葉的0.62倍。上述結(jié)果表明，SiCBL3在地上部組織中表達量較高，參與了谷子苗期干旱、鹽、低溫、高溫和ABA等逆境脅迫響應(yīng),在非生物逆境脅迫信號途徑中起重要作用。

圖3 SiCBL3組織表達分析Fig.3 Expression analysis of SiCBL3 in different tissues

2.4 關(guān)鍵生育階段干旱脅迫下SiCBL3表達分析

拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期是谷子生長發(fā)育中的關(guān)鍵需水期，因此檢測了SiCBL3在干旱脅迫下莖葉和根中的表達情況。如圖4所示，在正常條件下，抽穗和灌漿期莖葉中SiCBL3表達量較拔節(jié)期均有較大上升，分別為拔節(jié)期的2.76和6.63倍，表明該基因隨著植物生長發(fā)育其表達量逐步增加。在干旱脅迫下，3個生育階段莖葉中SiCBL3表達量較對照同生育階段均有大幅提升(干旱下拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期表達量分別為對照拔節(jié)期的4.74、3.80和14.00倍)。根中SiCBL3表達量在對照和干旱脅迫下不同生育階段整體趨勢變化不大，對照中灌漿期最高，為對照拔節(jié)期莖葉的1.23倍；干旱脅迫下抽穗期比對照同期略有下降，而拔節(jié)期和灌漿期較對照同期略有上升，分別為對照灌漿期的1.24和1.84倍。不同生育階段干旱脅迫分析表明，SiCBL3參與了谷子拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期的干旱脅迫應(yīng)答，而且其表達主要在地上部的莖葉等組織器官中。

圖4 關(guān)鍵生育階段干旱脅迫下SiCBL3表達分析Fig.4 Expression analysis of SiCBL3 under drought stress at key growth stages

2.5 灌漿期干旱脅迫下不同組織SiCBL3表達分析

為進一步了解SiCBL3地上組織表達情況，分析了灌漿期干旱脅迫下SiCBL3在不同組織中表達情況(圖5）?？梢钥闯?，正常條件下拔節(jié)期SiCBL3在倒2葉、莖、穗軸、葉鞘、籽粒中表達量相對較高，分別為旗葉的16.04、7.37、4.37、4.63和3.07倍，而在根中表達較低，為旗葉的1.64倍。在干旱條件下，SiCBL3在旗葉、倒2葉、穗軸、葉鞘和籽粒中比對照相應(yīng)組織中表達量有顯著提升，分別為旗葉對照的2.54、35.04、12.24、10.86和9.24倍，而莖和根中SiCBL3表達較對照相應(yīng)組織略有降低。該結(jié)果表明，灌漿期無論是否受到干旱脅迫，SiCBL3都主要在地上部器官中表達；在灌漿期受到干旱脅迫時，SiCBL3在大部分地上組織中都被大量誘導(dǎo)表達，而在根中表達量變化不大。

圖5 灌漿期旱脅迫下SiCBL3組織表達分析Fig.5 Expression analysis of SiCBL3 in different tissues under drought stress at filling stage

3 討論

谷子SiCBL3基因位于第3號染色體，含有CBL家族典型EF-hand功能域。檢索發(fā)現(xiàn)，SiCBL3有2個轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄長度不同，但其CDS序列長度和編碼氨基酸完全一致。2個轉(zhuǎn)錄本編碼區(qū)含7個內(nèi)含子，2號轉(zhuǎn)錄本在其5’非翻譯區(qū)還含有1個內(nèi)含子，推測可能對其遺傳信息表達具有某些調(diào)控作用。

苗期不同逆境脅迫分析揭示，SiCBL3表達受鹽、高溫、低溫、PEG和ABA的誘導(dǎo)，脅迫下SiCBL3表達量具有不同程度增加。研究表明，AtCBL9的表達不僅受干旱、低溫和鹽的誘導(dǎo),也受ABA的強烈誘導(dǎo),主要在幼苗期參與擬南芥對逆境的脅迫應(yīng)答[27]。ZmCBL4受鹽、LiCl、PEG和ABA誘導(dǎo)，在鹽脅迫應(yīng)答中起重要作用[19]。梨的7個候選PbCBLs中，2個基因受鹽脅迫誘導(dǎo)，3個基因分別受干旱、低溫與ABA誘導(dǎo)表達[15]。本研究結(jié)果與已有報道不同物種CBL基因逆境表達結(jié)果相似，表明CBL家族基因受多種逆境誘導(dǎo)，揭示了SiCBL3廣泛參與谷子苗期逆境應(yīng)答。

CBL蛋白通常和其靶蛋白CIPK互作構(gòu)成CBL/CIPK信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)調(diào)控植物生長發(fā)育以及逆境應(yīng)答。由于CBL和CIPK是成員之間彼此有較高同源性的多基因家族，而且CBL、CIPK以及不同CBL/CIPK之間有互作，因此CBL/CIPK系統(tǒng)介導(dǎo)的Ca2+調(diào)控體系非常復(fù)雜。同一家族的CBL基因受不同非生物逆境誘導(dǎo)表達的種類和程度以及表達組織都有所不同。SiCBL3的組織和關(guān)鍵生育階段表達分析揭示，SiCBL3在地上部如倒2葉、莖稈、葉鞘等組織中表達較高，尤其是倒2葉中表達量最高，而在地下部根中表達較低，揭示SiCBL3在這些組織中高效表達以應(yīng)對非生物逆境脅迫，在生長中后期更積極地參與植物對干旱脅迫的響應(yīng)，特別是在灌漿期干旱脅迫應(yīng)答中起重要作用。順式應(yīng)答元件分析表明，在SiCBL3啟動子區(qū)域發(fā)現(xiàn)低溫應(yīng)答、干旱誘導(dǎo)以及脫落酸、水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等激素相關(guān)順式應(yīng)答元件。該結(jié)果不僅佐證了SiCBL3基因參與谷子逆境應(yīng)答，也揭示SiCBL3可能在水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素等激素調(diào)節(jié)介導(dǎo)的生物應(yīng)激反應(yīng)中起作用。大量光順式元件以及晝夜節(jié)律控制、厭氧誘導(dǎo)、玉米醇溶蛋白代謝等順式元件的發(fā)現(xiàn)表明，SiCBL3可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答和相應(yīng)的生理生化過程。

干旱、鹽、低溫是導(dǎo)致作物減產(chǎn)的主要限制因素，CBL基因家族在植物響應(yīng)逆境脅迫、激素應(yīng)答等植物生長和發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，尤其與非生物逆境脅迫的信號傳導(dǎo)密切相關(guān)[7]。谷子是我國典型的抗旱耐瘠特色作物，發(fā)掘谷子中的重要逆境相關(guān)基因并研究其功能具有重要意義。因此本文聚焦谷子SiCBL3基因，對其基因結(jié)構(gòu)、蛋白特征、啟動子區(qū)域順式元件等參數(shù)進行了系統(tǒng)的分析和預(yù)測，并分析了其在苗期不同逆境、關(guān)鍵生育階段和灌漿期不同組織干旱脅迫下的表達，結(jié)果表明SiCBL3在谷子苗期、拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期干旱條件下參與了對干旱脅迫的響應(yīng)，推測該基因參與谷子對非生物逆境的應(yīng)答，尤其在抽穗期和灌漿期干旱脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果為進一步分析CBL基因功能以及利用基因工程方法改善谷子抗逆性和提高產(chǎn)量提供了后備基因和理論支持。