廉 丹, 魏久鋒, 丁曉飛, 劉迎香, 趙 清

(山西農業(yè)大學植物保護學院，山西 太谷 030801)

蝽科是半翅目異翅亞目中最常見的大科之一，世界性分布，全世界已知900多個屬近5 000種[1].蝽科昆蟲均為陸生，大多數(shù)為植食性種類，是重要的農業(yè)和園藝植物害蟲.如二星蝽屬的二星蝽(Eysarcorisguttiger)、擬二星蝽(E.annamita)和廣二星蝽(E.ventralis)是水稻的重要害蟲[2].部分種類如益蝽亞科的蠋蝽(Armachinensis)能夠有效控制鱗翅目、鞘翅目、膜翅目和半翅目等的多種害蟲，是重要的捕食性天敵昆蟲[3].因此，該科昆蟲具有十分重要的經濟意義.

昆蟲線粒體基因組是長度為15～20 kb的閉合環(huán)狀雙鏈DNA分子，編碼37個基因，包括13個蛋白質編碼基因(PCG)，2個核糖體RNA基因(rRNA)和22個轉運RNA基因(tRNA)[4-5].作為一種分子標記，線粒體基因組以其獨特的優(yōu)勢，如體積小、拷貝數(shù)高、缺少重組子和內含子等特點，在物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育學以及譜系遺傳學等研究領域得到廣泛應用[6].研究表明[7]，相比于以單基因進行的系統(tǒng)發(fā)育分析，線粒體基因組提供了相對豐富的遺傳信息，可以更好地推斷不同類群之間的系統(tǒng)發(fā)育關系和親緣程度.早前研究中，蝽科的系統(tǒng)發(fā)育分析大多基于單個蛋白質編碼基因，如卜云等[8]基于cox2基因序列數(shù)據(jù)，分別采用鄰接法、最大簡約法和貝葉斯推論法3種方法建立蝽科4亞科間的系統(tǒng)發(fā)育關系；代金霞等[9]基于cytb基因探討了蝽科8個物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關系，而對多個RNA基因包含的系統(tǒng)發(fā)育信息并未較好地挖掘和利用.

線粒體tRNA是具有攜帶并轉運氨基酸功能的一類小分子核糖核酸，其核苷酸序列、基因含量和基因排列方式等，均可為系統(tǒng)發(fā)育樹的構建提供信息[10-11].其序列較短，包含的系統(tǒng)發(fā)育信息較少，所以，在長期以來的系統(tǒng)發(fā)育研究中，大多只關注其在線粒體基因組中的位置變化和二級結構，而對于不同分類階元水平上基于tRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育研究十分欠缺[10].事實上，基于tRNA基因串聯(lián)數(shù)據(jù)集構建系統(tǒng)發(fā)育樹時，相比于單個tRNA基因可以得到較多的有效信息.在已有的研究中，Wang et al[11]通過對盲蝽科22個tRNA基因串聯(lián)數(shù)據(jù)集的K-2-P遺傳距離和Ka值的分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，表明tRNA基因在系統(tǒng)發(fā)育研究中具有較大的潛力.同時，近年來的研究表明[12-13]，12S rRNA和16S rRNA序列遠長于tRNA，含有較多的系統(tǒng)發(fā)育信息，可作為系統(tǒng)發(fā)育推斷的良好分子標記，用于不同分類水平的系統(tǒng)發(fā)育研究.在蝽科系統(tǒng)發(fā)育研究中，較多的是基于13個蛋白質編碼基因進行的，而基于tRNA和rRNA數(shù)據(jù)的研究較少，因此基于tRNA以及rRNA對蝽科線粒體基因組學進行比較分析是有必要的.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以半翅目蝽科昆蟲為研究對象，選取NCBI網站已公布的蝽科4亞科26個物種的線粒體全基因組序列，對其tRNA和rRNA序列特征、遺傳距離和二級結構進行比較分析，同時基于校正后的tRNA串聯(lián)數(shù)據(jù)集和2個rRNA串聯(lián)數(shù)據(jù)集，采用貝葉斯法對26種蝽科昆蟲進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，探討蝽科4亞科間的系統(tǒng)發(fā)育關系，并對tRNA和rRNA序列在蝽科系統(tǒng)發(fā)育關系構建中的有效性進行驗證，補充tRNA和rRNA在蝽科線粒體基因組研究中的不足.

表1 本研究所選物種Table 1 List of species used in this study

以半翅目蝽科4亞科26個物種為研究對象，覆蓋了中國蝽科的所有亞科，所使用的序列從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫下載(表1).

1.2 分析方法

將獲得的26個物種的線粒體全基因序列，在Geneious Prime 2022.1[14]中提取22個tRNA和2個rRNA，并通過MITOS在線網站(http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py/)推測其二級結構[15].通過Sequencematrix分別將22個tRNA和2個rRNA序列串聯(lián)，利用MEGA11.0[16]計算tRNA和rRNA的堿基長度、堿基組成、AT含量，AT偏斜和GC偏斜(AT-skew=[A-T]/[A+T]和GC-skew=[G-C]/[G+C])[17]，同時計算其基因保守位點、變異位點、簡約信息位點和單一位點，基于Kimura-2-Parameter(K-2-P)計算亞科間和蝽亞科屬間的遺傳距離，并且用Muscle對每個同源基因進行比對，基于比對結果在二級結構中標注26個物種的保守位點.

選取蝽科26個物種的22個tRNA和2個rRNA序列串聯(lián)數(shù)據(jù)集，以盾蝽科2個物種作為外群構建系統(tǒng)發(fā)育樹.使用PartitionFinder v.2.1.1[18]計算每個數(shù)據(jù)集的替代模型后，在MrBayes v.3.2.6[19]中，使用貝葉斯推斷方法以每個數(shù)據(jù)集的最優(yōu)替代模型進行系統(tǒng)發(fā)育分析.其中，4個獨立的馬爾可夫鏈(1條冷鏈，3條熱鏈)運行10 000 000代，當分裂頻率的平均標準偏差值低于0.01時停止，然后“burnin”25%的樣本.

2 結果與分析

2.1 tRNA序列特征及遺傳距離

蝽科26個物種的22個線粒體tRNA長度為60～80 bp，將比對后的22個同源tRNA串聯(lián)，檢測到866個保守位點、738個變異位點、504個簡約信息位點和225個單一位點，其中保守位點所占的比例為51.8%.串聯(lián)后的22個tRNA長度為1 454～1 502 bp，AT含量為74.7%～78.6%，平均含量為77.0%，反映了堿基組成具有明顯的AT偏斜.26個物種的tRNA均表現(xiàn)為GC正偏斜，除擬綠蝽(C.ubica)為AT負偏斜外，其余均為AT正偏斜(表2).

表2 蝽科22個tRNA核苷酸組成分析Table 2 Nucleotide composition analysis of 22 tRNAs in Pentatomidae

蝽科26個物種的基因排列方式較為保守，均和假定的祖先昆蟲亞庫巴果蠅(Drosophilayakuba)線粒體基因組的基因順序一致，未發(fā)生重排[20].蝽科昆蟲線粒體tRNA序列的保守性也反映在二級結構上，除tRNA-S1由于二氫尿嘧啶臂(dihydrouracil stem，DHU)莖缺失無法形成典型的莖環(huán)結構外，所有的tRNA都可折疊為典型的三葉草結構.22個tRNA二級結構均出現(xiàn)非經典的G-U配對，如歐亞蠋蝽(Armacustos)的8個tRNA(tRNA-C、tRNA-D、tRNA-G、tRNA-H、tRNA-I、tRNA-L1、tRNA-P、tRNA-V)，除此之外還出現(xiàn)U-U和A-C配對，其中G-U配對對于維系tRNA二級結構的穩(wěn)定性起著非常重要的作用(圖1).

紅色圓圈代表在蝽科26個物種中堿基100%保守.圖1 蝽科22個tRNA的二級結構Fig.1 Secondary structure of the 22 tRNAs identified in the mitochondrial genome of Pentatomidae

蝽科26個物種的22個tRNA的一級序列和同源tRNA的二級結構均展現(xiàn)了不同的保守性.在22個tRNA中，tRNA-K保守性最高，而tRNA-Q的保守性最低.在同源tRNA的二級結構中，莖區(qū)相對于環(huán)區(qū)來說表現(xiàn)出較高的保守性，而環(huán)中除了反密碼子環(huán)相對保守外，其余環(huán)的堿基變異程度都較高.tRNA莖中，DHU表現(xiàn)出極高的保守性，長度為2～4 bp，26個物種的22個tRNA中超過1個堿基不保守的只有tRNA-S2；反密碼子臂表現(xiàn)出高的保守性，25個物種的tRNA-S1的反密碼子臂的長度由典型的5 bp變?yōu)? bp，而谷蝽(Gonopsisaffinis)變?yōu)? bp，26個物種的tRNA-M反密碼子臂長度為4 bp，剩余的26個物種的20個tRNA反密碼子臂長度均為5 bp，全部堿基保守的有tRNA-A、tRNA-C、tRNA-K、tRNA-L2、tRNA-P、tRNA-W、tRNA-Y.氨基酸接受臂保守性較低，長度均為7 bp，全部堿基保守的有tRNA-C、tRNA-I、tRNA-K、tRNA-Y.假尿嘧啶臂(TψC臂)保守性極低，長度變異較大，沒有全部堿基保守的tRNA.tRNA的4個環(huán)中只有反密碼子環(huán)保守性高，長度均為7 bp，超過2個堿基不保守的只有tRNA-V.

表3 蝽科4亞科間的22個tRNA(下三角)和2個rRNA基因(上三角)K-2-P遺傳距離Table 3 K-2-P parameter distances of 22 tRNAs (lower triangle) and two rRNA genes (upper triangle) among four subfamilies of Pentatomidae

基于22個tRNA串聯(lián)數(shù)據(jù)集計算蝽科4亞科之間和蝽亞科11個屬之間的遺傳距離，結果表明4個亞科之間的遺傳距離為0.113～0.140(表3)，舌蝽亞科和蝽亞科距離最小，益蝽亞科與短喙蝽亞科距離最大.蝽亞科11個屬之間的遺傳距離為0.082～0.160(表4)，二星蝽屬和輝蝽屬遺傳距離最小，綠蝽屬和斑須蝽屬遺傳距離最大.

2.2 rRNA序列特征及遺傳距離

蝽科26個物種的12S rRNA序列長度為795～829 bp，其中基因序列長度最長的是褐真蝽(Pentatomasemiannulata)，最短的是紫藍曼蝽(Menidaviolacea)和凹肩輝蝽(Carbulasinica).12S rRNA序列中，檢測到370個保守位點、528個可變位點、375個簡約信息位點和143個單一位點.16S rRNA序列長度為1 254～1 364 bp，其中基因序列長度最長的是斑須蝽(Dolycorisbaccarum)，最短的是綠喙蝽(Dinorhynchusdybowskyi).16S rRNA序列中，檢測到610個保守位點、803個可變位點、572個簡約信息位點和202個單一位點.2個rRNA的串聯(lián)長度為2 050～2 174 bp，AT含量為75.7%～80.0%，平均含量為78.3%，說明堿基組成具有明顯的AT偏斜，26個物種堿基A和T含量均高于G和C，所有物種T含量均高于A，G含量均高于C，表現(xiàn)出AT負偏斜和GC正偏斜(表5).

表4 蝽亞科11個屬間的22個tRNA(下三角)和2個rRNA基因(上三角)K-2-P遺傳距離Table 4 K-2-P parameter distances of 22 tRNAs (lower triangle) and two rRNA genes (upper triangle) among 11 genera of Pentatominae

表5 蝽科2個rRNA核苷酸組成分析Table 5 Nucleotide composition analysis of two rRNAs in Pentatomidae

選取歐亞蠋蝽繪制其12S rRNA和16S rRNA的二級結構，并對其保守位點進行了標注.12S rRNA二級結構包括3個結構域和26個莖環(huán)結構(圖2)，蝽科H511、H769、H921、H1399序列和二級結構較為保守，相比結構域Ⅰ和Ⅱ，結構域Ⅲ更保守.16S rRNA二級結構包含6個結構域(節(jié)肢動物普遍缺少結構域Ⅲ)和44個莖環(huán)結構(圖3)，蝽科H563、H1775、H1906、H1925、H2507、H2547的序列和二級結構較為保守，16S rRNA的結構域Ⅳ和Ⅴ比結構域Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ更保守.rRNA的同源性更多的體現(xiàn)在二級結構保守性上，而不是具有某段保守的序列.

紅色圓圈代表在蝽科26個物種中堿基100%保守.圖2 蝽科12S rRNA基因二級結構圖Fig.2 Secondary structure of 12S rRNA gene of Pentatomidae

紅色圓圈代表在蝽科26個物種中堿基100%保守.圖3 蝽科16S rRNA基因二級結構圖Fig.3 Secondary structure of 16S rRNA gene of Pentatomidae

分別對蝽科4亞科和蝽亞科11個屬的2個rRNA串聯(lián)數(shù)據(jù)集計算遺傳距離，結果表明，4個亞科之間的遺傳距離為0.158～0.178(表4)，舌蝽亞科和蝽亞科距離最小，益蝽亞科和短喙蝽亞科距離最大.蝽亞科內11個屬之間的遺傳距離為0.120～0.209(表5)，二星蝽屬和輝蝽屬遺傳距離最小，斑須蝽屬和輝蝽屬遺傳距離最大.

2.3 系統(tǒng)發(fā)育

以22個tRNA(圖4)串聯(lián)數(shù)據(jù)集基于貝葉斯推斷法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹拓撲結構與2個rRNA(圖5)的基本一致.結果均表明：益蝽亞科各個屬聚合在一起形成嚴格的單系群，但內部屬之間的姐妹群關系未得到解析.短喙蝽亞科是嚴格的單系群，亞科中的谷蝽和皺臭蝽(Dalsirascabrata)形成姐妹群后，又與蝽亞科中莽蝽屬聚合在一起；蝽亞科中的各個屬內種間的個體聚合在一起，二星蝽屬和輝蝽屬形成姐妹群，擬綠蝽屬與綠蝽屬聚合在一起后又與碧蝽屬以高置信度形成姐妹群，曼蝽屬、真蝽屬、斑須蝽屬和珀蝽屬由于選取物種的數(shù)目太少而單獨成一支；舌蝽亞科中的赤條蝽(Graphosomarubrolineatum)和稻黑蝽(Scotinopharalurida)并未聚合在一起，而是和蝽亞科中的物種聚集在一起.值得注意的是，在rRNA數(shù)據(jù)集構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，益蝽亞科和蝽亞科中的曼蝽屬形成姐妹群.

圖4 基于22個tRNA 基因構建的26個蝽科物種的BI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of 26 species inferred from 22 tRNA genes constructed using BI analysis

3 討論與結論

在蝽科昆蟲系統(tǒng)發(fā)育研究中，目前應用最為廣泛的是PCG基因的核苷酸序列及氨基酸序列，而rRNA和tRNA大多是與PCG基因組合用于系統(tǒng)發(fā)育關系的分析.近年來，12S rRNA和16S rRNA被作為分子標記用于系統(tǒng)發(fā)育關系的推斷，tRNA也逐漸被重視且用于系統(tǒng)發(fā)育樹的構建[10-13].

線粒體基因的核苷酸組成和取代偏差會影響系統(tǒng)發(fā)育組學分析的最終結果，所以，堿基組成的偏向性對研究線粒體基因組復制轉錄的機理和系統(tǒng)發(fā)育關系具有重要意義[13].堿基組成的偏好性一般是由于4種堿基不對稱的突變和選擇壓力，主要來自基因的復制和轉錄.有研究表明，CG含量的變異導致了基因間不同的進化模式，GC之間的相對含量與復制起點的方向相關，而AT之間的相對含量因復制起點方向、基因方向以及密碼子位置的變化而改變[21-22].本研究對蝽科26個物種的tRNA的堿基組成分析表明，tRNA在堿基組成上具有明顯的AT偏斜.26個物種tRNA均表現(xiàn)為GC正偏斜，除了擬綠蝽表現(xiàn)為AT負偏斜外，其余均為AT正偏斜.對rRNA的堿基組成分析發(fā)現(xiàn)rRNA堿基組成同樣具有明顯的AT偏斜，平均含量為78.3%，略高于tRNA的平均含量，且26個物種rRNA均表現(xiàn)為AT負偏斜和GC正偏斜，這與大多數(shù)昆蟲線粒體基因組呈現(xiàn)的AT正偏斜和GC負偏斜不一致[23].

圖5 基于2個rRNA 基因構建的26個蝽科物種的BI系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of 26 species inferred from two tRNA genes constructed using BI analysis

tRNA和rRNA的遺傳距離結果均表明，蝽科4亞科間舌蝽亞科和蝽亞科親緣關系最近，益蝽亞科和短喙蝽亞科親緣關系最遠，這與徐志強[24]基于28個新征對蝽總科進行支序分析的結果一致，同時，蝽亞科11個屬間二星蝽屬和輝蝽屬親緣關系最近，這與形態(tài)上兩屬為近緣屬的研究結果一致，此結果也支持2個屬歸于二星蝽族的觀點[25].之前的研究表明，蝽次目73個物種cox1基因的屬間遺傳距離為0.118～0.244[26]，本研究基于rRNA對蝽亞科屬間遺傳距離的計算結果(0.120～0.209)與之接近，而基于tRNA的結果偏低(0.082～0.160)，這表明在選擇進化中tRNA的變異較慢，研究結果證明，tRNA和rRNA均可以作為解析蝽科亞科間和屬間親緣關系的分子標記.

本研究通過對tRNA和rRNA序列以及二級結構比較分析得出，不同物種的線粒體同源基因、不同線粒體RNA基因及同一線粒體RNA基因不同區(qū)域內的核苷酸變異均存在顯著多態(tài)性.(1)不同物種的線粒體同源tRNA和rRNA不僅在核苷酸組成上存在差異，在二級結構上莖區(qū)和環(huán)區(qū)的長度也存在差異，如橫紋菜蝽的tRNA-V的DHU臂缺失，而歐亞蠋蝽的為2 bp.(2)相同物種中，tRNA序列比rRNA序列更加保守，tRNA序列的保守率為51.8%，rRNA序列的保守率為40%.在22個tRNA中，tRNA-K的保守性最高，保守位點占核苷酸總數(shù)的75%，而tRNA-Q的保守性最低，保守位點占核苷酸總數(shù)的35%.在2個rRNA中，16S rRNA序列比12S rRNA序列保守，16S rRNA序列的保守率為40.9%，12S rRNA序列的保守率為39.3%，表明tRNA基因適用于高階元的分類研究，而rRNA基因可以用于解析近緣屬的系統(tǒng)發(fā)育關系.(3)同一tRNA中，莖區(qū)由于在進化選擇中需要維持其二級結構而比環(huán)區(qū)保守性更高，且環(huán)區(qū)中的反密碼子環(huán)由于要行使翻譯功能較為保守.同一12S rRNA結構域Ⅲ比結構域Ⅰ和Ⅱ更保守，16S rRNA的結構域Ⅳ和Ⅴ比結構域Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ更保守.同源RNA基因不同的核苷酸組成和相同或近似的二級結構，如16S rRNA的H1196在26個物種中沒有相似的序列，但卻有著相似的二級結構，這與陳國忠等[27]提出的RNA結構構成上的生物學意義要大于它的序列組成的結論一致.

基于tRNA和rRNA串聯(lián)數(shù)據(jù)集構建的BI系統(tǒng)發(fā)育樹結果基本一致，均表明短喙蝽亞科、益蝽亞科為單系群，這與Xu et al[28]的研究結果一致，證明了tRNA和rRNA在蝽科系統(tǒng)發(fā)育研究中的有效性.蝽亞科的單系性在許多研究中都受到了廣泛的質疑[29-30]，本研究的2個數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育結果也表明，蝽亞科不是單系群.基于2個數(shù)據(jù)集的系統(tǒng)發(fā)育樹結果均表明，舌蝽亞科不是單系群，這與基于核基因和線粒體基因的系統(tǒng)發(fā)育結果一致[29].其中條蝽屬的分類地位極其模糊：Li et al[25]通過分子數(shù)據(jù)證明條蝽屬隸屬于蝽亞科；而Rider et al[31]根據(jù)形態(tài)特征把條蝽屬劃歸為舌蝽亞科；本研究基于tRNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，條蝽屬是蝽科最早分化出來的單獨一支，而基于rRNA構建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，條蝽屬混合在蝽亞科中，這與Wang et al[32]的研究結果一致，表明舌蝽亞科可能不是有效的分類單元，后續(xù)仍需要對更多舌蝽亞科的物種序列進行分析.基于2個數(shù)據(jù)集構建的系統(tǒng)發(fā)育樹雖然都無法準確解析蝽科4亞科間的姐妹群關系，但是，系統(tǒng)發(fā)育結果和部分基于13個PCGs的系統(tǒng)發(fā)育樹結果一致，這可能是因為蝽亞科內部的系統(tǒng)發(fā)育關系較為混亂，也與數(shù)據(jù)庫有限的物種有關[29].

總之，本研究通過對蝽科26個物種的tRNA和rRNA的比較分析發(fā)現(xiàn)，這兩類基因在物種的親緣關系及系統(tǒng)進化樹分析上具有應用價值，在對數(shù)據(jù)進行分析時不應該只考慮蛋白編碼基因，應充分利用各種數(shù)據(jù)為昆蟲的系統(tǒng)學研究提供更多的有效證據(jù).