吳 克，馮 航，王 娟，楊增岐

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringens)是桿菌科、梭菌屬的一種革蘭陽性厭氧菌[1]，可廣泛存在于人類和動(dòng)物腸道以及食物、河流和土壤等多種自然環(huán)境中[2]。作為一種常見的條件性致病菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌因能夠?qū)е露喾N疾病、造成較大畜牧經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生安全危害而被廣泛關(guān)注[3]。正常條件下，產(chǎn)氣莢膜梭菌在人和動(dòng)物腸道中存在但并不致病，但當(dāng)外界環(huán)境突變時(shí)其能夠迅速繁殖并產(chǎn)生20余種蛋白性毒素并侵襲機(jī)體，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氣性壞疽和多種胃腸道疾病[4]。根據(jù)對(duì)CPA、CPB、ETX、ITX、CPE和NetB 6種毒素的產(chǎn)生能力，產(chǎn)氣莢膜梭菌被分為A～G 7個(gè)毒素型[5]。

D型產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起山羊、綿羊和牛等多種動(dòng)物的腸毒血癥，造成腹瀉和猝死等多種癥狀，對(duì)反芻動(dòng)物的規(guī)?；曫B(yǎng)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[6]。D型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的毒素ETX是由位于質(zhì)粒上的毒素基因etx編碼、分子量大小為33 ku的穿孔毒素[7]。ETX被認(rèn)為是毒性最強(qiáng)的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，毒性僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素[8]，能夠作用于腸道、腎和肝多種器官，導(dǎo)致包括猝死在內(nèi)的多種癥狀[9]；并且ETX還能夠和神經(jīng)細(xì)胞結(jié)合，造成神經(jīng)遞質(zhì)異常釋放從而導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)疾病[10]。此外，產(chǎn)氣莢膜梭菌能夠引起人類食源性感染[11]，據(jù)相關(guān)機(jī)構(gòu)統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的食物中毒在美國和韓國食源性感染中排名第2位，在英國和法國則排在第3位[12]。

關(guān)中奶山羊是由薩能奶山羊和陜西本地山羊雜交后獲得的新品種，是我國奶山羊中的優(yōu)良品種。本試驗(yàn)對(duì)采集自腹瀉關(guān)中奶山羊的肛門拭子進(jìn)行了產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定并對(duì)分離到的5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定分析。本研究系我國首次對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組進(jìn)行研究，對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌疾病的防控及D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組的后續(xù)研究具有重要參考意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 肛門拭子樣品于2021年下旬采集自陜西省富平縣某規(guī)模化關(guān)中奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)6只精神沉郁、伴有不同程度腹瀉的奶山羊。樣品采集后置于運(yùn)輸培養(yǎng)基并保存于4 ℃采樣箱，12 h內(nèi)送回西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

1.1.2 主要試劑儀器 細(xì)菌DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×Taq PCR StarMix為北京Genstar生物科技有限公司產(chǎn)品；胰胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸(TSC)培養(yǎng)基、厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、CAMHB肉湯和普通營養(yǎng)瓊脂購自青島海博生物技術(shù)有限公司；厭氧培養(yǎng)箱為上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌分離鑒定 將所采集的肛門拭子接種于5 mL厭氧肉肝湯培養(yǎng)基，37 ℃溫箱靜置培養(yǎng)18 h增菌。培養(yǎng)完成后，取1 mL菌液3 000 r·min-1離心2 min，并劃線接種于TSC培養(yǎng)基，置于厭氧培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取TSC培養(yǎng)基上黑色菌落，接種于5%綿羊血平板培養(yǎng)基，進(jìn)行進(jìn)一步分離純化；挑取血平板上帶有雙重溶血環(huán)的單菌落，生理鹽水稀釋煮菌后，PCR擴(kuò)增分離菌株16S rRNA序列，并送至西安擎科澤西生物技術(shù)有限公司序列測(cè)定。

1.2.2 分離菌株毒素分型 毒素基因cpa、cpb、etx、itx、cpe、netB的特異引物見表1[5]，由西安擎科澤西生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。水煮法提取菌株DNA，毒素基因cpa、cpb、etx、itx采用多重PCR, 50 μL體系：25 μL 2×Mix預(yù)混液，cpa、cpb、etx、itx毒素上下游引物各1 μL， DNA模板1 μL,雙蒸水補(bǔ)至50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，51.6 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。cpe、netB采用單重PCR，20 μL體系：10 μL 2×Mix預(yù)混液，上下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL，雙蒸水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min, 30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

表1 毒素基因PCR引物

1.2.3 分離菌株全基因組序列測(cè)定及分析 將分離菌株接種于厭氧肉肝湯中過夜培養(yǎng)，無菌條件下取過夜培養(yǎng)菌液3 mL，25 ℃ 12 000 r·min-1離心2 min，按照細(xì)菌DNA提取試劑盒流程提取分離菌株DNA，并送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因組序列測(cè)定。分離菌株基因組序列注釋在Rapid Annotations using Subsystem Technology (RAST) (http://rast.nmpdr.org/)上完成；MLST分型通過PubMLST (https://pubmlst.org/) 完成，耐藥基因、毒素基因和插入序列分別通過ResFinder 4.1 (https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)，ISfinder (https://www-is.biotoul.fr/)，Virulence Factor Database (http://www.mgc.ac.cn/VFs/) 和本地blast進(jìn)行檢測(cè)?；蛐蛄行畔⒑突颦h(huán)境的對(duì)比分析通過Snapgene 4.2.4和Easyfig 2.1實(shí)現(xiàn)。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定及毒素分型

分離菌株在37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)24 h后，在TSC平板上為中心黑色邊緣半透明中等大小菌落(圖1A)，5%綿羊血平板培養(yǎng)基上為帶有雙重溶血環(huán)的半透明光滑較小菌落(圖1B)。PCR擴(kuò)增分離菌株16S rRNA序列后比對(duì)顯示，其與參考產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株ATCC13124的16S rRNA序列相似度均達(dá)99%以上，綜合判定分離菌株均為產(chǎn)氣莢膜梭菌。毒素分型顯示，5株產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株均為D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(cpa+，etx+)，根據(jù)菌株分離年份和毒素型將分離到的5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌命名21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4和21-D-5；其中，菌株21-D-5中檢測(cè)食源性致病毒素基因cpe。

圖1 分離菌株21-D-1在TSC平板(A)和5%綿羊血平板(B)上菌落形態(tài)觀察

2.2 分離菌株基因組信息

5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株基因組序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(Bioproject：PRJNA811729)；分離菌株的基因組大小為3 403 167～3 570 770 bp，平均每個(gè)基因組中含有3 298個(gè)基因編碼區(qū)(CDS)，且基因組序列GC含量穩(wěn)定于28.0%～28.1%(表2)。多位點(diǎn)序列分析(MLST)顯示，21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4和21-D-5屬于3個(gè)不同的ST型，21-D-1/21-D-2、21-D-3/21-D-4和21-D-5的等位基因組合分別為129-5-1-1-8-19-4-1、37-134-81-34-8-19-1-8和153-94-86-11-90-7-2-140。5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株中共檢測(cè)到15種毒素基因，其中，cpa、etx、pfoA、colA、cloSI、nanH、nagK、nagI、nagJ、nanI、nanJ、cpb2和nagH在5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌中均被檢測(cè)到，nagL在21-D-1、21-D-2和21-D-5中檢測(cè)到，而cpe僅在21-D-5中被檢測(cè)到(表3)。除毒素基因外，分離菌株的基因組序列中還檢測(cè)到9種耐藥基因，包括四環(huán)素類耐藥基因tetA(P)和tetB(P)、氨基糖苷類耐藥基因aac(6′)-aph(2″)、林可霉素抗性基因lnu(P)； 大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因erm(A)、erm(B)和erm(Q)、氟苯尼考耐藥基因fexA和惡唑烷酮耐藥基因optrA, 并且這9中耐藥基因均在21-D-5的基因組中被檢測(cè)到(表4)。

表2 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基分離株基因組信息

表3 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株毒素基因匯總

表4 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株耐藥基因檢測(cè)

2.3 毒素基因etx序列保守性及基因組單核苷酸多態(tài)性分析

選取NCBI數(shù)據(jù)庫中B型產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC3626)和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(NCTC8503)etx序列作為參考對(duì)本研究中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素基因etx序列的保守性進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示(表5)，毒素基因etx序列在本研究新分離到的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌和參考序列之間保守性較強(qiáng)(99.8%～100%)，僅在第51位核苷酸(由C-G變?yōu)镚-C)和726位核苷酸(由G-C變?yōu)锳-T)處存在差異，且不影響對(duì)應(yīng)位置絲氨酸的編碼。

表5 分離菌株毒素基因etx序列與參考etx序列對(duì)比

選取NCBI數(shù)據(jù)庫中D型產(chǎn)氣莢膜梭菌NCTC8503 (NCBI BioSample: SAMEA3879480), JGS1721 (NCBI BioSample: SAMN02436277), IQ1 (NCBI BioSample: SAMEA5818795)基因組序列與本研究新分離的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析。結(jié)果表明，21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4之間的SNPs差異很小(< 25)，而21-D-1/21-D-2，21-D-3/21-D-4與其他菌株之間的SNPs則在16 440～21 943不等。依照SNPs構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，21-D-1和21-D-2，21-D-3和21-D-4之間的進(jìn)化關(guān)系最為相近，其次為21-D-5，最后為分離自其他國家的參考菌株NCTC8503、JGS1721和IQ1(圖2)。

圖2 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌分離菌株及參考株之間SNPs差異及進(jìn)化關(guān)系

2.4 毒素基因etx及耐藥基因optrA基因環(huán)境分析

選取SNPs分析中使用的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株與本研究分離到的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌對(duì)毒素基因etx的基因環(huán)境進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，etx基因環(huán)境在菌株21-D-1、21-D-2、21-D-3、21-D-4、NCTC8503、JGS1721和IQ1中一致，均為移動(dòng)元件-插入序列IS1151-etx-轉(zhuǎn)座酶編碼基因-插入序列ISCp1；但在分離株21-D-5中etx的下游額外檢測(cè)到了插入序列IS1151、毒素基因cpe和一些假定蛋白編碼基因hp；并且序列分析顯示，分離株21-D-5中etx上下游插入序列IS1151與21-D-1～21-D-4中etx上游插入序列IS1151序列相似度較低，為92%～93%(圖3)。

圖3 D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株及參考D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株etx基因環(huán)境分析

對(duì)2020年和2022年我國報(bào)道的攜帶有噁唑烷酮類耐藥基因optrA的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株(2C45，QHY-2)[13-14]，與本研究菌株21-D-5進(jìn)行optrA基因環(huán)境分析顯示，optrA基因環(huán)境在產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株2C45、QHY-2和21-D-5之間高度相似，均為ISVlu1-IS1216-erm(A)-optrA-IS1216-fexA-ISVlu1(圖4)；表明攜帶耐藥基因erm(A)、optrA和fexA的DNA區(qū)段可能作為一個(gè)可移動(dòng)元件在產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株間進(jìn)行傳播。

圖4 菌株21-D-5和參考產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株optrA基因環(huán)境

3 討 論

關(guān)中奶山羊?yàn)殛兾麝P(guān)中地區(qū)的乳用型山羊，具有適應(yīng)性廣、耐粗飼、繁殖率高、適于放牧或舍飼、乳用性能好等優(yōu)點(diǎn)。D型產(chǎn)氣莢膜梭菌與多種動(dòng)物的胃腸道疾病密切相關(guān)，尤其是綿羊和山羊的腸毒血癥。本研究自6份腹瀉關(guān)中奶山羊肛拭子樣品中分離到5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，表明該場(chǎng)區(qū)關(guān)中奶山羊正在遭到D型產(chǎn)氣莢膜梭菌侵襲。結(jié)合產(chǎn)氣莢膜梭菌分離情況和羊伴有精神沉郁和腹瀉癥狀、可初步判定此次奶山羊腹瀉與D型產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)；但由于未檢測(cè)糞便中是否含有毒素ETX，無法確證關(guān)中奶山羊的腹瀉是由分離到的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株引起。

全基因組序列測(cè)定分析能夠從基因水平闡述病原菌毒性和耐藥性等特征，對(duì)細(xì)菌性疾病的精準(zhǔn)防控和治療具有參考意義。全基因組序列測(cè)定顯示分離的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組大小、編碼基因數(shù)量和GC含量等特征穩(wěn)定；并且分離株21-D-1/21-D-2和21-D-3/21-D-4基因組之間SNPs差異極小，表明分離株21-D-1/21-D-2和21-D-3/21-D-4可能分別屬于兩株不同的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株、D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株可能在關(guān)中奶山羊之間具有一定程度的傳播。

不同菌株間etx序列及基因環(huán)境比對(duì)顯示，該基因在不同D型產(chǎn)氣莢膜梭菌中的核苷酸序列相似度極高、擁有完全一致的氨基酸編碼序列；且在不同D型產(chǎn)氣莢膜梭菌中的基因環(huán)境基本一致，一定程度表明不同D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株產(chǎn)生的ETX毒性相近。插入序列(ISs)位于復(fù)合型轉(zhuǎn)座子的末端，能夠?qū)⒒蚪M片段從供體細(xì)菌的基因組切割并將其連接到受體細(xì)菌的基因組當(dāng)中，從而造成包括耐藥基因和毒素基因在內(nèi)的多種基因的傳播[15]。本研究在毒素基因etx的上下游分別發(fā)現(xiàn)插入序列IS1151和ISCp1，表明etx可能通過IS1151和ISCp1的介導(dǎo)進(jìn)行轉(zhuǎn)移。除毒素基因etx外，分離株21-D-5中還檢測(cè)到食源性致病毒素基因cpe，基因環(huán)境分析顯示，其位于毒素基因etx下游，表明在菌株21-D-5中毒素基因etx和cpe能夠位于同一毒素質(zhì)粒。

動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的增強(qiáng)不僅給畜牧經(jīng)濟(jì)效益帶來了較大的危害，對(duì)人類健康也具有一定威脅[16]。本研究中，耐藥基因optrA和其他多種耐藥基因均在產(chǎn)氣莢膜梭菌分離株21-D-5中被檢測(cè)到，耐藥基因optrA基因通過編碼一種ATP結(jié)合蛋白導(dǎo)致噁唑烷酮類抗生素的耐藥性[14]。作為一類新型非獸用抗生素，噁唑烷酮類耐藥基因在關(guān)中奶山羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌中的出現(xiàn)一定程度揭示了耐藥基因optrA在人和動(dòng)物源細(xì)菌之間的傳播。通過對(duì)optrA基因環(huán)境的進(jìn)一步分析，插入序列IS1216位于erm(A)-optrA的兩側(cè)，且插入序列ISVlu1位于erm(A)-optrA-fexA的兩側(cè)；進(jìn)一步佐證了耐藥基因optrA的傳播，并揭示了optrA在不同菌株間可能以IS1216-erm(A)-optrA-IS1216和ISVlu1-IS1216-erm(A)-optrA-IS1216-fexA-ISVlu1這兩種形式進(jìn)行轉(zhuǎn)移。合理使用抗生素是減少耐藥菌數(shù)量、防止相應(yīng)耐藥基因傳播的重要方法，但多種耐藥基因的共同傳播會(huì)造成多重耐藥，對(duì)抗生素使用帶來挑戰(zhàn)。

本研究為國內(nèi)首次對(duì)D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組進(jìn)行序列測(cè)定分析，在描述D型產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組特征的基礎(chǔ)上，通過對(duì)相應(yīng)毒素基因及耐藥基因的序列分析在基因水平揭示了其特征和傳播的可能性。除此之外，該研究發(fā)現(xiàn)了同時(shí)攜帶腸毒血癥關(guān)鍵毒素基因etx、人類食源性感染關(guān)鍵毒素基因cpe和多種耐藥基因的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株21-D-5。毒素基因cpe在引起人類食物中毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株中普遍存在，達(dá)96.3%(105/109)，與人類食源性疾病密切相關(guān)[17]。像21-D-5這種攜帶有多種重要毒素和耐藥基因的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株，其流行無疑會(huì)對(duì)公共衛(wèi)生安全造成較大的威脅；在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)規(guī)范對(duì)抗生素的使用、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理及環(huán)境消殺，以防止產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥性的增強(qiáng)及其在動(dòng)物和人類之間的傳播致病。

4 結(jié) 論

自腹瀉奶山羊肛門拭子分離到5株D型產(chǎn)氣莢膜梭菌(21-D-1～21-D-5)，全基因組序列測(cè)定顯示，5株菌基因組大小、GC含量和基因數(shù)量穩(wěn)定；單核苷酸多態(tài)性(SNPs)分析顯示，21-D-1和21-D-2以及21-D-3和21-D-4大概率屬于相同的產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株。毒素基因檢測(cè)表明，其均為攜帶etx的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌，且發(fā)現(xiàn)21-D-5同時(shí)攜帶腸毒血癥關(guān)鍵毒素基因etx、人類食源性感染關(guān)鍵毒素基因cpe和多種耐藥基因。