陳柯君，葉茜，方圣

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科，重慶 400016)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮膚惡性程度最高的一種皮膚腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，雖然CMM在皮膚腫瘤中僅占5%，但其病死率占皮膚腫瘤的70%[1]。目前CMM的治療方法包括早期手術(shù)擴(kuò)大切除、術(shù)后干擾素注射、新型靶向治療、免疫治療等，但部分黑色素瘤仍會出現(xiàn)轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)，特別是對于已轉(zhuǎn)移的黑色素瘤，其預(yù)后極差。而熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)作為一種分子伴侶，在維持蛋白質(zhì)的正確表達(dá)、細(xì)胞生長發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。其可以促進(jìn)受控的細(xì)胞生長，避免凋亡，提高細(xì)胞存活率，并促進(jìn)血管生成，而這種功能對于許多惡性腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移不可或缺[2]。既往研究表明，在多種腫瘤(如結(jié)直腸癌、肺癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌)中，HSPs的表達(dá)水平升高，大多數(shù)情況下表達(dá)水平升高預(yù)示預(yù)后較差[3]。由于HSPs與腫瘤關(guān)系密切，與HSPs相關(guān)的腫瘤疾病可稱為“伴侶病”。既往有文獻(xiàn)報道，與良性色素痣相比，CMM中HSP70/90/105表達(dá)水平明顯升高[4-6]。因此，HSPs可能成為鑒別良惡性腫瘤的新型標(biāo)志物，也可能作為新型的腫瘤治療方法。現(xiàn)就HSPs與CMM研究進(jìn)展予以綜述。

1 HSPs的生物學(xué)功能

HSPs在生物界普遍存在，從原核生物到真核生物均有HSPs的表達(dá)。作為一種急性反應(yīng)蛋白，在正常情況下，其表達(dá)水平較低，但當(dāng)機(jī)體受到高溫、缺氧、病毒、感染、紫外線照射等刺激時，會合成HSPs來保護(hù)機(jī)體，提高細(xì)胞的應(yīng)激能力。伴侶蛋白不僅存在于組織，也可作為細(xì)胞分泌的產(chǎn)物存在于體液，且細(xì)胞內(nèi)外均有HSPs的表達(dá)[7]。HSPs主要協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊和再折疊，降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)，同時也參與體外作用，如參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化、基因表達(dá)、DNA復(fù)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、程序性細(xì)胞死亡、細(xì)胞衰老等。依據(jù)分子量不同，HSPs可以分為5類，分別為小分子HSPs、HSP40、HSP70、HSP90及HSP105/110，其中HSP105/110是一種主要的哺乳動物HSPs，是HSP70家族的一個不同亞群[3]。

HSPs不僅在正常細(xì)胞中發(fā)揮作用，也參與腫瘤細(xì)胞的存活、增殖及轉(zhuǎn)移，其發(fā)病機(jī)制主要包括以下幾個方面：①腫瘤的無限增殖為其主要特性，而控制無限增殖的許多信號蛋白均為HSPs的客戶蛋白，因此HSPs的增加是腫瘤無限增殖的信號通路的基礎(chǔ)。另外，HSP90可抑制腫瘤細(xì)胞中端粒酶的活性，從而阻止端粒的縮減[2,8]。②由于腫瘤細(xì)胞增殖速度較快，蛋白需求量大，不可避免出現(xiàn)錯誤折疊，因此腫瘤細(xì)胞劫持了HSPs的保護(hù)功能來滿足腫瘤折疊需求的增加。③HSPs可協(xié)助腫瘤逃避細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡，如HSP27通過抑制凋亡蛋白Bid，HSP70通過抑制線粒體膜上的Bcl-2相關(guān)蛋白，從而抑制凋亡前蛋白的釋放。在線粒體的下游，HSP27通過與細(xì)胞色素C結(jié)合，而HSP70和HSP90與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合，從而阻止胱天蛋白酶的激活和凋亡。④HSPs也可促進(jìn)腫瘤血管的生成，如HSP27不僅可與血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)結(jié)合促進(jìn)腫瘤血管生成，還可誘導(dǎo)缺氧因子生成，加快腫瘤毛細(xì)血管網(wǎng)的生長[2]。⑤HSPs可促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。作為客戶蛋白，HSP90可協(xié)助黏著斑激酶、整合素連接激酶和酪氨酸受體激酶ErbB2及原癌基因MET的合成，從而使腫瘤更易轉(zhuǎn)移[2]。因此，HSPs與腫瘤的關(guān)系十分密切，且這一類伴侶蛋白也可成為病因或致病因素，形成致病性蛋白。研究表明，HSPs的過表達(dá)與多種腫瘤有關(guān)，包括前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、食管鱗癌、腎細(xì)胞癌等[2,9]。目前，HSPs抑制劑是研究熱點，未來可根據(jù)HSPs相關(guān)機(jī)制研究，進(jìn)一步研制出相關(guān)藥物用于腫瘤的治療。

HSPs也具有免疫原性，其可通過活化自然殺傷細(xì)胞、激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)等，引發(fā)固有免疫反應(yīng)。另外，HSPs多肽復(fù)合物也可通過主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ途徑來誘導(dǎo)CD4+T淋巴細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)[10-11]。HSPs多肽復(fù)合物主要有以下兩方面的作用：①作為多肽(包括抗原性腫瘤多肽)的伴侶，激活抗原特異性適應(yīng)性免疫。②作為抗原呈遞細(xì)胞的佐劑，獨立于任何相關(guān)肽，促進(jìn)先天免疫反應(yīng)。因此基于其免疫原性，目前已有研究將HSPs作為基礎(chǔ)疫苗與免疫調(diào)節(jié)性單克隆抗體(如抗細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4和抗程序性細(xì)胞死亡受體1/程序性細(xì)胞死亡配體1)協(xié)同使用治療腫瘤[12]，且HSPs疫苗已成功應(yīng)用于多種腫瘤(如黑色素瘤[11]、轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌[11]和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[13])，并顯示出極好的安全性。綜上可知，HSPs作為分子伴侶既有促進(jìn)腫瘤生長的作用，也可激活自身免疫起到治療腫瘤的作用。

2 不同類型的HSPs與CMM的關(guān)系

CMM是一種源自皮膚黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤。早期通過手術(shù)切除原發(fā)腫瘤可完全治愈，但轉(zhuǎn)移性CMM患者預(yù)后較差。目前對于已轉(zhuǎn)移的患者，可選擇手術(shù)切除原發(fā)灶及淋巴結(jié)清掃，術(shù)后予以大劑量干擾素注射預(yù)防復(fù)發(fā)[12]。而HSPs作為新型治療方案為CMM患者治療提供了新選擇。以下分別介紹不同種類HSPs對CMM的影響。

2.1小HSPs與CMM HSP27是一種小HSPs，其通過管理錯誤折疊的蛋白和防止細(xì)胞凋亡來維持細(xì)胞在應(yīng)激條件下的生存[14]。此外，HSP27在血管生成、腫瘤細(xì)胞遷移、抑制腫瘤凋亡以及細(xì)胞骨架組織中發(fā)揮重要作用。研究表明，HSP27與腫瘤相關(guān)，如在早期(Ⅰ期和Ⅱ期)結(jié)直腸癌中HSP27表達(dá)水平降低，而在晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)及肺轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者中HSP27表達(dá)水平升高[15]，在口腔鱗狀細(xì)胞癌[16]患者中HSP27表達(dá)水平最高。然而，HSP27與胃癌、肝癌的預(yù)后無明顯相關(guān)性[17-19]。CMM在增殖時需要豐富的血供，而HSP27與血管生成密切相關(guān)。研究顯示，血管生長因子依賴HSP27的調(diào)控，在CMM中下調(diào)HSP27可使VEGF及堿性成纖維細(xì)胞生長因子分泌減少，而敲除HSP27后，涉及血管生成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)明顯減少[2，19-20]。有研究表明，在HSP27表達(dá)水平較高的轉(zhuǎn)移性CMM患者中，靶向抑制VEGF的藥物貝伐珠單抗的療效更佳[21]。但目前關(guān)于HSP27與CMM的研究較少，HSP27促進(jìn)腫瘤組織血管生成仍需要進(jìn)一步研究，需要檢測多個反映血管新生的指標(biāo)，如微血管密度、增殖微血管密度、血管增殖指數(shù)等。另外，也有HSP27抑制劑運用于臨床試驗。

2.2HSP70與CMM HSP70的含量十分豐富，與其他HSPs功能類似，其具有協(xié)助大量蛋白質(zhì)折疊、協(xié)助錯誤蛋白質(zhì)降解等作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)，HSP70在多種腫瘤(如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、CMM)中均高表達(dá)[4，23]。而HSP70促進(jìn)CMM發(fā)生的機(jī)制可能包括：①HSP70可抑制胱天蛋白酶依賴的線粒體介導(dǎo)的內(nèi)、外源性凋亡途徑，也可與促凋亡因子(凋亡誘導(dǎo)因子)結(jié)合抑制獨立凋亡通路，從而促進(jìn)腫瘤的生長。②HSP70可與抑癌基因p53結(jié)合后抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使腫瘤細(xì)胞逃脫死亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活。另一方面，HSP70能夠與腫瘤特異性抗原組成多肽復(fù)合物激活T、B淋巴細(xì)胞，從而引發(fā)一系列特異性免疫應(yīng)答，同時也可激活固有免疫應(yīng)答[24]。臨床研究表明，HSP70在黑色素瘤中過表達(dá)，其中CMM轉(zhuǎn)移病灶中的表達(dá)水平最高，但在色素痣、正常細(xì)胞及組織中表達(dá)較少[24]；另外，HSP70表達(dá)水平與Clark水平存在相關(guān)性，對預(yù)后判斷具有重要價值[4，25]。但有研究認(rèn)為，HSP70在色素痣、CMM、正常皮膚中的表達(dá)未見明顯區(qū)別[26]，因此其作用仍有待進(jìn)一步研究明確。此外，HSP70陽性/MEL-5陰性的標(biāo)記組合可用于評估CMM的轉(zhuǎn)移潛能，同時也可作為預(yù)后危險因素的指標(biāo)[4]。

近年來，HSP70在腫瘤治療中的應(yīng)用越來越廣泛。依據(jù)致病機(jī)制，其治療方法主要包括以下兩種：①靶向治療。目前已有多個HSP70抑制劑，主要靶向N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域，包括天然產(chǎn)物和合成小分子[27]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞表面出現(xiàn)HSP70家族的基因編碼的蛋白質(zhì)，并攜帶免疫原性物質(zhì)，因此更易成為抗體治療的靶點[28]。另有研究表明，HSP70抑制劑PET-16可降低磷酸化黏著斑激酶及突變基因BRAF的表達(dá)水平，從而阻斷腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，HSP70抑制劑與BRAF抑制劑可協(xié)同作用，在一定程度上增加黑色素瘤對BRAF抑制劑的治療效果[29]。②免疫治療。有研究表明，使用HSP70水凝膠合成物外用或直接瘤內(nèi)注射于黑色素瘤小鼠可在激活CD4+、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的同時產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[30]。另外，HSP70疫苗與sBTLA基因轉(zhuǎn)染的腺相關(guān)病毒聯(lián)合使用激活免疫應(yīng)答，可縮小CMM小鼠肺轉(zhuǎn)移灶，延長小鼠的生存時間[31]。未來進(jìn)一步明確HSP70在黑色素瘤中的作用機(jī)制對腫瘤的預(yù)防和治療均具有重要意義。

2.3HSP90與CMM HSP90是目前研究最多、依賴ATP的分子伴侶，參與數(shù)百種蛋白質(zhì)的適當(dāng)折疊和成熟。其可以分為HSP90α、HSP90β、腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白1及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白94四種不同的亞型[32]。研究顯示，HSP90在黑色素瘤中的表達(dá)水平高于痣，且表達(dá)水平隨著Clark分級升高及Breslow深度增加而增高，但HSP90的高表達(dá)與生存率之間無明顯相關(guān)性[5]。另外，CMM患者血清中的HSP90水平明顯高于健康對照者，表明血清HSP90可能是CMM進(jìn)展的生物標(biāo)志物[33]。CMM的發(fā)生發(fā)展主要依賴促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、BRAF、核因子κB、Wnt/β聯(lián)蛋白等信號通路，而這些通路中的關(guān)鍵蛋白均是HSP90的客戶蛋白[34]。因此，HSP90在CMM的增殖、分化、轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、血管生成等方面發(fā)揮重要作用[35-37]。與HSP27和HSP70類似，HSP90也可通過調(diào)控p53、核因子κB、蛋白激酶B、Raf-1、c-Jun氨基端激酶等多種凋亡因子在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用[2]。有研究表明，HSP90抑制劑可通過降解缺氧誘導(dǎo)因子-1α抑制下游VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成，從而在CMM血管生成中發(fā)揮作用[38]。

此外，黑色素瘤細(xì)胞表面也發(fā)現(xiàn)了HSP90表達(dá)增加，提示HSP90是一個潛在的免疫相關(guān)靶點[39]。因此，已有很多選擇性HSP90抑制劑靶向用于腫瘤治療，其中HSP90靶向C端的抑制劑有新生霉素及其衍生物；N端抑制劑有苯醌類、間苯二酚類抑制劑，包括格爾達(dá)霉素、17-丙烯氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、根赤殼菌素等；靶向中間結(jié)構(gòu)域的抑制劑有Sansalvamide A及其衍生物[34]。由于HSP90在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞周期控制和凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時可以從多環(huán)節(jié)、多途徑影響癌細(xì)胞生長和存活，避免了單靶點治療可能產(chǎn)生的耐藥性，所以HSP90在CMM的靶向治療中具有良好的應(yīng)用前景。對于BRAF v600突變黑色素瘤患者，雖然初始使用BRAF抑制劑時效果較佳，但會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，而有臨床試驗表明，使用HSP90抑制劑XL888聯(lián)合維莫非尼治療基因突變患者療效時間增加，且不良反應(yīng)可耐受[40]。目前，熱消融或激光治療較大的CMM可能引起局部復(fù)發(fā)，而使用HSP90抑制劑(17-DMAG)可以增強(qiáng)高溫條件下黑色素瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)，通過蛋白激酶B和p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑降解HSP90，抑制SK-MEL-2黑色素瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。因此在高溫狀態(tài)下，使用HSP90抑制劑可能是黑色素瘤的一種輔助治療方法[41]。有研究表明，HSP90抑制劑17-AAG外用能有效預(yù)防紫外線誘導(dǎo)的表皮增生和鱗狀細(xì)胞癌，考慮17-AAG可配制成乳膏用于預(yù)防紫外線暴露人群或器官移植人群的皮膚鱗狀細(xì)胞癌[42]。因此，HSP90抑制劑的運用可能拓寬CMM的治療途徑。

2.4HSP105與CMM HSP105是一種大分子量蛋白，具有多種功能，如防止蛋白質(zhì)錯誤折疊過程中的聚集，提供細(xì)胞耐熱性以及穩(wěn)定熱變性蛋白質(zhì)，目前有關(guān)HSP105在黑色素瘤中的作用研究較少[43]。HSP105可以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡，對癌細(xì)胞的生存和增殖至關(guān)重要。HSP105在多種人類癌細(xì)胞中均有過表達(dá)，而其在鱗狀細(xì)胞癌[44]、肺腺癌[45]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[46]中的過表達(dá)與疾病進(jìn)展和不良預(yù)后有關(guān)。有研究表明，乳腺癌、直腸癌及CMM臨床研究中HSP105過表達(dá)的患者總體生存期短[47]。但HSP105過表達(dá)與膀胱癌的良好預(yù)后相關(guān)[48]。在皮膚腫瘤中，HSP105在乳房外佩吉特病、鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)，在基底細(xì)胞癌中表達(dá)較少[49]。在正常人皮膚、良性黑色素細(xì)胞、色素痣中HSP105幾乎不表達(dá)，然而在原發(fā)、晚期及轉(zhuǎn)移的CMM中HSP105高表達(dá)。有研究表明，與HSP70相比，HSP105被認(rèn)為是與CMM相關(guān)性更強(qiáng)的腫瘤相關(guān)抗原[6]。

此外，HSP105也在腫瘤生長方面發(fā)揮作用，如Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路在結(jié)腸癌等腫瘤中可發(fā)揮重要作用，β聯(lián)蛋白分子在細(xì)胞質(zhì)中的累積，可引起細(xì)胞核內(nèi)異?；虻霓D(zhuǎn)錄，而HSP105可促進(jìn)β聯(lián)蛋白分子的累積和核內(nèi)基因表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、分化。另有研究表明，在抑制凋亡方面，HSP105不僅可通過抑制Bcl-2相關(guān)X蛋白轉(zhuǎn)位到線粒體，從而阻止細(xì)胞色素C的釋放，還可使蛋白激酶通路中的p38表達(dá)減少[3]。因此，HSP105可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的持續(xù)克隆增殖。

HSP105是高效的分子伴侶，具有強(qiáng)大的多肽結(jié)合力，其效率為HSP70的40倍[50]。目前，已有多種HSP105多肽復(fù)合物疫苗、干擾小RNA進(jìn)行試驗并取得一定成效。如用HSP105 DNA疫苗免疫小鼠，可使適應(yīng)免疫中的CD4+T及CD8+T細(xì)胞激活，從而激活免疫系統(tǒng)對抗腫瘤(如結(jié)直腸癌和黑色素瘤)，但這種疫苗卻不會引起自身免疫[51]。有學(xué)者對HSP105疫苗進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗發(fā)現(xiàn)，HSP105可誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)激活免疫反應(yīng)[52]。因此，HSP105疫苗有望成為治療CMM的新方式。目前關(guān)于HSP105與CMM的研究較少，但其能夠作為優(yōu)勢的免疫佐劑研發(fā)抗腫瘤疫苗，因此需要深入研究HSP105在CMM發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)作用機(jī)制。

2.5其他類型HSPs與CMM 目前，關(guān)于其他類型的HSPs與CMM的研究較少。HSP40家族分布于不同細(xì)胞器，并在蛋白質(zhì)的翻譯、折疊、轉(zhuǎn)運和降解等過程中發(fā)揮重要作用。HSP40的J結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與HSP70相互作用，作為分子伴侶存在，兩者常共定位于相同的亞細(xì)胞區(qū)域，HSP40在HSP70活性調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用[53]。HSP40預(yù)先識別要轉(zhuǎn)移到HSP70的底物，并刺激HSP70的ATP水解，從而使得底物與HSP70穩(wěn)定結(jié)合，因此HSP40-HSP70的相互作用可能對腫瘤的治療具有重要意義，可為藥物定位或免疫療法提供可行目標(biāo)，但HSP40在CMM中的相關(guān)作用機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步研究。HSP60是重要的應(yīng)激蛋白，其廣泛存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞，具有高度保守性和序列同源性。HSP60參與應(yīng)激反應(yīng)中蛋白質(zhì)合成、多肽折疊、受損線粒體蛋白運輸?shù)壬磉^程，且具有免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能。HSP60表達(dá)水平的變化可為腸癌、胃癌等腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、流行病學(xué)調(diào)查提供依據(jù)[54]。研究表明，用HSP65免疫小鼠可激發(fā)免疫反應(yīng)，抑制小鼠黑色素瘤生長，延長腫瘤小鼠的生存時間[55]。

3 小 結(jié)

既往研究表明，HSPs家族中的HSP70、HSP90和HSP105在CMM中均呈高表達(dá)，且其高表達(dá)常與預(yù)后較差有關(guān)[56]。同時，HSPs的表達(dá)水平升高可促進(jìn)CMM的增殖、轉(zhuǎn)移以及血管生成。目前,腫瘤的免疫及靶向治療是研究熱點，而HSPs具有雙重調(diào)節(jié)作用，不僅能夠激活免疫系統(tǒng)，也有抗凋亡作用。在治療方面HSPs能夠刺激天然免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答起到治療作用，而靶向使用HSPs抑制劑輔助其他靶向藥物，可預(yù)防耐藥性。但HSPs與CMM關(guān)系密切，未來通過不斷研究可為后續(xù)CMM的診斷、差異性治療提供新方向。