李怡斐，楊小苗，王春萍，段敏杰，黃任中，張世才*

(1 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，重慶 401329；2 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，逆境農(nóng)業(yè)研究重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401329)

辣椒(CapsicumannuumL.)是世界上廣泛種植的一種作物，可作為蔬菜、香料、食用色素和醫(yī)藥用途。2020年全球辣椒種植面積達(dá)161.5萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)415.7萬(wàn)t(http://www.fao.org/faostat/zh/#data/QC)。在過(guò)去的30年里，朝天椒消費(fèi)量增長(zhǎng)了40倍[1]。目前辣椒雜交種生產(chǎn)主要依靠人工去雄和授粉，不僅生產(chǎn)成本高，種子純度也難以保障。CMS三系雜交制種具有節(jié)約去雄成本、保證雜交種純度、制種產(chǎn)量高和保護(hù)品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)等優(yōu)點(diǎn)。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于辣椒CMS恢復(fù)系分子標(biāo)記輔助育種研究，已基于RAPD、AFLP和序列同源性開(kāi)發(fā)了幾個(gè)可以預(yù)測(cè)恢復(fù)基因Rf表型的分子標(biāo)記[2-6]。Gulyas等[7]將RAPD標(biāo)記OPT-02/570轉(zhuǎn)成與Rf緊密連鎖的CRF-SCAR標(biāo)記，遺傳距離為5.3 cM。Kim等[3]將AFRF8轉(zhuǎn)化為CAPS標(biāo)記AFRF8CAPS，遺傳距離為1.8 cM。Lee等[5]確定了與CMS育性恢復(fù)相關(guān)的部分恢復(fù)(pr)位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)了與該位點(diǎn)密切連鎖的CAPS標(biāo)記(PR-CAPS)(距Rf1.8 cM)。與Rf緊密連鎖的分子標(biāo)記可有效提高篩選CMS恢復(fù)系的效率，在苗期即可取葉片進(jìn)行PCR鑒定，不受季節(jié)的影響。

目前，由辣椒疫霉(phytophthoracapsici)引起的疫病已成為國(guó)內(nèi)外辣椒主產(chǎn)區(qū)最具破壞性的病害之一，每年造成超過(guò)1億美元的經(jīng)濟(jì)損失[8]。在強(qiáng)降雨、過(guò)度灌溉、排水不暢等條件下更容易引起辣椒疫病發(fā)生[9-10]。迄今為止，除化學(xué)防治外尚未有有效和安全的措施防治疫病[11-13]。因此，利用抗病品種已成為解決辣椒疫病發(fā)生的簡(jiǎn)單、有效、安全的途徑。植物育種家也把重點(diǎn)放在培育高抗性品種上。Quirin等[14]開(kāi)發(fā)了一個(gè)與辣椒疫病緊密連鎖的SCAR分子標(biāo)記FQ01/RQ01。李怡斐等[15]利用SLAF-seq構(gòu)建了辣椒高密度遺傳圖譜，該圖譜包含12個(gè)連鎖群，5 565個(gè)標(biāo)記，并對(duì)疫病抗性進(jìn)行了QTL定位。這些為分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)以及利用MAS培育抗病品種提供了技術(shù)支撐。

當(dāng)前，花藥培養(yǎng)技術(shù)可以更快速、更節(jié)約地創(chuàng)制性狀純合的育種(純)系，大大減少創(chuàng)制育種純系所需的世代數(shù)，從而降低育種工作的成本[16]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外科研工作者通過(guò)花藥培養(yǎng)技術(shù)獲得了一批DH系。Cabuk等[17]以辣椒Clrgalan和P1(抗疫病)BC2F2為供試親本進(jìn)行辣椒花藥培養(yǎng)，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇獲得25個(gè)抗疫病的辣椒純系。李怡斐等[18]采用花藥培養(yǎng)技術(shù)與MAS技術(shù)相結(jié)合的方法創(chuàng)制了3個(gè)性狀優(yōu)良的加工型辣椒CMS恢復(fù)系。隨后，李怡斐等[19]利用花藥培養(yǎng)技術(shù)與MAS相結(jié)合的方法創(chuàng)制了14個(gè)抗疫病雙單倍體(doubled haploid，DH)株系。重慶位于中國(guó)西南地區(qū)，夏季高溫多雨天氣容易誘發(fā)辣椒疫病大面積爆發(fā)，為了更好地解決制種純度和辣椒疫病問(wèn)題，培育抗疫病的CMS恢復(fù)系就成為是解決該問(wèn)題的唯一方法。

本研究為創(chuàng)制抗疫病加工型辣椒CMS恢復(fù)系材料，以長(zhǎng)果、單生朝天椒作母本，以抗疫病恢復(fù)系為父本，利用雜交、花藥培養(yǎng)和MAS相結(jié)合的方法，開(kāi)展抗疫病CMS恢復(fù)系的創(chuàng)制，以期獲得單生、長(zhǎng)果的抗疫病CMS恢復(fù)系，為利用三系配套選育加工型辣椒抗病新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本課題組選用抗疫病恢復(fù)系939-1和1021(1)-1為抗疫病和恢復(fù)基因供體親本，以長(zhǎng)果、單生自交系481-4-10作為受體親本，配制雜交組合。

1.2 方 法

1.2.1 花藥培養(yǎng)2017年5～7月在重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所以(481-4-10×939-1)F1和[481-4-10×1021(1)-1]F1為供體親本進(jìn)行花藥培養(yǎng)。上午9點(diǎn)前摘取處于單核靠邊期的花蕾置于冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈工作臺(tái)上用70%酒精表面消毒30 s，隨后用0.1% HgCl2消毒7 min，無(wú)菌水漂洗4次，之后將花蕾置于裝有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。無(wú)菌條件下將花藥接種于胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS+0.5 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D+3%蔗糖+7 g/L瓊脂+4 mg/L AgNO3+0.04%活性炭)，9 mm×9 mm培養(yǎng)皿接6個(gè)花蕾的花藥，35 ℃高溫預(yù)處理5 d[20]。

1.2.2 再生植株倍性鑒定以 939-1 正常二倍體為對(duì)照，分別取對(duì)照和花培再生植株的新鮮嫩葉1～2 片，標(biāo)記后送北京紅山風(fēng)尚科技有限公司進(jìn)行倍性檢測(cè)。倍性檢測(cè)的儀器為Partec公司的CyFlow Space，所用試劑為 Partec CyStain UV Precise P 快速倍性分析試劑盒。取0.5 cm2的新鮮葉片，置于培養(yǎng)皿中，加入400 μL 核酸提取緩沖液(Nuclear Extraction Buffer)，用鋒利刀片切碎，放置10 s，再用30μm濾網(wǎng)將樣本過(guò)濾至樣品管中，加入 600 μL 染色緩沖液(Staining Buffer)，輕微混勻，即可上機(jī)測(cè)試。

1.2.3 分子標(biāo)記輔助選擇鑒定采用Gulyas等[7]開(kāi)發(fā)的CRF-SCAR標(biāo)記鑒定辣椒花培DH系是否攜帶Rf基因， CRF-SCAR引物序列為F(5′-ATT-TTCAGATTGTGGCGACG-3′)和R(5′-CGACC-ATCACGACGAGG-3′)。利用Quirin等[14]開(kāi)發(fā)的與辣椒抗疫病QTL位點(diǎn)Phyto.5.2.緊密連鎖的FQ01/ RQ01標(biāo)記鑒定辣椒DH系的疫病抗性。引物為FQ01(5′-CCATAAGGGTTGGTAAATTTA-CAAAG-3′)和RQ01(5′-TCGAGAGATAATTC-AGATAGTATAATC-3′)，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

本研究采用CTAB法提取辣椒葉片DNA。反應(yīng)體系為20 μL，基因組DNA 1 μL，2×PCR Master Mix 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，滅菌水20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min。

1.2.4 苗期抗性鑒定采用灌根接種法鑒定辣椒花培DH系的疫病抗性，參照NY/T2060.1-2011《辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程-辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程》。在幼苗6葉展平期進(jìn)行，接種前澆透水，用手術(shù)刀在距離幼苗根部3 cm處斷根，用移液器吸取5 mL游離孢子濃度為1×105個(gè)/mL孢子懸浮液注入辣椒幼苗根部附近。接種后將植株置于白天溫度25～28 ℃、夜間溫度為20～22 ℃的培養(yǎng)室，每天光照10～12 h，使基質(zhì)濕度保持近飽和狀態(tài)。接種后7 d調(diào)查記載各級(jí)病株數(shù)。病情級(jí)別劃分及抗性評(píng)價(jià)方法參照辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.5 DH系農(nóng)藝性狀調(diào)查小區(qū)1.333 m×4.0 m，雙行單株種植，每小區(qū)種植20株，3次重復(fù)。結(jié)果盛期進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查，用卷尺測(cè)量株高和冠幅，調(diào)查始花節(jié)位、果實(shí)朝向、單株結(jié)果和果形等。隨后摘取辣椒紅熟果實(shí)進(jìn)行室內(nèi)考種，包括果長(zhǎng)、果寬和辣味等。

1.2.6 測(cè)交驗(yàn)證以481-4-1A和0313932A不育系分別作測(cè)交親本(母本)，以DH系為測(cè)交父本，驗(yàn)證DH系對(duì)不育系的育性恢復(fù)能力。盛花期分別取DH系開(kāi)放的花，分別與481-4-1A和0313932A授粉，授粉后做好標(biāo)記，共授粉4次，每個(gè)DH系測(cè)交5株。調(diào)查測(cè)交后代的育性，育性記載為恢復(fù)株率。

2 結(jié)果與分析

2.1 DH系的獲得

2017年春季進(jìn)行辣椒花藥培養(yǎng)，每個(gè)雜交組合接種40皿，每皿接種6枚花藥，共接種240枚花藥。結(jié)果表明：供體親本(481-4-10×939-1)F1經(jīng)花藥培養(yǎng)共誘導(dǎo)出22個(gè)胚狀體，誘導(dǎo)率為9.17%。其中成苗的有19個(gè)，移栽成活后經(jīng)人工加倍，11個(gè)花培再生苗可正常結(jié)實(shí)，經(jīng)倍性鑒定均為二倍體(圖1)，即得到了11個(gè)花培DH系；[481-4-10×1021(1)-1]F1經(jīng)花藥培養(yǎng)共誘導(dǎo)出20個(gè)胚狀體，誘導(dǎo)率為8.33%，其中成苗14個(gè)，移栽成活后經(jīng)人工加倍，9個(gè)花培再生苗可正常結(jié)實(shí)，即獲得9個(gè)DH系。

A.939-1(二倍體)；B.花培再生植株(二倍體)

2.2 分子標(biāo)記輔助選擇

采用分子標(biāo)記CRF-SCAR鑒定花培DH系是否攜帶Rf基因，該標(biāo)記在可育材料中可擴(kuò)增出870 bp的特異條帶，在不育材料中則無(wú)特異條帶。PCR擴(kuò)增結(jié)果表明(圖2，表1)，由供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個(gè)DH系中有7個(gè)可擴(kuò)增出870 bp的特異條帶，占63.6%；而來(lái)自供體[481-4-10×1021(1)-1]F1的9個(gè)DH系中有8個(gè)擴(kuò)增出870 bp的特異條帶，占88.9%。

M. DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

采用分子標(biāo)記FQ01/RQ01驗(yàn)證花培DH系的疫病抗性，該標(biāo)記在抗疫病材料可PCR擴(kuò)增出717 bp大小的特異條帶，感疫病材料則無(wú)特異條帶。試驗(yàn)結(jié)果表明(圖3)，供體(481-4-10×939-1)F1獲得的11個(gè)DH系中有5個(gè)DH系擴(kuò)增出條帶大小為717 bp的特異條帶，初步認(rèn)為這5個(gè)DH系抗疫病，占45.5%；而供體[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的9個(gè)DH系中有4個(gè)擴(kuò)增出717 bp的特異條帶，占44.4%。

M.DL2000；1～11. (481-4-10×939-1)F1獲得的DH系；12～20.[481-4-10×1021(1)-1]F1獲得的DH系

由此可知，通過(guò)MAS技術(shù)初步篩選到7個(gè)含Rf的抗疫病DH系，分別命名為‘渝辣選3-2’、‘渝辣選3-3’、‘渝辣選3-5’、‘渝辣選7-1’、‘渝辣選7-5’、‘渝辣選7-6’和‘渝辣選7-9’，需進(jìn)一步通過(guò)苗期抗性鑒定明確其抗性。

2.3 苗期抗性鑒定

為了進(jìn)一步明確花培DH系的疫病抗性，采用灌根接種法鑒定MAS技術(shù)初選的抗疫病DH系的疫病抗性，以PI201234為抗病對(duì)照，以Early calwonder為感病對(duì)照，接種辣椒疫霉菌后7 d調(diào)查病情(圖4)，根據(jù)農(nóng)業(yè)部辣椒抗疫病鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)關(guān)于依據(jù)辣椒疫病病情指數(shù)劃分參試品種抗病類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)，苗期抗性鑒定試驗(yàn)結(jié)果表明，7個(gè)DH系的病情指數(shù)介于18.1～36.8之間，其中5個(gè)DH系抗疫病，2個(gè)中抗疫病(表1)，說(shuō)明這7個(gè)DH系較抗疫病。

A.PI201234；B.Early calwonder；C.渝辣選3-2 Yulaxuan 3-2

表1 辣椒DH系疫病抗性鑒定

2.4 農(nóng)藝性狀

盛果期調(diào)查攜帶Rf基因的7份抗疫病DH系的農(nóng)藝性狀(表2)，調(diào)查結(jié)果表明，各DH系的株高介于69.3～88.0 cm，以‘渝辣選7-9’株高最高；冠幅范圍在71.5～78.5 cm之間，以‘渝辣選7-1’的冠幅最大；始花節(jié)位在9.0～14.3節(jié)之間，以‘渝辣選3-3’的始花節(jié)位最高；5個(gè)DH系果實(shí)均為單生向上，果形為羊角和牛角；果長(zhǎng)介于10.3～15.1 cm，以‘渝辣選7-5’果最長(zhǎng)；果寬范圍在1.5～2.1 cm之間，以‘渝辣選7-5’果寬最大；單株結(jié)果數(shù)介于48.9～97.4個(gè)，以‘渝辣選3-2’最多，為97.4個(gè)；其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’味辣，其余為微辣。綜上所述，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’果實(shí)是單生、長(zhǎng)果朝天椒，味辣，可作為親本進(jìn)行加工型辣椒新品種選育。

表2 辣椒DH系農(nóng)藝性狀調(diào)查

2.5 測(cè)交驗(yàn)證

2019年以481-4-1A和0313932A不育系分別作母本，以DH系‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’分別作父本，測(cè)交驗(yàn)證DH系的育性恢復(fù)性。將測(cè)交后代定植于國(guó)家農(nóng)作物改良中心(重慶分中心)基地，調(diào)查花粉育性(表3)。各測(cè)交組合的測(cè)交株系均表現(xiàn)可育，各測(cè)交株系的恢復(fù)株率均為100%。表明‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’均為CMS恢復(fù)系，田間調(diào)查結(jié)果與分子標(biāo)記輔助選擇結(jié)果一致。

表3 測(cè)交驗(yàn)證DH系對(duì)CMS不育系的恢復(fù)性

3 討 論

據(jù)報(bào)道，已在150多種植物中發(fā)現(xiàn)了CMS，用于簡(jiǎn)化F1雜交種子生產(chǎn)中繁重的去雄和人工授粉[21]。但是，目前辣椒上只有極少數(shù)品種能應(yīng)用三系配套進(jìn)行雜種一代生產(chǎn)[22-23]。主要是由于辣椒育種中CMS恢復(fù)系較少，且恢復(fù)系的選育較難，因此對(duì)于恢復(fù)系的選育研究十分重要。然而，通過(guò)傳統(tǒng)育種技術(shù)選育CMS恢復(fù)系費(fèi)時(shí)、費(fèi)工，而通過(guò)花藥培養(yǎng)與常規(guī)育種技術(shù)、分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的有效結(jié)合，在2～3年內(nèi)可以培育出聚合多種性狀的DH系。目前，育種家們已經(jīng)利用花藥培養(yǎng)創(chuàng)制了一些優(yōu)異的新種質(zhì)[19,24-27]。

本研究通過(guò)常規(guī)育種和花藥培養(yǎng)技術(shù)將抗疫病恢復(fù)系939-1和1021(1)-1的Rf基因和抗病基因?qū)腴L(zhǎng)果、單生自交系481-4-10，用與Rf基因緊密連鎖的CRF-SCAR標(biāo)記檢測(cè)DH系的育性恢復(fù)性，然后采用FQ01/RQ01標(biāo)記檢測(cè)各DH系的疫病抗性。苗期抗性鑒定進(jìn)一步明確DH系的疫病抗性。最終經(jīng)PCR檢測(cè)與苗期抗性鑒定出5個(gè)攜帶Rf的抗疫病DH系。盛花期調(diào)查5個(gè)DH系的農(nóng)藝性狀，其中‘渝辣選3-2’和‘渝辣選7-1’綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良。采用測(cè)交法進(jìn)一步驗(yàn)證2個(gè)DH系對(duì)不育系481-4-1A和0313932A的恢復(fù)性，兩個(gè)不育系各測(cè)交組合的DH系測(cè)交株系的恢復(fù)株率均為100%。由此可見(jiàn)，將常規(guī)育種、生物技術(shù)和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)有機(jī)結(jié)合是創(chuàng)制辣椒新種質(zhì)的捷徑，顯著縮短了育種材料的純化時(shí)間，從而加快育種進(jìn)程。

利用花藥培養(yǎng)技術(shù)快速將幾個(gè)性狀或基因進(jìn)行聚合最關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)是MAS技術(shù)，如果已有與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，可通過(guò)PCR擴(kuò)增快速對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行篩選。該技術(shù)已經(jīng)在水稻上廣泛應(yīng)用，王興春等[28]利用分子標(biāo)記輔助選擇與花藥培養(yǎng)相結(jié)合快速聚合水稻白葉枯病抗性基因，獲得16株攜有xa5基因。宋丁丁等[25]利用花藥培養(yǎng)和分子標(biāo)記選擇相結(jié)合改良了水稻稻瘟病和褐飛虱抗性。孫海波等[26]利用花藥培養(yǎng)快速培育聚合抗3種水稻病害基因的新種質(zhì)14個(gè)。本研究利用花藥培養(yǎng)與分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)創(chuàng)制了2個(gè)長(zhǎng)果、單生抗疫病兼CMS恢復(fù)的DH系，可用于培育長(zhǎng)果朝天椒品種的選育，進(jìn)而降低生產(chǎn)成本。說(shuō)明花藥培養(yǎng)技術(shù)與分子標(biāo)記輔助選擇相結(jié)合是根據(jù)育種目標(biāo)而創(chuàng)制新種質(zhì)的有效途徑。

花藥培養(yǎng)與MAS的有效結(jié)合，從供體親本配制到分子標(biāo)記鑒定、抗病性鑒定和測(cè)交驗(yàn)證僅用2～3年(與南繁結(jié)合)，高效培育出攜帶Rf基因兼抗疫病的辣椒DH系，即CMS恢復(fù)系，比常規(guī)育種快，顯著提高了育種效率。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，與各種性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記不斷涌現(xiàn)，花藥培養(yǎng)效率不斷提高，通過(guò)該方法實(shí)現(xiàn)性狀聚合有望在育種實(shí)踐中得到廣泛的應(yīng)用。