易弼順,馬柏強(qiáng),李冰震,邢永俊

易弼順,馬柏強(qiáng),李冰震,邢永俊,麗水市人民醫(yī)院創(chuàng)傷急腹癥、疝與腹壁外科 浙江省麗水市 323000

0 引言

結(jié)直腸癌是當(dāng)今世界最常見的癌癥之一,其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢(shì)[1,2].據(jù)報(bào)道,全球每年約有90萬人死于結(jié)直腸癌[3].在中國(guó),結(jié)直腸癌的發(fā)病率約為14.2/10萬,死亡率約為7.4/10萬,結(jié)直腸癌病死率為14.0%[4].約70%以上的結(jié)直腸癌患者在就診時(shí)即處于進(jìn)展期,化療是結(jié)直腸癌的基本治療方法[5,6],其中奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)是結(jié)直腸癌化療的一線藥物[7].其中約有30%-50%的結(jié)直腸患者對(duì)L-OHP化療應(yīng)答效果不理想,導(dǎo)致復(fù)發(fā)甚至病情惡化[8],因此,尋找提高L-OHP敏感性的策略已成為化療亟待解決的問題.

據(jù)報(bào)道[9],源自中草藥的天然活性成分對(duì)預(yù)防和治療癌癥有益.五味子甲素(schizandrin A,SchA)是一種從北五味子干燥果實(shí)中提取的木脂素類化合物,其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和肝腎保護(hù)等功效[10-12].據(jù)最近報(bào)道[13-16],SchA(劑量＞30 μM)在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌等多種腫瘤中具有抗癌以及逆轉(zhuǎn)p-糖蛋白介導(dǎo)的癌細(xì)胞的多藥耐藥性的作用.但另有研究發(fā)現(xiàn)[17],其在小劑量(＜20 μM)時(shí)能增強(qiáng)乳腺癌阿霉素(doxorubicin,DOX)耐藥細(xì)胞MCF-7/DOX對(duì)DOX敏感,但其并不影響肝癌DOX耐藥細(xì)胞(BEL-7402/DOX和HepG2/DOX)以及白血病DOX耐藥細(xì)胞(K-562/DOX)的DOX敏感性.因此,若要闡明SchA的抗腫瘤作用和其對(duì)化療藥物的相互作用應(yīng)采用不同種類的腫瘤細(xì)胞以及不同的SchA劑量范圍.本研究主要評(píng)估小劑量SchA對(duì)L-OHP在結(jié)直腸癌細(xì)胞的抗腫瘤活性的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑: SchA試劑(純度98%,貨號(hào): R094260)購自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;L-OHP試劑(純度98%,貨號(hào): BD146411)購自上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司;噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(貨號(hào): T6126)購自上海麥克林生化科技有限公司;異硫氰酸熒光素標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶(fluorescein isothiocyanate labeled annexin V/Propidium iodide,Annexin V-FITC/PI)試劑盒(貨號(hào): KGA107)、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)活性氧檢測(cè)試劑盒H2DCFDA(貨號(hào): KGAF018)和5,5’,6,6’-四氯-1,1’,3,3’-四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(1,1',3,3'-tetraethyl-5,5',6,6'-tetrachloroimidacarbocyanine iodide,JC-1)探針線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(貨號(hào): KGA603)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;細(xì)胞裂解液(貨號(hào): P0013C)、細(xì)胞線粒體蛋白分離試劑盒(貨號(hào): C3601)、極超敏電化學(xué)發(fā)光(electro-chemi-luminescence,ECL)試劑盒(貨號(hào): P0018FM)、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗(貨號(hào): A0208)、劈開的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved cysteine proteinase-3,cleaved caspase-3)抗體(貨號(hào): AC033)、細(xì)胞色素c(cytochrome c,Cyt c)(貨號(hào):AF2047)、環(huán)氧合酶Ⅳ(cyclooxygenase Ⅳ,COX Ⅳ)(貨號(hào): AF6549)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin;貨號(hào): AF5003)抗體購自上海碧云天生物科技有限公司;B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體(貨號(hào): BS1511)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(貨號(hào): BS6420)均購自南京巴傲得生物科技有限公司.

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng): 結(jié)直腸癌細(xì)胞系(SW480和HT-29)購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫,將其置于含10%胎牛血清(美國(guó)PAA公司)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco's modified eagle medium,DMEM)細(xì)胞培養(yǎng)液(美國(guó)Corning公司)中培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2.

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性: 當(dāng)SW480和HT-29細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),將細(xì)胞分別鋪在96孔(每孔5000個(gè)細(xì)胞)板中,分別給予不同濃度[(0、0.5、1、2、4、8、16)μmol/L]L-OHP、不同濃度[(0、2、4、8、10、20) μmol/L]SchA或2 μmol/L L-OHP聯(lián)合不同濃度[(4、8、10、20)μmol/L]SchA處理24 h.每孔加入10 μL MTT試劑,37 ℃孵育4 h,加入二甲基亞砜溶解結(jié)晶后,酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值.

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡: SW480和HT-29細(xì)胞分別給予2 μmol/L L-OHP聯(lián)合10 μmol/L SchA處理24 h.消化收集細(xì)胞,按照Annexin V-FITC/PI試劑盒的說明書步驟,分別避光孵育Annexin V-FITC和PI試劑各10 min,最后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況.

1.2.3 H2DCFDA探針檢測(cè)ROS蓄積: SW480和HT-29細(xì)胞分別給予2 μmol/L L-OHP聯(lián)合10 μmol/L SchA處理24 h,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌2次,按照ROS活性氧檢測(cè)試劑盒H2DCFDA的說明書步驟,分別避光孵育 H2DCFDA試劑30 min,PBS洗滌2次后,熒光顯微鏡下觀察,并統(tǒng)計(jì)熒光強(qiáng)度.

1.2.4 JC-1探針評(píng)估線粒體膜電位: SW480和HT-29細(xì)胞分別給予2 μmol/L L-OHP聯(lián)合10 μmol/L SchA處理24 h,用PBS洗滌2次,按照J(rèn)C-1探針線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒的說明書步驟,分別避光孵育JC-1染色試劑20 min,PBS洗滌2次后,熒光顯微鏡下觀察,并分別統(tǒng)計(jì)綠色/紅色熒光強(qiáng)度.線粒體膜電位以綠色/紅色熒光強(qiáng)度的倒數(shù)表示.

1.2.5 Western blot分析: SW480和HT-29細(xì)胞分別給予2 μmol/L L-OHP聯(lián)合10 μmol/L SchA處理24 h.用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白,用細(xì)胞線粒體蛋白分離試劑盒分別提取細(xì)胞漿蛋白與線粒體蛋白.取蛋白按照常規(guī)Western blot步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)印.將已轉(zhuǎn)印蛋白的聚偏二氟乙烯膜用5%脫脂奶粉封閉30 min后,分別室溫孵育一抗(Bcl-2、Bax、Cyt c、cleaved caspase-3、COX Ⅳ和β-actin;均1:2000稀釋)2 h,洗膜后,孵育1:2000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)二抗1 h,再次洗膜后,用ECL顯影系統(tǒng)顯像,并以β-actin為總蛋白和漿蛋白的內(nèi)參,以COX Ⅳ為線粒體蛋白的內(nèi)參,定量目的條帶的相對(duì)表達(dá)量.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)表示為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD).使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.通過使用單因素方差分析分析組之間的差異,然后對(duì)均數(shù)進(jìn)行Tukey-ramer多重比較檢驗(yàn),P＜0.05則認(rèn)為差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 SchA增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性 為研究SchA是否影響結(jié)直腸細(xì)胞的L-OHP敏感性,本研究首先用梯度濃度的L-OHP處理SW480和HT-29 結(jié)直腸癌細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)L-OHP可濃度依賴性抑制SW480和HT-29的細(xì)胞活性,SW480細(xì)胞L-OHP的IC50=1.76 μmol/L,HT-29細(xì)胞L-OHP的IC50=2.47 μmol/L(圖1A和B).用梯度濃度的SchA處理SW480和HT-29細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在(0-10) μmol/L濃度范圍內(nèi)SchA不影響此倆者的細(xì)胞活性(圖1C和D).將SchA[(4-20) μmol/L]和L-OHP(2 μmol/L)聯(lián)合處理SW480和HT-29 細(xì)胞24 h,用MTT檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與單用L-OHP處理組比較,SchA濃度為(8-20) μmol/L時(shí)的聯(lián)合用藥組中SW480(圖1E)和HT-29(圖1F)的細(xì)胞活性均明顯降低(均P＜0.05).進(jìn)一步將SchA(10 μmol/L)和L-OHP(2 μmol/L)聯(lián)合處理SW480和HT-29細(xì)胞24 h,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與單用L-OHP處理組比較,SchA能增強(qiáng)L-OHP誘導(dǎo)的SW480(圖2A和B)和HT-29(圖2C和D)細(xì)胞凋亡(均P＜0.05).綜上,SchA能增強(qiáng)L-OHP對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷作用.

2.2 SchA增強(qiáng)L-OHP導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞中ROS蓄積ROS探針結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,L-OHP(2 μmol/L)能增加SW480(圖3A和B)和HT-29(圖3C和D)細(xì)胞中ROS蓄積水平(均P＜0.05),SchA(10 μmol/L)能進(jìn)一步增強(qiáng)L-OHP誘導(dǎo)的ROS蓄積(均P＜0.05).

2.3 SchA增強(qiáng)L-OHP誘導(dǎo)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中線粒體凋亡信號(hào)活性 JC-1探針結(jié)果(圖4)顯示,與對(duì)照組比較,L-OHP(2 μmol/L)能降低SW480(圖4A和B)和HT-29(圖4C和D)細(xì)胞中線粒體膜電位水平(均P＜0.05);與單用L-OHP處理組比較,SchA(10 μmol/L)與L-OHP(2 μmol/L)聯(lián)合處理組的SW480(圖3B和4A)和HT-29(圖3D和4C)細(xì)胞中線粒體膜電位水平更低(均P＜0.05).進(jìn)一步用Western blot檢測(cè)線粒體凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),結(jié)果(圖5)顯示,與對(duì)照組比較,L-OHP(2 μmol/L)能降低SW480(圖5A,B,E,F,I,J)和HT-29(圖5C,D,G,H,L,M)細(xì)胞中Bcl-2和線粒體Cyt c表達(dá)水平并增加Bax、細(xì)胞漿Cyt c和cleaved caspase-3表達(dá)水平(均P＜0.05);與單用L-OHP處理組比較,SchA(10 μmol/L)與L-OHP(2 μmol/L)聯(lián)合處理組SW480(圖5A,B,E,F,I,J)和HT-29(圖5C,D,G,H,L,M)細(xì)胞中Bcl-2和線粒體Cyt c表達(dá)水平明顯降低且Bax、細(xì)胞漿Cyt c和cleaved caspase-3表達(dá)水平明顯增高(均P＜0.05).

3 討論

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見的癌癥之一.近幾十年來,L-OHP一直被用作結(jié)直腸癌治療的一線藥物[7].臨床使用發(fā)現(xiàn),L-OHP對(duì)部分轉(zhuǎn)移性或耐藥性的結(jié)直腸癌患者的客觀緩解率并不理想[8].因此,提高L-OHP的化療敏感性至關(guān)重要.近些年,研究顯示許多來源于天然中草藥的小分子化合物能在腫瘤的放化療中發(fā)揮增敏效應(yīng)[18,19].SchA是一種從北五味子提取的活性化合物,累積的證據(jù)表明它對(duì)多種癌細(xì)胞具有抗腫瘤活性[12-16],且已被發(fā)現(xiàn)能增強(qiáng)阿霉素和吉非替尼等藥物效應(yīng)[17,20].然而,SchA對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的L-OHP敏感性的影響以及機(jī)制并不清楚.本研究顯示了低劑量(不影響結(jié)直腸細(xì)胞活性的劑量)的SchA即可表現(xiàn)出增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP的敏感性,提示了SchA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的L-OHP增敏效應(yīng).

本研究探索了SchA對(duì)L-OHP的增敏的機(jī)制.眾所周知,化療藥物常通過促使過量ROS生成來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡,同樣高水平的ROS也能提高化療藥物的殺傷效果[21].且已有直接的證據(jù)表明增強(qiáng)ROS生成水平能增加L-OHP對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞誘導(dǎo)的凋亡[22-24].本研究結(jié)果也顯示,相對(duì)于單用L-OHP處理組,在SchA+L-OHP聯(lián)用組結(jié)直腸細(xì)胞中ROS生成水平上升伴隨著凋亡增加,這一結(jié)果提示,SchA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中對(duì)L-OHP的增敏效應(yīng)是通過增強(qiáng)其誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)的凋亡來實(shí)現(xiàn)的.本研究進(jìn)一步對(duì)SchA增強(qiáng)L-OHP誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)下游的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的途徑進(jìn)行了探索.線粒體凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑之一.過量ROS蓄積可誘導(dǎo)線粒體膜電位下降、Cyt c釋放最終導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[22-24,25,26].本研究顯示,SchA在結(jié)直腸癌細(xì)胞中能促進(jìn)L-OHP誘導(dǎo)凋亡,表現(xiàn)為更低的線粒體膜電位(綠/紅熒光高)、Cyt c釋放增多、Bax和cleaved caspase-3表達(dá)增加以及Bcl-2表達(dá)降低,說明SchA能增強(qiáng)L-OHP誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào).

4 結(jié)論

總之,本研究表明SchA能增強(qiáng)L-OHP對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷作用,其機(jī)制可能與增加ROS生成以及啟動(dòng)線粒體凋亡相關(guān)信號(hào)有關(guān).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)是結(jié)直腸癌患者的一線化療藥物,但約30%-50%的患者對(duì)L-OHP敏感性不理想,因此,急需尋找能提高結(jié)直腸癌的L-OHP敏感性的策略.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

據(jù)報(bào)道,五味子甲素(schizandrin A,SchA)在不同種類的腫瘤細(xì)胞中可能具有化療增敏作用,而目前并不清楚其是否在結(jié)直腸癌中具有化療增敏作用.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究評(píng)估SchA對(duì)結(jié)直腸癌L-OHP敏感性的影響.

實(shí)驗(yàn)方法

用噻唑藍(lán)法篩選SW480和HT-29細(xì)胞的L-OHP的處理濃度后,再分別選用L-OHP以及SchA+L-OHP處理SW480和HT-29細(xì)胞24 h.分別檢測(cè)處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)含量、線粒體膜電位以及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

SchA能增加L-OHP對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的殺傷效力和細(xì)胞內(nèi)ROS蓄積并增強(qiáng)細(xì)胞中線粒體凋亡信號(hào)活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

SchA能增強(qiáng)結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)L-OHP敏感性.

展望前景

SchA可能是潛在的可應(yīng)用于結(jié)直腸癌患者L-OHP化療的增敏劑.