朱韜 陳巧玲 陶革方 黃衛(wèi)平

1.臺州市中心醫(yī)院（臺州學(xué)院附屬醫(yī)院）整形美容外科，浙江臺州 318000；2.浙江省臺州醫(yī)院特需病房，浙江臺州 317000

瘢痕疙瘩又稱結(jié)締組織增生，是創(chuàng)面愈合過程中膠原合成代謝持續(xù)活躍導(dǎo)致成纖維細胞和膠原過度增生的結(jié)果，呈腫瘤樣侵襲性生長[1]。手術(shù)切除、放療和激素是常用的治療方法，但治療效果差且常伴有復(fù)發(fā)[2]。由于瘢痕疙瘩的發(fā)病病因尚不清楚，因此，迫切需要了解瘢痕疙瘩形成的潛在機制，以探討新的治療靶點。微小RNA（microRNA，miRNA）在細胞增殖、分化等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個miRNA 參與瘢痕疙瘩的形成和生長[3]。此外，miRNA 也被認為是一種新型的細胞過程調(diào)控因子，參與成纖維細胞增生和細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，這些均與傷口愈合有關(guān)[4]。例如，過表達miR-21-5p 可促進瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblasts，KFs）的增生和遷移[5]。因此miRNA 在瘢痕疙瘩纖維化中發(fā)揮重要作用，可能成為基因治療的新靶點。miR-203a-5p是一種腫瘤抑制因子，與腫瘤細胞增生、遷移和侵襲有關(guān)[6]。但關(guān)于miR-203a-5p 在瘢痕疙瘩中的作用和確切分子機制報道較少。B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）/beclin-1 通路是調(diào)控細胞自噬凋亡的重要通路，且被證明與KFs的生長有關(guān)[7]。本研究擬檢測miR-203a-5p 對KFs細胞增生、遷移和凋亡的影響，并探討B(tài)cl-2/beclin-1通路在此過程中的作用，旨在為瘢痕疙瘩的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

KFs 細胞（中國科學(xué)院上海細胞庫）；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（天津灝洋生物有限公司PM1900429）；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、miRNA 陰性對照（miR negative control，miR-NC）（5'-UUCUCCGAACGAACGUGUCAC-3'）、miR-203a-5p 抑制劑（5'-CCCUCCUCCUUGCUUGGGUUG-3'）和miR-203a-5p 模擬（5'-GUGAGGACUCGGGAG GUGGC-3'）（上海吉凱生物公司）；Trizol（美國Invitrogen 公司)；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence-PCR，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)）試劑盒（瑞士Roche 公司，SC-3187、SC-5490）；雙熒光素酶檢測試劑盒（美國Promega公司）；細胞計數(shù)試劑盒8（cell count kit 8，CCK-8）（美國Amresco 公司）；Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；RIPA 裂解液（北京索萊寶生物技術(shù)公司）；B 細胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 related X protein，Bax）、半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）、beclin-1、自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3Ⅱ（autophagy related protein light chain 3 Ⅱ microtubule associated protein 1，LC3Ⅱ）、膠原蛋白Ⅰ（CollagenⅠ）、β-actin和HRP 標記山羊抗鼠二抗（武漢博士德生物工程公司，批號：A2140、A0325、A1427、A0208、A1937、A0356、A1358、A2456）；Thermo CO2細胞培養(yǎng)箱和NanoDrop2000c 型蛋白核酸檢測儀（美國Thermo公司）；HBS-1096B 酶標儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司）；Real-time PCR 擴增儀（美國ABI 公司）；基質(zhì)膠和24 孔Transwell 小室（美國CORNING 科技有限公司）；BD 流式細胞儀和BIO-RAD 垂直電泳儀（美國BIO-RAD 公司）。

1.2 組織來源

因外傷導(dǎo)致肩部瘢痕疙瘩需手術(shù)切除的10 例瘢痕疙瘩組織離體標本及周圍少許正常皮膚組織（購自上海芯超生物科技有限公司），其中男8 例，女2例，年齡22～43 歲，平均（29.25±18.61）歲，所有標本取材后立即放入液氮保存。

1.3 實驗方法

1.3.1 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測組織中miR-203a-5p和Bcl-2mRNA 表達 取瘢痕疙瘩組織和正常皮膚組織，剪碎后加入1ml Trizol 進行總RNA 的提取，根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA 轉(zhuǎn)化為cDNA，根據(jù)熒光定量PCR 試劑盒說明制備20μl 反應(yīng)體系，Real-time PCR 擴增儀中進行擴增：預(yù)變性95℃ 5s、預(yù)變性95℃ 30s、擴增60℃ 44s、40 個循環(huán)、采集熒光61℃，采用2-△△Ct法計算miR-203a-5p和Bcl-2 mRNA 的相對表達量（以U6 作為內(nèi)對照）。引物為miR-203a-5p 上游引物：5'-GCGAGCACAGA ATTAATACGAAC-3'，下游引物：5'-GCGAGCACAG AATTAATACGAAC-3'；Bcl-2 上游引物：5'-GACTTC GCCGAGATGTCCAG-3'，下游引物：5'-GTGCAGGT GCCGGCAGG-3'；U6 上游引物：5'-CTCGCTTCGGC AGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3'。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染及組別 常規(guī)細胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)KFs 細胞，實驗分為對照組、miR-NC 組、miR-203a-5p 抑制劑組和miR-203a-5p 模擬組。對照組細胞不進行處理；miR-NC 組、miR-203a-5p 抑制劑組和miR-203a-5p 模擬組按lipofectamine 2000 說明書方法分別將miR-NC、miR-203a-5p 抑制劑和miR-203a-5p 模擬轉(zhuǎn)染到KFs 細胞，48h 后進行檢測。

1.3.3 熒光素酶報告基因檢測 將Bcl-2 野生型/突變型（WT/MUT）與miR-203a-5p NC/抑制劑/模擬轉(zhuǎn)染到對數(shù)生長期KFs 細胞，轉(zhuǎn)染48h 后用雙熒光素酶檢測試劑分析熒光素酶活性。

1.3.4 CCK-8法檢測細胞增殖率 按照1.3.1方法轉(zhuǎn)染KFs 細胞后接種于96 孔板中，在實驗結(jié)束前4h向培養(yǎng)板中加入CCK-8（10μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)4h，測定吸光度值，計算細胞增生率[細胞增生率=（實驗組A值-空白孔A值）/（空白對照組A值-空白組A值）。

1.3.5 Transwell 法檢測細胞遷移能力 按照1.3.1 方法轉(zhuǎn)染KFs 細胞后接種于Transwell 小室中，小室加入10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，48h 后取出小室，用甲醛固定10min，然后用結(jié)晶紫染色30min，沖洗干凈后計數(shù)紫色染色的細胞數(shù)。

1.3.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 按照1.3.1 方法轉(zhuǎn)染KFs 細胞后接種于6 孔板中，48h 后收獲細胞，離心棄上清，分別加入5μl 膜聯(lián)蛋白（Annexin V-FITC）與碘化丙啶，充分混勻后室溫避光孵育20min，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.7 Western blot 法檢測細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、beclin-1、LC3Ⅱ和collagen Ⅰ蛋白表達 轉(zhuǎn)染KFs細胞后接種于6 孔板中，48h 后收獲細胞，離心棄上清，加入RIPA 裂解液100μl，冰上裂解30min 進行細胞總蛋白提取，采用BIO-RAD 濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)SDS-PAGE膠進行電泳（20μg/孔），切膠、轉(zhuǎn)膜、封膜后將膜與Bcl-2（1:200）、Bax（1:200）、Caspase-3（1:400）、beclin-1（1:300）、LC3Ⅱ（1:500）、collagenⅠ（1:400）和β-actin（1:500）進行孵育，4℃過夜，用HRP 標記山羊抗小鼠IgG 二抗（1:5000）在室溫下孵育30min，滴加電化學(xué)發(fā)光劑，進行顯色，采集圖像進行分析（以β-actin 作為內(nèi)對照）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理分析，其中計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-203a-5p 對Bcl-2 的靶向調(diào)節(jié)作用

通過生物信息學(xué)網(wǎng)站（www.Targetscan.org）檢索發(fā)現(xiàn)，miR-203a-5p 與Bcl-2 有潛在的結(jié)合位點；同時，熒光素酶報告顯示，轉(zhuǎn)染miR-203a-5p-模擬可明顯降低Bcl-2-WT 的熒光素酶活性，對Bcl-2-MUT 沒有影響，而miR-203a-5p-抑制劑則表現(xiàn)出相反作用，表明miR-203a-5p 與Bcl-2 存在靶向調(diào)節(jié)作用，見圖1、表1。

圖1 Targetscan 預(yù)測miR-203a-5p 與Bcl-2 mRNA 的互補配對系列

表1 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（，n=9）

表1 熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.2 miR-203a-5p 和Bcl-2 mRNA 在組織中的表達

瘢痕疙瘩中 miR-203a-5p 表達低于正常皮膚[（0.54±0.05）vs.（0.89±0.15）]（t=6.641，P＜0.001）；瘢痕疙瘩中 Bcl-2 mRNA 表達高于正常皮膚[（1.02±0.17）vs.（0.73±0.08）]（t=4.567，P＜0.001）。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞增殖、遷移和凋亡的影響

與對照組和miR-NC 組比較，miR-203a-5p 抑制劑組增殖率和遷移細胞數(shù)增加，細胞凋亡率降低（P＜0.05）；與對照組、miR-NC 組和miR-203a-5p抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組增殖率和遷移細胞數(shù)降低，細胞凋亡率增加（P＜0.05），見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞增殖、遷移和凋亡的影響（，n=9）

表2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞增殖、遷移和凋亡的影響（，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白表達的影響

與對照組和miR-NC 組比較，miR-203a-5p 抑制劑組Bcl-2 蛋白表達升高，Bax 和Caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.05）；與對照組、miR-NC 組和miR-203a-5p抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組Bcl-2 蛋白表達降低，Bax 和Caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05），見表3。

表3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的影響（，n=9）

表3 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞Bcl-2、Bax 和Caspase-3 蛋白的影響（，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

2.5 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白表達的影響

與對照組和miR-NC 比較，miR-203a-5p 抑制劑組beclin-1、LC3Ⅱ和collagen Ⅰ蛋白表達升高（P＜0.05）；與對照組、miR-NC 組和miR-203a-5p 抑制劑組比較，miR-203a-5p 模擬組beclin-1、LC3Ⅱ和Collagen Ⅰ蛋白表達降低（P＜0.05），見表4 和圖2。

表4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白的影響（，n=9）

表4 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白的影響（，n=9）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與miR-NC 組比較，#P＜0.05；與miR-203a-5p 抑制劑組比較，ΔP＜0.05

圖2 轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 對KFs 細胞beclin-1、LC3Ⅱ和collagenⅠ蛋白的影響

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，在瘢痕疙瘩形成過程中，miRNA 可調(diào)控成纖維細胞增生、遷移、凋亡和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transformation，EMT）。例如，下調(diào)miR-637 可通過靶向瘢痕疙瘩中的smad3 促進增生和轉(zhuǎn)移[8]。瘢痕疙瘩中過量的ECM 成分，如膠原蛋白、纖維凝集素、彈性蛋白及蛋白酶抑制劑，是由KFs 積累所致。KFs 在病理性瘢痕中起重要作用，其增生促進顆粒組織形成，導(dǎo)致膠原合成增加[9]。過多的KFs 細胞增生和KFs細胞凋亡不足導(dǎo)致瘢痕疙瘩，但其發(fā)病機制尚不清楚。因此，進一步研究瘢痕疙瘩的細胞和分子機制可能對改善瘢痕疙瘩的臨床治療策略至關(guān)重要。MiR-152-5p 通過調(diào)控人KFs 細胞中smad3 的表達，抑制增生、遷移，促進凋亡[10]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-203a-5p可能作為一種纖維化抑制因子，在瘢痕疙瘩組織中顯著下調(diào)。此外，KFs 細胞參與了瘢痕疙瘩中ECM（如Collagen）沉積[11]。同時，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-203a-5p 能顯著降低KFs 細胞中Collagen Ⅰ表達，提示miR-203a-5p 過表達能抑制瘢痕疙瘩的形成，隨后的功能性實驗也證實了上述結(jié)果，miR-203a-5p 過表達能抑制KFs 細胞增生和遷移，促進KFs 細胞凋亡，抑制miR-203a-5p 表達則作用相反。然后通過targetscan 分析確定Bcl-2為miR-203a-5p 的潛在靶標，熒光素酶報告證實了miR-203a-5p 與Bcl-2 存在靶向調(diào)節(jié)作用。

凋亡調(diào)控已被證明在傷口愈合過程中起重要作用，且主要與增生細胞清除有關(guān)。在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕標本中均發(fā)現(xiàn)了凋亡抑制蛋白Bcl-2 的過表達，加之抗凋亡蛋白Bax 表達的缺失，可導(dǎo)致瘢痕疙瘩源性KFs 細胞增生和細胞存活時間延長[12]。Bcl-2拮抗劑的使用部分阻止了腸道KFs細胞的纖維形成，并降低了轉(zhuǎn)化生子因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)的KFs 細胞分化相關(guān)因子的表達，成為克羅恩病相關(guān)纖維化潛在治療的選擇[13]。同時，miR-30a-5p 過表達可通過靶向Bcl-2 誘導(dǎo)KFs細胞凋亡[14]。本研究在瘢痕疙瘩組織中檢測到Bcl-2 mRNA 表達顯著上調(diào)，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 模擬后抑制Bcl-2 表達，促進Bax 和Caspase-3 表達，誘導(dǎo)KFs 細胞凋亡。

細胞自噬和細胞凋亡常發(fā)生在同一細胞中，決定細胞命運，KFs 細胞抗凋亡能力的增強是瘢痕疙瘩復(fù)發(fā)和侵襲的重要致病機制[15]。然而，目前關(guān)于KFs細胞自噬的相關(guān)報道較少。目前，beclin 1 在自噬領(lǐng)域的研究越來越廣泛。在人類乳腺癌細胞中，beclin 1隨著自噬體的增加而表達降低，促進細胞增生。此外，促進beclin-1 基因表達可抑制體外細胞自噬水平，抑制細胞增生[16]。最近的研究表明，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2 可以抑制自噬，通過BH3 結(jié)構(gòu)域，Bcl-2與beclin 1 結(jié)合形成復(fù)合體，在自噬過程中被破壞[17]。同時，具有BH3 結(jié)構(gòu)域的Bcl-2 家族成員之間（如Bax）通過與beclin 1 結(jié)合，抑制Bcl-2 與beclin 1結(jié)合，促進細胞自噬[18]。自噬過程中，LC3 結(jié)合體系的形成負責囊泡的延伸。LC3 通常由泛素產(chǎn)生，其殘基經(jīng)自噬相關(guān)基因4A（autophagy associated gene 4A，ATG4A）同源物催化作用暴露在囊泡膜表面，并在細胞質(zhì)中形成LC3Ⅰ[19]。LC3Ⅰ可特異性結(jié)合磷脂酰乙醇胺在囊泡膜表面，最終形成LC3Ⅱ，并與自噬水平呈正相關(guān)。輻射通過下調(diào)自噬相關(guān)誘導(dǎo)因子beclin-1 和阻止LC3Ⅱ的形成來抑制自噬[20]。本研究中，通過轉(zhuǎn)染miR-203a-5p 模擬后抑制KFs 細胞中beclin-1、LC3Ⅱ和CollagenⅠ蛋白表達。

綜上所述，miR-203a-5p 在瘢痕疙瘩組織中低表達，通過基因干擾技術(shù)促進miR-203a-5p 表達能靶向抑制Bcl-2/beclin-1 通路的激活，抑制KFs 細胞增生和遷移，同時促進KFs 細胞凋亡。