戢晴 陶海英 吳海燕 丁國明

1.臺州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江臺州 318020；2.臺州市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，浙江臺州 318020；3.臺州市第一人民醫(yī)院感染科，浙江臺州 318020；4.臺州市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，浙江臺州318020

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種以尿蛋白升高、腎小球濾過率下降、心血管病風(fēng)險增加為特征的疾病[1,2]。DN 是糖尿病終末期腎衰竭的主要表現(xiàn)，具有較高的發(fā)病率和致死率[3]。足細(xì)胞是位于腎小球基底膜外側(cè)的一種高度分化的細(xì)胞，當(dāng)受到免疫或非免疫介導(dǎo)的介質(zhì)攻擊時，足細(xì)胞受損導(dǎo)致蛋白質(zhì)丟失[4]。研究證實，胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，F(xiàn)etuin-A）在蛋白酶活性的調(diào)節(jié)和炎癥因子分泌的抑制中可以發(fā)揮一定的生物學(xué)作用[5,6]。相關(guān)研究表明，F(xiàn)etuin-A 高表達(dá)會導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，可能參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展過程，但其具體機(jī)制尚不清楚。因此，本文旨在探討Fetuin-A 調(diào)控糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

選取健康SD 成年大鼠15 只[山東大學(xué)，實驗動物許可證號：SYXK（魯）2020 0022]，鼠齡6～10 周，體質(zhì)量（200±10）g，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，經(jīng)動物倫理委員會批準(zhǔn)（倫理審批號：WYZLL[2016]1601）。喂養(yǎng)7d，將枸櫞酸緩沖液（滁州仕諾達(dá)生物科技有限公司，貨號：SND2872）0.01mol/L 注射50mg/kg STZ 大鼠建模，連續(xù)3d。血糖＞16.7mmol/L 則建模成功，且建模成功大鼠已表現(xiàn)出典型糖尿病腎病表現(xiàn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 大鼠麻醉，取仰臥位，剪開腹壁，分離腹主動脈。采集主動脈血5ml，3000 轉(zhuǎn)/min 離心10min，取血清，-80℃保存?zhèn)溆?；取左腎生理鹽水沖洗，取0.5cm 厚腎皮質(zhì)組織置于4%多聚甲醛（碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品編號：P0099-100ml）固定，將組織塊置于2.5%戊二醛（北京百奧萊博科技有限公司，貨號：Y12820）4℃冰箱保存待檢。

1.2.2 足細(xì)胞獲取和培養(yǎng)方法 取出細(xì)胞，37℃水浴解凍，于離心管1000 轉(zhuǎn)/min 離心10min，棄去上清液。100m2的培養(yǎng)瓶，37℃孵育24h，PBS 洗滌3次，加入100U/mL 的干擾素γ（interferon，IFN-γ）的無血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（RPMI）1640 培養(yǎng)液，于33℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，每3d 換一次培養(yǎng)液，倒置顯微鏡觀察其生長變化。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將培養(yǎng)好的細(xì)胞按5×105個每孔，接于6 孔板中，生長至75%轉(zhuǎn)染。將培養(yǎng)好的細(xì)胞分成3 組，每組8 孔，空白組不作處理，其余兩組用Fetuin-A 抑制劑和Fetuin-Apmimic 進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.4 引物序列 采用Real Time RT-PCR 技術(shù)檢測3 組細(xì)胞Sp1、RIPK1、MLKL、WT1 表達(dá)。95℃預(yù)反應(yīng)30s，然后95℃ 5s、60℃ 30s、40 個循環(huán)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡 應(yīng)用胰酶消化細(xì)胞，經(jīng)PBS 沖洗2 次，收集細(xì)胞。加入預(yù)冷70%乙醇，于4℃固定過夜。離心收集細(xì)胞，加入溴化乙錠（50μg/ml），RNase A（100μg/ml），4℃避光孵育30min。采用高通量流式細(xì)胞儀（生產(chǎn)廠家：德國美天旎生物技術(shù)有限公司；型號：Analyzer 16）觀察細(xì)胞凋亡。

1.2.6 腎組織Fetuin-A、TNF-α、MLKL、RIPK1 水平檢測 采用免疫組化法檢測腎組織胎球蛋白-A（fetoglobulin-a，F(xiàn)etuin-A）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、混合系列蛋白激酶結(jié)構(gòu)域蛋白（mixed-lineage kinase domain-like protein，MLKL）、受體相互作用蛋白激酶1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）水平。

1.2.7 Western blot 法檢測 測定WT1、Sp1 水平，了解蛋白表達(dá)水平WT1、Sp1 相對表達(dá)量，用β-actin做蛋白內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），即F檢驗，應(yīng)首先做方差齊性檢驗，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組Fetuin-A 表達(dá)比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調(diào)Fetuin-A組Fetuin-A 表達(dá)較低，上調(diào)Fetuin-A 組Fetuin-A 表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與下調(diào)miR-125b 組比較，上調(diào)miR-125b 組miR-125b 表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 3 組Fetuin-A 表達(dá)比較（）

表2 3 組Fetuin-A 表達(dá)比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.2 3 組足細(xì)胞增殖、凋亡比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調(diào)Fetuin-A組細(xì)胞吸光度值、凋亡率較低，上調(diào)Fetuin-A 組細(xì)胞吸光度值、凋亡率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，上調(diào)Fetuin-A組細(xì)胞吸光度值、凋亡率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 3 組足細(xì)胞增殖、凋亡比較（）

表3 3 組足細(xì)胞增殖、凋亡比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.3 Fetuin-A 對3 組腎功能相關(guān)指標(biāo)的影響

24h、48h、72h 與對照組比較，下調(diào)Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達(dá)較低，上調(diào)Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，上調(diào)Fetuin-A 組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達(dá)較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4。

表4 Fetuin-A 對3 組TNF-α、MLKL、RIPK1 指標(biāo)的影響（）

表4 Fetuin-A 對3 組TNF-α、MLKL、RIPK1 指標(biāo)的影響（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

2.4 3 組細(xì)胞WT1 信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

24h、48h、72h 與對照組比較，下調(diào)Fetuin-A 組WT1、Sp1 表達(dá)均較高，上調(diào)Fetuin-A 組WT1、Sp1表達(dá)均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，上調(diào)Fetuin-A 組WT1、Sp1 表達(dá)較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5 和圖1。

表5 3 組細(xì)胞WT1 信號通路蛋白相對表達(dá)量比較（）

表5 3 組細(xì)胞WT1 信號通路蛋白相對表達(dá)量比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與下調(diào)Fetuin-A 組比較，#P＜0.05

圖1 各組細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

足細(xì)胞是一種高度分化的終末細(xì)胞，在腎小球功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[7,8]。Fetuin-A 磷酸化后其發(fā)揮生物學(xué)特性，可誘導(dǎo)胰島素抵抗，抑制異位鈣沉積，在炎癥反應(yīng)及脂質(zhì)代謝過程中起重要作用，誘導(dǎo)TNF-α 等促炎因子的表達(dá)，引起機(jī)體或組織發(fā)生慢性炎癥[9-11]。TNF-α 可促進(jìn)炎癥因子分泌，加劇炎癥的作用[12]。相關(guān)研究證實，F(xiàn)etuin-A 能抑制TGF-β 的信號通路，誘發(fā)低度炎癥，造成足細(xì)胞損傷，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)展[13]。因此，本文旨在探討Fetuin-A 調(diào)控糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制。

胰島素可啟動胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，活化胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-1）、胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS-2）、PI3K蛋白激酶等多種信號分子，影響胰島素的發(fā)揮[14]。Fetuin-A 可抑制胰島素受體自身磷酸化抑制，增加足細(xì)胞分泌的負(fù)擔(dān)[15]。本研究結(jié)果顯示，足細(xì)胞凋亡數(shù)量在上調(diào)Fetuin-A 組顯著升高，下調(diào)Fetuin-A組足細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯減少，說明Fetuin-A 可能通過抑制機(jī)體低度炎性反應(yīng)，抑制脂聯(lián)素基因表達(dá)，誘導(dǎo)胰島素抵抗，引起足細(xì)胞損傷和功能惡化及血管內(nèi)皮生長因子過量表達(dá)等途徑參與糖尿病及糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。Caspase-8 的激活與否是凋亡或壞死性凋亡的關(guān)鍵，當(dāng)Caspase-8 激活受抑制時，RIPK1 去泛素化從而招募RIPK3、RIPK1/RIPK3 復(fù)合體招募并磷酸化MLKL，最終MLKL 孔通過允許離子流入、細(xì)胞膨脹和膜溶解導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡并誘發(fā)炎性反應(yīng)，因此RIPK1 與RIPK3 形成復(fù)合體以及MLKL 的磷酸化是壞死性凋亡的特異標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡為糖尿病腎損傷的一種重要細(xì)胞死亡模式，不依賴Caspase 激活且具有典型壞死樣形態(tài)，其通過RIPK1/MLKL 途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)。壞死性凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種新形式，其途徑主要由TNF-α 激活，RIPK1 去泛素化從而招募受體相互作用蛋白激酶RIPK3，二者磷酸化MLKL，導(dǎo)致壞死性細(xì)胞死亡[16,17]。

足細(xì)胞數(shù)量能反映足細(xì)胞丟失和增殖之間的平衡狀態(tài)[18]。WT1 表達(dá)于足細(xì)胞核，反映足細(xì)胞數(shù)量及損傷程度，是足細(xì)胞的特異性標(biāo)志[19]。Sp1 是一個通用的轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育、細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用[20]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)Fetuin-A組TNF-α、MLKL、RIPK1 表達(dá)水平均升高，WT1、Sp1 表達(dá)水平則降低，說明Fetuin-A 過表達(dá)影響TNF-α、MLKL、RIPK1 表達(dá)水平，而三者水平升高是足細(xì)胞減少的重要原因，從而說明Fetuin-A 可以通過引起足細(xì)胞損傷，促進(jìn)糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，F(xiàn)etuin-A 靶向作用于Sp1 使足細(xì)胞損傷和功能失常。