鄧斌

安順市人民醫(yī)院 貴州 安順 561000

在院內(nèi)感染的研究中，一個(gè)很重要的問(wèn)題，就是如何確定感染源和傳播途徑只有明確病原菌的感染方式，才能采取有效的預(yù)防和控制措施，因而對(duì)微生物的鑒定和分類就不能僅限于種間水平，還必須深入到種內(nèi)即亞種，以便更精確了解其流行病學(xué)意義。以往真菌的分型方法主要嵌賴于血清型、酵母殺菌系統(tǒng)，抗性譜。等生物學(xué)方法，但這些方法易受環(huán)境及人為因素的影響而缺乏滿意的穩(wěn)定性和重復(fù)性。另外，生物學(xué)方法也不能精細(xì)分型，分辨率低，影響了其流行病學(xué)及致病力的研究。近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌病毒基因水平的研究。目前已有一些分子生物學(xué)技術(shù)的方法如限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)、脈沖場(chǎng)電泳核型分析(PFGE)、基因探針雜交分析(SHA)及隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA—PCR多態(tài)性分析(RAPD)等應(yīng)用于真菌研究，尤其是念珠菌基因分型的研究[1-4]。這些方法與生物學(xué)分型方法相比，具有良好的穩(wěn)定性，重復(fù)性及高分辨率，現(xiàn)將其有關(guān)研究動(dòng)態(tài)綜述如下。

1.DNA基因分型對(duì)于流行病學(xué)研究具有重要的指導(dǎo)意義

無(wú)論采用何種分型方法，都必須有明確的調(diào)查目的，即(1)確定爆發(fā)流行；(2)確定傳播途徑，評(píng)價(jià)預(yù)防措施；(3)監(jiān)測(cè)某些有害致病菌。這些分型方法的基本原理是，相同的菌株具有相同的DNA指紋圖譜，而不同菌種，其DNA指紋圖譜也不同如果病人自身不同時(shí)期或不同解剖部位分離出相同的基因型菌株，且病人之間的基因型不同，多屬于內(nèi)源性感染。定植株與感染株基因型相同，且定植株先于感染株，也提示為內(nèi)源性感染。如果從不同病人身上、工作人員及環(huán)境中同時(shí)分離出相同的基因型菌株，則多為交叉感染。而這些結(jié)論都必須依靠良好穩(wěn)定性、重復(fù)性及高分辨率的分型方法[5-7]。

2.常用的幾種分型方法

限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)：就是對(duì)DNA分子用不同的內(nèi)切酶處理后，通過(guò)瓊脂糖電泳所產(chǎn)生的DNA片段的大小進(jìn)行分析，便可推論出所用酶在該DNA分子中的切點(diǎn)數(shù)目以及它們的位置關(guān)系，了解菌種在基因水平上的相同或不同，從本質(zhì)上區(qū)別種問(wèn)差異用限制性內(nèi)切酶分析產(chǎn)生的基因多態(tài)性稱為RFLP1987年Scherer等首先將這種方法用于念珠菌的研究。用EcoRl對(duì)6株白色念株菌DNA進(jìn)行酶切分析，可見(jiàn)到許多條帶(>100)，最明顯的帶型有3條對(duì)同一株菌反復(fù)酶切分析，帶型不發(fā)生改變，證明其具有良好的重復(fù)性。又將同一株菌大約傳代420次后酶切分析，傳代前后具有相同的酶切圖譜，顯示了良好的穩(wěn)定性預(yù)測(cè)該方法在研究真菌感染方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。目前用于真菌研究的限制性內(nèi)切酶已選20余種，常用的有EcnRJ、Mspl、Hindi、BanHI等。EcoRI價(jià)格低，來(lái)源方便，是一種最常用的酶，其對(duì)白色念珠菌酶切可產(chǎn)生4～16個(gè)基因型。Vazqauez等采用EcoRI和Mspl對(duì)白色念珠菌進(jìn)行酶切。EcoRI酶切產(chǎn)生6個(gè)基因型，MspI產(chǎn)生6個(gè)基因型，兩種酶聯(lián)合分型為17個(gè)基因型，說(shuō)明聯(lián)合酶切可提高分辨率。Delabesse等比較了RFLP和PFGE兩種方法，Rea—gan等比較了RFLP和SHA兩種分型方法對(duì)相同菌株的分型圖譜，認(rèn)為RFLP分別比電泳核型(EK)、SHA所產(chǎn)生的基因型多，分辨率高，更能精細(xì)區(qū)別不同來(lái)源的菌株。RFLP不需要特殊的實(shí)驗(yàn)儀器，一般實(shí)驗(yàn)室條件即可完成。但RFLP需提取大量完整的DNA，同時(shí)，電泳帶型易受DNA提取過(guò)程、電泳條件的影響，是其固有的缺點(diǎn)[8-12]。

脈沖場(chǎng)電泳核型分析(PFGE)：這也是常甩的分型方法。一般情況下，普通瓊脂糖凝腔電泳只能分離50kb以下的DNA片段，且它是單方向電場(chǎng)，較大的DNA分子容易陷在凝膠孔里而停滯，而PFGE至少有兩個(gè)方向的電場(chǎng)，在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)交替變換，使大分子DNA在行進(jìn)中不斷改變tl己的形態(tài)及遷移方向，從而繞過(guò)細(xì)小的凝膠孔隙得以分離。PFGE可分析2Mb以上的DNA分子，用PFGE得到的全基因染色體組型稱為電泳核型(EK)對(duì)病原體而言，EK分析特別適用于基因組含若干條染色體的低等真核微生物或原蟲(chóng)，它無(wú)需用限制性內(nèi)切酶消化和探針雜交，就可方便地從EK的差異區(qū)別不同的菌種。念珠菌有4～10條染色體。EK分析帶型清晰易辨，容易比較，能夠區(qū)別種間差異，是一種較好的流行病學(xué)研究方法，但與其它方法相比，它需要較昂貴的儀器，DNA的制備及PFGE過(guò)程也均較費(fèi)時(shí)[13-15]。

基因探針雜交分析(SHA)：目前用于真菌：尤其是念珠菌感染研究的基因探針.包括全染色體基因探針、線粒體基因探針、白色念珠菌肌動(dòng)蛋白基因探針和白色念珠菌2.9kb、27A、C3a、pBD40特異性探針等。在菌種的鑒定上，基因探針敏感性及特異性高，帶型簡(jiǎn)單易解釋，但在種間分型的應(yīng)用上，不如RFLP和EK方法分辨率高。目前還沒(méi)有人工合成探針，且DNA抽提、酶切、片段標(biāo)記等制備過(guò)程繁瑣，不適用于臨床上大量標(biāo)本的流行病學(xué)調(diào)查[16-19]。

隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，隨機(jī)引物擴(kuò)增PCR多態(tài)性分析(RAPD)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的種間分型方法。通過(guò)選擇單條或多條片段長(zhǎng)度為8～10個(gè)堿基寡核苷酸引物，用PCR的方法對(duì)標(biāo)本底物擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳分離出不同長(zhǎng)度的片段構(gòu)成PCR指紋圖譜。Belkum對(duì)白色念珠菌的RAPD、EK、EcoRI和HindI酶切的RFIP、27A探針的基因圖譜進(jìn)行比較分析顯示，RAPD能分辨13個(gè)基因型，而其它方法分別產(chǎn)生8～12個(gè)基因型，因而認(rèn)為RAPD具有較高的分辨率。RAPD最明顯的優(yōu)點(diǎn)是不需要抽提大量的DNA，從臨床標(biāo)本中可直接檢測(cè)，并可同時(shí)進(jìn)行種間鑒定和種內(nèi)分型，而其它方法則需要在鑒定出種屬的基礎(chǔ)上再分型，所以RAPD更快速、簡(jiǎn)便，是一種具有發(fā)展前途的種間分型方法[20-23]。

3.分子生物學(xué)技術(shù)在真菌流行病學(xué)調(diào)查方面的應(yīng)用

Pitter等用EK法研究了致病酵母菌在危重病人寄生的縱向和橫向模式。他們?cè)?個(gè)月內(nèi)前瞻性地從29例危重病人身上分離出322株念珠菌，這些菌株分離自多個(gè)解剖部位不同時(shí)期的同一部位，每一病人分離出的菌株具有同一種EK型，即使取自不同部位或經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(長(zhǎng)達(dá)140天)也是如此，其中8例患者發(fā)生真菌菌血癥，其定植株與感染株的EK型相同.且定植先于感染Reagan等對(duì)骨髓移植和血液病患者進(jìn)行調(diào)查，對(duì)16例念珠菌感染病人的分離株進(jìn)行分析，其中15例病人定植株與感染株有相同的基因型，而10／13(81)病人之間具有不同的基因型。以上研究資料證明危重病人真菌感染多由內(nèi)源性感染引起.感染源來(lái)自病人自身定植菌株[24]。

雖然許多院內(nèi)念珠菌感染是由內(nèi)源性感染引起，但真菌外源性感染也是不可忽視的問(wèn)題。Sanchez等“對(duì)一所醫(yī)院重點(diǎn)監(jiān)護(hù)室(ICU)病區(qū)和骨髓移植病區(qū)的89例患者進(jìn)行了前瞻性調(diào)查，5例病人發(fā)生近平滑念珠菌感染，這5例病人入院時(shí)均無(wú)近平滑念珠菌定植。分別從4名工作人員的手及環(huán)境中分離出該致病菌。用RFLP分析表明，4例病人、3名工作人員及環(huán)境中具有該菌相同的基因型，說(shuō)明近平滑念珠菌感染是由間接接觸傳播的。Girardin等對(duì)2例侵襲性曲霉菌感染病人分離株及環(huán)境中分離株用Southern斑點(diǎn)印跡雜交分析顯示.病人感染與空氣污染有關(guān)，空氣傳播可能是曲霉菌感染的傳播方式。Voss和Romano等分別對(duì)兩起外科ICU病區(qū)念珠菌爆發(fā)感染進(jìn)行調(diào)查.從病人不同感染部位、病人使用物品、工作人員手和咽部分離出白色念珠菌。用RFLP分型分析，認(rèn)為爆發(fā)流行是因間接接觸引起的交叉感染，工作人員的手是傳播媒介，提示洗手是預(yù)防真菌交叉感染必不可少的措施[25-26]。

對(duì)某些特定真菌進(jìn)行基因水平分型是流行病學(xué)研究的重要工具.它將對(duì)真菌感染的預(yù)防和控制具有重大指導(dǎo)意義。今后的研究方向應(yīng)對(duì)分型方法統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)條件和操作方法，并建立統(tǒng)一的分型標(biāo)準(zhǔn)。