徐新娟，馮玉丹，吳靜，羅慶云

（1.河南科技學院/現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.南京農(nóng)業(yè)大學園藝學院，南京 210095）

0 引言

復雜多變的自然環(huán)境中存在各種限制植物生長發(fā)育的非生物脅迫因子，如干旱、鹽漬、高低溫、土壤重金屬污染等等，嚴重影響植物的地理分布、限制作物產(chǎn)量并威脅生產(chǎn)安全，越來越多極端天氣的出現(xiàn)更加劇非生物脅迫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響[1-2]。植物響應非生物脅迫產(chǎn)生的一系列反應能夠及時、高效地應對環(huán)境變化[3]，通過激活抗氧化系統(tǒng)以盡量避免嚴重的氧化傷害，具體表現(xiàn)為體內(nèi)抗氧化酶活性增強、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)數(shù)量增多以及抗逆基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[4]。如何感受和響應非生物脅迫是一個根本性的生物學問題，植物必須及時預測環(huán)境變化并做出積極有效的響應[5]。提高植物抵抗非生物脅迫能力對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境可持續(xù)性具有極其重要的意義。

甜葉菊（Stevia rebaudianaBert.）又名甜菊、甜草、甜茶，是雙子葉植物綱、菊科、甜葉菊屬的多年生藥用草本植物，也是世界第三大天然糖源植物，其葉片富含的甜菊糖苷（Steviol glycosides,SGs）具有高甜度（蔗糖的250～450 倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）、易溶解、性質(zhì)穩(wěn)定（耐酸堿及高溫）且不被人體吸收等特點，適應于糖尿病、肥胖癥及小兒齲齒等患者，作為代糖品廣泛應用于醫(yī)藥、食品、飲料和保健品等行業(yè)，具有非常好的發(fā)展前景[6]。甜菊糖苷是一類由苷類組成的混合物，主要成分有甜菊苷（Stevioside,STV）、瑞鮑迪苷系列（Rebaudioside A、B、C、D、E 等）和杜爾可苷系列（Dulcoside），化學結(jié)構(gòu)均為四環(huán)二萜類化合物，屬于植物次生代謝產(chǎn)物的范疇[7]。研究表明，次生代謝與植物抗性及品質(zhì)密切相關[8]，植物通過提高次生代謝產(chǎn)物提高自身保護和生存競爭能力，環(huán)境脅迫顯著刺激植物次生代謝產(chǎn)物的積累[9]。如非生物脅迫誘導劑—過氧化氫（H2O2）誘導的氧化應激反應能夠促進甜葉菊SGs 的大量積累[10]，納米粒子作為植物非生物脅迫誘導因子也對甜菊糖苷的積累發(fā)揮著重要作用，當培養(yǎng)基中氧化鋅納米粒子濃度為1 mg/L時，RA和STV含量達到最大值[11-12]，這表明甜菊糖苷參與植物抗逆的環(huán)境應答過程。

我國擁有世界最大的甜葉菊種植面積，也是全球最大的甜菊糖苷生產(chǎn)國和出口國，出口量占全球80%以上。隨著甜菊糖苷市場需求的不斷增加，甜葉菊種植面積也逐年擴大，在江蘇、江西、甘肅、黑龍江、新疆、內(nèi)蒙等地均有大面積種植。筆者在國內(nèi)實地調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)的環(huán)境差異使得甜葉菊承受各種各樣的非生物脅迫，長期種植實踐中的弊端如栽培技術(shù)不規(guī)范、化肥農(nóng)藥過度投入、水肥管理不科學及長期連作等進一步加劇脅迫的傷害程度，這些都嚴重影響甜菊糖苷的合成與積累，制約該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，本文參考國內(nèi)外近十年來相關文獻，總結(jié)非生物脅迫如何影響甜菊糖苷的合成積累，并結(jié)合自身研究結(jié)果提出可行性建議，以期為生產(chǎn)上甜葉菊的良種選育及高效優(yōu)質(zhì)栽培提供理論參考。

1 水分脅迫

甜葉菊最早起源于南美洲的半濕潤區(qū)域，根淺、喜濕怕旱，水分脅迫一直是世界范圍內(nèi)甜葉菊生產(chǎn)中的主要脅迫因子，尤其是在以我國西北為主的干旱及半干旱地區(qū)。

1.1 干旱脅迫

水分虧缺造成的干旱導致大量活性氧自由基產(chǎn)生，嚴重損傷蛋白質(zhì)、質(zhì)膜、葉綠素等細胞組分，對植物生長、光合作用及產(chǎn)量品質(zhì)均產(chǎn)生不利影響[13]。已有研究中，輕度干旱脅迫（70%土壤相對含水量）可顯著增加決明子（Cassia obtusifoliaL.）指標性成分蒽醌類化合物的含量和產(chǎn)量[14]。干旱顯著抑制甜葉菊生長并降低干葉產(chǎn)量[15-16]，也顯著影響甜葉菊葉片糖苷含量[17]。以聚乙二醇（PEG）模擬干旱脅迫的試驗結(jié)果表明，5%～15%PEG 處理后甜葉菊葉片中STV、RA、RB、RC 及總苷含量顯著下降；干旱處理抑制糖苷相關核心基因的轉(zhuǎn)錄，與糖苷合成有關的內(nèi)根-貝殼杉烯合酶、內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶、內(nèi)根-貝殼杉烯酸羥化酶以及3 個依賴UDP 的糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT85C2、UGT74G1和UGT76G1）的轉(zhuǎn)錄水平均顯著下降[18]，這意味著有利于糖苷增加的干旱脅迫濃度可能低于5%PEG。溫室實驗結(jié)果表明，在土壤含水量接近60%田間持水量條件下甜葉菊生長良好且SGs 含量較高，RA/STV 比值也達到最大值[19]。這表明甜葉菊對輕度水分脅迫具有一定的耐受性，在生產(chǎn)上可指導缺水地區(qū)的適度灌溉。但除了受干旱脅迫程度影響外，甜菊糖苷對干旱脅迫的響應還受不同環(huán)境和實驗因素的影響，干旱調(diào)控糖苷合成的分子機制仍需進一步研究。

植物在水分脅迫發(fā)生后迅速啟動自身防御系統(tǒng)，干旱脅迫下甜葉菊葉片總氨基酸含量和總糖含量顯著增加[15]；葉片細胞保護酶如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）等活性隨脅迫程度加劇表現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，重度干旱脅迫下（土壤含水量為田間最大持水量的20%）脯氨酸含量急劇升高[20]。組培實驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中加入外源NO 供體硝普鈉（SNP）或者腐胺（Putrescine）均能顯著減輕干旱脅迫帶來的負面影響，二者聯(lián)合作用效果更加突出[21]。作為赤霉素生物合成抑制劑的三唑類化合物（Triazole）可以降低植株高度、葉面積及生物量[22]。2 mg/L 多效唑（Paclobutrazol）能夠部分恢復干旱脅迫下甜葉菊植株的重量，降低干旱脅迫對細胞脂質(zhì)過氧化的負作用，減輕細胞電解質(zhì)滲漏并降低丙二醛（MDA）含量，同時顯著增加甜菜堿、維生素E、脯氨酸和蛋白質(zhì)的含量[23]。此外，多效唑顯著緩解干旱脅迫下總甜菊糖苷含量的下降，這與多效唑增加甜菊葉中可溶糖產(chǎn)量和總抗氧化能力密切相關[24]。以上表明植物生長延緩劑（PGRs）通過誘導不同的耐受機制在調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的反應中發(fā)揮著重要作用。

1.2 澇害

水分過多造成地下組織氧氣供應不足，抑制根系呼吸從而影響植株地上部生長。澇害在甜葉菊生產(chǎn)中并不常見，但由于甜葉菊的生長周期為4—10 月份，江蘇、安徽等一些種植地區(qū)的季節(jié)性澇害會對甜葉菊生長發(fā)育產(chǎn)生影響。盆栽試驗結(jié)果表明，短期澇害對甜葉菊影響不大，但隨著澇害時間持續(xù)，葉綠素含量、凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）及單株干葉產(chǎn)量均顯著下降，胞間CO2濃度（Ci）呈上升趨勢[25]。這是由于根系受淹后，氣孔阻力加大或關閉進而氣孔導度下降，隨后導致Pn和Tr下降而Ci升高。目前關于澇害對甜菊糖苷的影響及甜葉菊減輕澇害的生理機制還不清楚。

2 溫度脅迫

溫度脅迫包括高溫脅迫和低溫脅迫，由高溫造成的傷害稱為熱害，典型的熱害癥狀為水漬狀燙傷斑點，甜葉菊在44 ℃高溫時會產(chǎn)生明顯的熱害癥狀[26]。冷害（零上低溫）直接抑制代謝酶或者基因表達重組而影響植物的新陳代謝和基因表達[27]。冷害較輕時菊花通過增加可溶性糖含量等滲調(diào)物質(zhì)及提高抗氧化酶活性來減輕脅迫傷害；當冷害持續(xù)并轉(zhuǎn)變?yōu)閮龊Γ阆碌蜏兀r，植株體內(nèi)的抗氧化酶活性顯著下降，MDA 含量顯著升高，光合能力也顯著降低[28]。甜葉菊原產(chǎn)于亞熱帶地區(qū)，屬于喜溫作物，但亦能耐一定的低溫，氣溫在20～30 ℃時最適宜生長。與25 ℃正常生長溫度相比，4 ℃低溫和44 ℃高溫顯著增加甜葉菊葉片中STV 含量，且STV 含量隨脅迫時間延長而增加；高溫還顯著促進RA與RC積累，低溫則起相反作用[26]。這表明輕微溫度逆境有利于甜菊糖苷的合成，但不同溫度脅迫對糖苷組分的影響存在差異。

3 鹽堿脅迫

近年來，我國甜葉菊種植面積逐漸向西北干旱及半干旱地區(qū)發(fā)展，該區(qū)域主要采用覆膜滴灌方式，基本滿足作物對水分的需求，但由于氣候干旱、蒸發(fā)強烈，容易產(chǎn)生土壤鹽漬化，導致土壤板結(jié)、肥力下降，土壤中高濃度鹽分（主要是Na+）導致離子毒性、高滲脅迫以及氧化損傷等次級脅迫，影響?zhàn)B分有效性、運輸和分布從而使植物營養(yǎng)失衡，如施肥不當更易加重鹽堿脅迫的傷害。

3.1 鹽堿脅迫對甜葉菊生長及甜菊糖苷生產(chǎn)的影響

甜葉菊對鹽分較為敏感[29-30]，在含鹽量0.6%的土壤中生長45 d 后甜葉菊植株全部死亡[31]。不同品種甜葉菊抵御鹽脅迫的能力也不同[32-34]，并且堿性鹽的抑制作用要高于中性鹽，因為堿脅迫在鹽脅迫的基礎上增加了高pH 脅迫[35]?；|(zhì)培養(yǎng)結(jié)果表明，堿脅迫（Na2CO3）下耐堿品種葉片SOD 和POD 活性顯著高于敏感品種[36]。因此，甜葉菊不同品種對鹽分濃度有一個特定的閾值，在此閾值范圍內(nèi)可通過調(diào)節(jié)自身保護酶系統(tǒng)維持正常代謝平衡，如增加大氣CO2濃度可顯著抑制NaCl 脅迫對光合速率的抑制[37]。研究還發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫（90～120 mmol/L NaCl）引起甜葉菊細胞鈣離子（Ca2+）水平的改變，進而轉(zhuǎn)導鹽脅迫信號，啟動基因表達和胞內(nèi)一系列生化過程來適應環(huán)境變化[38]。代謝物分析鑒定結(jié)果顯示，鹽脅迫下甜葉菊代謝產(chǎn)物表型發(fā)生了改變，氨基酸和胺類成為主要的滲調(diào)物質(zhì)[39]，這與丹參通過增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來緩解高鹽毒害相一致[40]。STV和RA 結(jié)構(gòu)中分別含有3 個和4 個葡萄糖分子，它們在鹽脅迫時的積累可能與甜葉菊的滲透調(diào)節(jié)過程有關，這是因為鹽脅迫激活抗逆系統(tǒng)，使植物細胞由初生代謝轉(zhuǎn)向次生代謝。離體培養(yǎng)條件下，鹽脅迫和堿脅迫對甜葉菊幼苗糖苷含量的影響不同，0.1%NaCl 和0.025%Na2CO3處理下甜葉菊葉片SGs含量（STV+RA）分別是對照的1.6 倍和3.3 倍[41]；溫室試驗中，30 mmol/L NaCl 的低鹽處理下RA 和STV 含量達到最高[42]；90、120 mmol/L NaCl 處理顯著降低RA 和STV 含量，但卻增加了RA/STV 的比值[43]。CANTABELLA 等[44]研究也表明，NaCl 處理25 d 后，甜葉菊幼苗SGs和RA 含量基本保持不變，STV 含量在2 g/L NaCl（約等于34 mmol/L）和5 g/L NaCl（約等于86 mmol/L）處理下分別增加了25%和降低了15%?；蛩綑z測結(jié)果進一步證實，NaCl 處理后，幾個編碼糖苷生物合成途徑的關鍵酶基因（CMS、CMK、HDR、UGT76G1）顯著上調(diào)[45]，鹽度還可通過提高UGT76G1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)STV 向RA 的轉(zhuǎn)化[43]。綜上，甜葉菊對鹽脅迫有一定的耐受性，屬于中度耐鹽植物，低鹽環(huán)境可能更有利于甜菊糖苷組分的優(yōu)化，這對控制RA 和STV 的相對含量具有重要意義，也為甜菊糖苷的積累提供了新的理論途徑。

3.2 外源物質(zhì)在甜菊糖苷抗鹽脅迫中的應用

3.2.1 營養(yǎng)物質(zhì)

植物抵抗脅迫的能力與其營養(yǎng)水平有著密切關系[46]，外源施用礦質(zhì)元素對脅迫具有一定的緩解作用[47]。葉面噴施營養(yǎng)液通過改善鹽脅迫下植株的根系特征和水分狀況幫助植物耐受過量的Na水平，如葉面噴施微量元素硼（B）、鐵（Fe）以及有益元素硒（Se）能夠顯著促進甜葉菊植株生長、提高葉片糖苷含量，并減輕NaCl脅迫對研究性狀的不利影響[48-49]。因此，研究不同元素的耐鹽機制對指導鹽堿地區(qū)施肥具有積極的應用價值。最新研究表明，被譽為天然植物促長劑的殼聚糖能夠誘導植物的化學防御活性，增強防御酶活性及次生代謝產(chǎn)物形成；在甜葉菊上的應用結(jié)果顯示，殼聚糖可以促進鹽脅迫下STV 和RA 的積累，通過增加鹽適應因子減少NaCl脅迫并提高甜菊糖苷的耐鹽能力[50]。

3.2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控作物生長發(fā)育的各個方面，同時增強作物抗逆性，如氯化氯代膽堿（矮壯素，一種季銨鹽類植物生長調(diào)節(jié)劑）能夠響應甜葉菊病原菌脅迫[51]。水楊酸（SA）是一種酚類物質(zhì)，在植物免疫反應中起至關重要的作用[52]，也參與植物對非生物脅迫的響應，外源施用SA 顯著改善鹽脅迫下擬南芥種子的萌發(fā)[53]。VAZQUEZ-HERNANDEZ等[54]研究發(fā)現(xiàn)0.1 mmol/L SA 顯著促進溫室條件下甜葉菊生長、提高SGs含量并增加SrKA13H、SrUGT85C2、SrUGT74G1和SrUGT76G1等與甜菊糖苷生物合成相關基因的表達，這與EL-HOUSINI[55]之前的研究結(jié)果相一致。表明SA 可能通過誘導廣泛的與植物抗性相關過程緩解鹽脅迫傷害，其中促進SGs積累或許是主要方式。

3.2.3 有益微生物

近年來，植物與微生物的關系備受關注，與根系相關的有益微生物可以促進植物生長，并有可能提高作物對未來干旱的抵抗力[56]。已有研究報道，根際益生菌如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）能夠產(chǎn)生揮發(fā)性化合物以拮抗植物土傳病原真菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporumf.sp.cubense）[57]，解淀粉芽孢桿菌還可以通過分泌亞精胺增強植物的抗鹽脅迫能力[58]。筆者在新疆庫爾勒地區(qū)的實驗結(jié)果顯示，土壤鹽堿化抑制甜葉菊生長，施用含有芽孢和木霉的生物有機肥能夠顯著緩解這種抑制作用，尤其是在長期連作甜葉菊的地塊，與對照相比，施用生物有機肥后發(fā)病率和病情指數(shù)顯著降低，相對防治效果則顯著升高[59]。因此，通過植物有益促生菌改善土壤微生物群落來調(diào)控甜葉菊的抗鹽堿脅迫能力以及甜菊糖苷的合成積累是切實可行的，但植物與微生物對脅迫反應的復雜反饋機制仍需深入探討。

4 重金屬脅迫

重金屬是限制作物產(chǎn)量的一個重要因子，尤其是在干旱及半干旱地區(qū)。鎘（Cd）在土壤中具有較強的化學活性，極易被植物吸收并存留在植物經(jīng)濟器官從而危害人體健康[60]，是目前危害性最為嚴重的重金屬之一。研究發(fā)現(xiàn)，超過3 mg/L Cd 即顯著抑制波斯菊種子萌發(fā)與幼苗生長，隨著Cd質(zhì)量濃度增加，幼苗的可溶性蛋白含量、MDA 含量、POD 活性和SOD 活性也發(fā)生顯著變化[61]。Cd 脅迫通過降低植物內(nèi)源激素水平抑制植物生長，外加激素能夠緩解這種抑制作用[62]。組培試驗結(jié)果表明，甜葉菊葉片的莖長、葉數(shù)、葉長等形態(tài)性狀隨培養(yǎng)基中Cd 濃度的增加而顯著下降，外源施用多胺（Polyamine,PA）則逆轉(zhuǎn)Cd的誘導效應[63]，這表明多胺代謝途徑變化可以響應重金屬脅迫過程。另外，礦質(zhì)元素在一定條件下也能夠緩解重金屬脅迫[52]，如外源鉬（Mo）降低Cd 脅迫對油菜的毒害[64]，Se、硫（S）和硅（Si）緩解Cd 對水稻的脅迫[65-68]，以上表明可以從營養(yǎng)水平開展礦質(zhì)元素及植物有益元素對重金屬脅迫下甜菊糖苷積累的研究。盡管重金屬脅迫影響植株生長，但對甜菊糖苷的積累卻有積極的作用，MIRZAEI 等[69]研究發(fā)現(xiàn)三氧化鉻（CrO3）、氧化鉛（PbO）、二氧化鈦（TiO2）等金屬氧化物導致參與STV 和RA 生物合成調(diào)控基因表達的增加。因此，如何協(xié)調(diào)重金屬抑制生長與促進糖苷積累二者之間的關系尤為重要。

5 展望

逆境脅迫對植物次生代謝產(chǎn)物的影響是顯而易見的。就甜葉菊而言，非生物脅迫一方面通過抑制植物的初生代謝過程抑制植物自身生長甚至引起不可逆的傷害；另一方面又可以激發(fā)植物體內(nèi)各種防御系統(tǒng)，產(chǎn)生大量次生代謝產(chǎn)物來抵御外界不良因子，這對于提高甜菊糖苷含量具有很好的指導意義。鑒于植物自身存在多種環(huán)境反應或調(diào)控機制，利用非生物脅迫誘導甜菊糖苷積累仍需更加全面深入地研究。

5.1 加強甜菊糖苷耐非生物脅迫的分子機制研究

次生代謝產(chǎn)物在提高植物自身保護和生存競爭能力、協(xié)調(diào)與環(huán)境關系上起著重要作用，長期的惡劣氣候條件可能導致甜葉菊基因構(gòu)成產(chǎn)生不同程度的變異，如干旱處理抑制糖苷合成相關的大部分基因轉(zhuǎn)錄[70]，但適度脅迫能夠激發(fā)植物的次生代謝途徑，可在一定程度提高藥用植物活性成分含量[71]。目前大多研究主要集中在基礎生理生化機制上，較少涉及其耐脅迫的遺傳機理和分子調(diào)控機制。今后應借助快速發(fā)展的分子生物學、生物信息學、代謝組學及轉(zhuǎn)錄組學等多學科手段，加速明確甜菊糖苷耐各種脅迫的分子途徑，最大限度挖掘甜葉菊自身的生物學潛力，通過鑒定與關鍵性狀和信號轉(zhuǎn)導途徑相關的基因，探索一條抗逆性、產(chǎn)量及品質(zhì)安全調(diào)控的新途徑，為育種或工程改造來改善甜葉菊及抗逆高效栽培提供依據(jù)，這對甜葉菊的可持續(xù)發(fā)展具有非常重要的理論和實踐意義。

5.2 加強甜菊糖苷對共脅迫的響應機制研究

不同脅迫引起植物在代謝和生理性狀、基因表達上產(chǎn)生特異反應，當兩種或幾種脅迫共存時，不同脅迫因子組合能夠產(chǎn)生加強、重疊或者拮抗效應[72]，冷害、熱害、高鹽導致的滲透脅迫以及氧化脅迫、重金屬和激素處理都會導致植物細胞質(zhì)自由鈣離子濃度增加，進而引發(fā)一系列生理生化反應。如低溫和高光強有利于銀杏葉中黃酮類化合物的積累，而高溫和高光強則有利于銀杏葉中萜內(nèi)酯含量的積累[73]。植物通過調(diào)節(jié)其次生代謝產(chǎn)物分配、權(quán)衡不同次生化學反應來適應復雜的環(huán)境變化，通過選擇性的調(diào)整、優(yōu)先對脅迫較大的因子做出響應。目前我國甜葉菊種植區(qū)域分布較廣，各地環(huán)境存在較大差異，主要脅迫表現(xiàn)形式也不同，如江蘇地區(qū)甜葉菊生長主要面臨夏季高溫及雨水導致的澇害，新疆地區(qū)主要面臨夏季的高溫脅迫和干旱脅迫以及長期連作導致的土壤營養(yǎng)脅迫等，未來研究應關注甜菊糖苷如何同步響應多個非生物脅迫，加強對脅迫信號的選擇性以及調(diào)整機制的研究。

5.3 加強非生物脅迫與甜菊糖苷積累的全生育期研究

已有非生物脅迫方面的研究大多集中于基質(zhì)培養(yǎng)、盆栽試驗及苗期處理，很少涉及大田生產(chǎn)及生育后期，后期需開展田間試驗以量化具體的參數(shù)設置。甜葉菊在不同生育時期對脅迫的抵御能力和防御機制不同，不同生育期脅迫對產(chǎn)量、品質(zhì)的影響也不同，尤其是在抗性品種選育中，鑒定品種的抗性應以關鍵時期的抗性表現(xiàn)為主[74]，不能只局限于苗期或個別生育時期的特征。對于藥用植物而言，形成其主要活性成分的次生代謝產(chǎn)物含量變化具有明顯的生育時期效應，如甜菊糖苷在現(xiàn)蕾期含量達到最大（干重的10%以上），如何優(yōu)化調(diào)控各個生育時期的生長以獲取最大產(chǎn)量的糖苷顯得尤為重要。因此，今后應結(jié)合產(chǎn)量及品質(zhì)因素加強全生育期研究，系統(tǒng)探索甜菊糖苷對不同非生物脅迫的適應機制。