張小紅，彭 瓊，鄢 錚

（福州市農(nóng)業(yè)科學研究所，福州 350018）

0 引言

甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam.]被認為是最具潛力的高產(chǎn)救荒糧食作物，具有易種植、自然適應(yīng)性廣、抗逆性強等優(yōu)點[1]。由于甘薯富含淀粉，能源產(chǎn)量較高，因此也被當作一種新型能源作物，用于燃料乙醇的生產(chǎn)[2]。中國作為甘薯的主要生產(chǎn)國，種植面積與產(chǎn)量早已超越其他國家，分別占全球總量的36.65%和63.84%[3]。但是，目前中國甘薯多數(shù)育成品種的遺傳組成都具有‘勝利百號’和‘南瑞苕’的成分，主栽品種種間遺傳基礎(chǔ)過于狹窄，不利于甘薯品種的遺傳改良，同時也制約著甘薯新品種的選育進程[4-5]。因此，對甘薯品種的遺傳多樣性進行分析，有助于明確甘薯種質(zhì)的差異，鑒定和評估優(yōu)質(zhì)甘薯種質(zhì)資源，了解甘薯品種間的親緣關(guān)系及遺傳背景，對甘薯的遺傳改良與新品種選育具有現(xiàn)實意義。

DNA分子標記是目前研究物種遺傳多樣性、鑒定物種種質(zhì)資源、構(gòu)建遺傳圖譜最高效可靠的方法，具有傳統(tǒng)標記所沒有的優(yōu)勢，在植物中已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用[6-9]。近年來，隨著基因組學和分子生物學的迅速發(fā)展，利用具有高通量特性的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)實現(xiàn)了分子標記的大規(guī)模挖掘，基于轉(zhuǎn)錄組測序的DNA分子標記技術(shù)也因此受到了極大的關(guān)注[10]。目前，以轉(zhuǎn)錄組測序為基礎(chǔ)開發(fā)的分子標記主要為簡單重復序列標記(Simple Sequence Repeats，SSR)和單核苷酸多態(tài)性標記(Single Nucleotide Polymorphsm,SNP)[10-11]。SSR作為第二代微衛(wèi)星分子標記技術(shù)，因其數(shù)量豐富、多態(tài)性高、重復性好、易于檢測等優(yōu)點，成為植物基因組分析的重要來源[12]。SNP 是由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，具有位點密度高、分布廣泛、代表性強、遺傳穩(wěn)定等特點，被認為是逐步取代過去其他分子標記的新一代分子標記技術(shù)[13-14]。

由于甘薯是一種異源六倍體植物，遺傳背景復雜，且存在自交不親等問題，僅根據(jù)表型性狀比較判斷，難以真實反映其遺傳差異和親緣關(guān)系，而DNA分子標記具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高且不受客觀環(huán)境影響等特點，因此已作為甘薯種質(zhì)資源研究及遺傳鑒定的一種重要手段[15-16]。Wang 等[17]基于甘薯轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得了8294 個SSR 重復位點，并設(shè)計了1060 對SSR 引物用于甘薯多態(tài)性評價和遺傳圖譜構(gòu)建。張超凡等[18]通過對12 對SSR 引物進行PCR 擴增，分析了31 份湖南甘薯品種的遺傳多樣性。Xie 等[19]從紫薯的轉(zhuǎn)錄組測序分析中搜索到851個潛在的SSR。Zhao等[20]利用高通量測序?qū)ψ先飧适怼┦?號’及其高花青素的突變體進行轉(zhuǎn)錄組分析，從7547個Unigenes中鑒定出2349個潛在的SSR 標記用于多態(tài)性研究。許家磊從‘徐781’和‘徐薯18’的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘到1386 個SNP 候選位點，并檢測了這些候選SNP 位點，提出了甘薯SNP 分子標記適合的檢測方法，可以用于甘薯SNP分子標記的開發(fā)[10]。

因此，鑒于SSR 和SNP 標記具有共顯性遺傳、檢測方便和多態(tài)信息含量高等特點，本研究基于甘薯轉(zhuǎn)錄組的測序數(shù)據(jù)，對潛在的SSR位點和SNP位點進行挖掘及特征分析，以此完善甘薯分子標記，為今后甘薯的種質(zhì)資源評估、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種等方面的研究提供有力參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料耐鹽甘薯品種‘榕薯819’和不耐鹽甘薯品種‘榕薯910’均由福州市農(nóng)業(yè)科學研究所提供。

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

將經(jīng)200 mmol/L NaCl 溶液處理0、3、6 天的不同基因型甘薯樣品進行Illumina 高通量測序（測序委托北京組學生物科技有限公司完成）。測序完成后，對原始數(shù)據(jù)(Raw data)進行過濾，再采用Trinity[21]組裝軟件對Clean reads 進行序列組裝，共獲得157252 條Unigenes，總長度為90649057 bp，平均組裝長度為576 bp。后續(xù)SSR及SNP分析均基于該Unigenes庫進行。

1.3 SSR及SNP分析

采 用MISA（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對Unigenes 進行SSR 檢測，鑒定SSR 類型，再根據(jù)SSR兩端互補序列，利用Primer3[22]進行SSR引物設(shè)計。以Unigene作為模板用e-PCR[23]做電子PCR，去除有多處比對的引物以保證設(shè)計引物擴增的唯一性。

利用針對RNA-Seq的STAR軟件[24]比對每個樣本的Reads 與Unigene 序列，使用GATK 軟件[25]識別測序樣品與Unigene 間的單堿基錯配，識別潛在的SNP 位點。GATK 識別標準為：（1）35 bp 范圍內(nèi)連續(xù)出現(xiàn)的單堿基錯配不超過3 個；（2）經(jīng)過序列深度標準化的SNP質(zhì)量值高于30。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分析

利用MISA 對Unigenes 進行SSR 分析，統(tǒng)計結(jié)果如表1 所示，甘薯轉(zhuǎn)錄組共獲得157252 條Unigenes 序列，序列總長度為90649057 bp，平均長度為576 bp。按照搜索標準，在157252 條Unigenes 序列中共發(fā)現(xiàn)SSR 位點33192 個，分布在24323 條Unigenes 中，發(fā)生頻率（含SSR 的Unigenes 數(shù)與總Unigenes 數(shù)之比）為15.47%。其中，6271 條Unigenes 含有超過1 個以上的SSR 位點。甘薯轉(zhuǎn)錄組中SSR 位點出現(xiàn)頻率（SSR 數(shù)目與總Unigenes的數(shù)目比值）為21.11%。SSR 位點的平均出現(xiàn)頻率為0.37 個/kb，即每2.73 kb 堿基序列就出現(xiàn)1個SSR位點。

研究共鑒定出全部6 種SSR 類型，涉及類型較為豐富，且各類型的出現(xiàn)頻率和所占比率各不相同（表1）。其中單核苷酸重復SSR 18718 個，雙核苷酸重復SSR 8121 個，三核苷酸重復SSR 5565 個，四核苷酸重復SSR 601個，五核苷酸重復SSR 129個，六核苷酸重復SSR 58 個，分別占總SSR 數(shù)量的56.39%、24.47%、16.77%、1.81%、0.39%以及0.17%。

表1 SSR分析結(jié)果統(tǒng)計

在甘薯轉(zhuǎn)錄組SSR 中，重復基元的種類較多，共觀察到120 種重復基元（表2）。其中單核苷酸重復基元有A/T、C/G 兩種，且A/T 數(shù)量最多，為18391 個，占SSR 總數(shù)的55.41%。雙核苷酸重復基元有4 種，所占比例最高的為AG/CT，共3706 個(11.17%)。三核苷酸重復基元有10 種，AAT/ATT 和AAG/CTT 數(shù)量最多，分別有1606 個(4.84%)和1325 個(3.99%)。四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復基元則分別有28 種）、40 種和36 種，除AAAT/ATTT之外（231 個，0.69%），其余核苷酸重復基元數(shù)量均在100個以下，占比不足1%。

表2 甘薯轉(zhuǎn)錄組的SSR重復基元類型分布

由表3 可以看出，甘薯耐鹽轉(zhuǎn)錄組SSR 重復基元中，單核苷酸重復基元的重復次數(shù)主要集中在10～12次，且在5～9次重復中并無重復基元，而其他核苷酸重復基元的重復次數(shù)則主要分布在5～8次之間。從表中可以看出，SSR 基元重復次數(shù)最多的為10 次，有6256個，其次為6 次，有4139 個。從總體趨勢上看，SSR 重復基元數(shù)是隨著重復次數(shù)的增加而遞減。

表3 甘薯轉(zhuǎn)錄組SSR重復基元的重復次數(shù)分布 次

由表4 可見，本研究中SSR 長度變化范圍主要分布在10～553 bp之間。其中長度在12～20 bp的SSR數(shù)量最多，共14075個，占總數(shù)的49.01%。其次為21～30 bp，共有SSR 3647 個，占總數(shù)的12.70%。長度在41～50 bp 和50～60 bp 的SSR 則分別有573 個和390 個，占比3.28%和2.00%。而長度分布在61～70 bp 以及71～80 bp的SSR占比最少，均不足1%，分別為0.80%（229個）和0.65%（188 個）。長度大于80 bp 的SSR 則有1873個，占總數(shù)的6.52%。由此可見，甘薯耐鹽轉(zhuǎn)錄組SSR主要集中在10～20 bp之間，多態(tài)性中等。

表4 甘薯轉(zhuǎn)錄組SSR重復序列的長度分布

篩選出可應(yīng)用的甘薯SSR，利用Primer 3 進行SSR引物設(shè)計，結(jié)果顯示，研究共獲得符合標準的引物15411 對，其中多態(tài)性較高的SSR（長度在20 bp 以上）共獲得3175對引物。部分引物序列參見表5。

表5 甘薯轉(zhuǎn)錄組部分SSR引物序列

2.2 SNP分析

研究利用GATK 軟件識別測序樣品潛在的SNP位點，在157252 條Unigenes 中挖掘到7691906 個SNP位點，SNP的分布密度為0.08個/bp，即平均約11.78 bp就會岀現(xiàn)1 個SNP 位點。從表6 中可以看出，轉(zhuǎn)換類型(Transition)有4729922個，占總數(shù)的61.49%，顛換類型(Transversion)有2961984個，占38.51%，轉(zhuǎn)換類型與顛換類型之比為1.60。在6 種突變類型中，同屬于轉(zhuǎn)換類型的C/T 和A/G 含量最高，分別為2487774 個和2242148 個，占總數(shù)的32.34%和29.15%。剩下的4 種顛換類型所占比例較低，分別為G/T 10.48%（806215個）、A/T 10.22%（785938 個）、C/G 9.31%（716147 個）以及A/C 8.50%（653684個）。

表6 甘薯轉(zhuǎn)錄組SNP類型統(tǒng)計

3 討論與結(jié)論

近年來，隨著新一代高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展和完善，基于轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)的SSR標記和SNP標記也成為了目前生物界最流行的用于遺傳圖譜構(gòu)建、基因功能研究、分子標記輔助育種的技術(shù)方法[10,26]。目前，國內(nèi)已有學者對基于甘薯轉(zhuǎn)錄組測序的SSR分子標記開發(fā)進行了研究，但相關(guān)報道仍少于其他作物，而SNP分子標記的研究更是處于相對滯后的狀態(tài)[27-28]。

本研究基于甘薯轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，共發(fā)現(xiàn)SSR 位點33192 個，出現(xiàn)頻率為21.11%，高于小麥(7.32%)[29]、玉米野生近緣種‘大芻草’(13.31%)[30]、印度南瓜(9.52%)[31]和辣椒(7.83%)[32]，同時也高于Wang 等[33](7.28%)、Li(4.88%)等[34]和Zhu(10.38%)等[35]其他學者對甘薯SSR的研究結(jié)果，表明本研究中SSR的分布密度較大，數(shù)量較為豐富。

在SSR 類型分布特征分析中，本研究共鑒定出全部6種SSR類型，涉及類型較為豐富，且各類型的出現(xiàn)頻率和所占比率各不相同，其中單核苷酸重復SSR所占比重最大，占總數(shù)的56.39%，這與火龍果[9]、木荷[36]、李府貢棗[8]等植物的研究結(jié)果相同。而鄭燕等[37]在對4 種禾本科植物（二穗短柄草、水稻、玉米、高粱）的SSR研究中發(fā)現(xiàn)，三核苷酸重復SSR數(shù)量最多，六核苷酸重復SSR 次之。蔣超等[38]研究發(fā)現(xiàn)，在金銀花及其變種紅白忍冬中，占主導地位的SSR為二核苷酸重復SSR，其次為三核苷酸重復SSR。由此可見，不同物種間的SSR分布特征相差較大，其原因可能是物種間的基因組大小存在差異。此外，有研究表明，除三核苷酸和六核苷酸主要發(fā)生在編碼區(qū)以內(nèi)之外，其余核苷酸類型均與非翻譯區(qū)相關(guān)[39]。本研究中，甘薯SSR 以單核苷酸為優(yōu)勢基元，表明該轉(zhuǎn)錄組Unigenes中包含了更多的非翻譯區(qū)信息。在單核苷酸重復基元中，A/T(55.41%)含量明顯高于C/G(0.99%)含量，這一結(jié)果符合植物單核苷酸重復基元中A/T 更為豐富這一規(guī)律[40]。在二核苷酸重復基元中，AG/CT所占比例最高，為11.17%，這也與前人的研究結(jié)果相一致[33]。

SSR分子標記的多態(tài)性是判斷其可用性的重要標準，SSR 的長度和重復次數(shù)是影響其多態(tài)性高低的重要因素[8,41]。當SSR長度在12 bp以下時，多態(tài)性較低；長度分布在12～20 bp 之間時，多態(tài)性中等；而長度大于20 bp時，多態(tài)性較高[8,41]。本研究中，甘薯SSR長度變化范圍主要分布在10～553 bp之間，其中長度在12～20 bp 的SSR 數(shù)量最多，共14075 個，占總數(shù)的49.01%。長度大于20 bp 的SSR 有7843 個，占總數(shù)的27.30%。由此可見，甘薯耐鹽轉(zhuǎn)錄組SSR主要集中在10～20 bp 之間，多態(tài)性中等，而長度大于20 bp 的SSR具有較高的多態(tài)性，可以作為甘薯SSR分子標記引物設(shè)計的依據(jù)。雖然SSR在基因組上的位置不盡相同，但是其兩端序列多是保守的單拷貝序列，因此根據(jù)SSR兩端互補序列來設(shè)計擴增引物，通過PCR反應(yīng)將得到的產(chǎn)物進行凝膠電泳，即可顯示SSR位點的多態(tài)性。本研究共獲得符合標準的引物15411 對，其中多態(tài)性較高的SSR（長度在20 bp以上）共獲得3175對引物，可為后續(xù)甘薯SSR多態(tài)性分析提供有效數(shù)據(jù)。

在SNP 特征分析中，研究共獲得7691906 個SNP位點，分布密度為0.08個/bp，即平均約11.78 bp就會出現(xiàn)1 個SNP 位點。SNP 分布密度顯著大于SSR，表明單核苷酸變異在甘薯的基因組中更易發(fā)生。其中，轉(zhuǎn)換類型(61.49%)所占比例明顯高于顛換類型(38.51%)，這與大多數(shù)植物的研究結(jié)果相一致。究其原因在于，DNA 序列中包含了大量的CpG 位點，而CpG 位點的胞嘧啶(C)極易發(fā)生突變，被甲基化后可以通過脫氨作用轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶(T)，從而形成了嘧啶和嘧啶之間的替換，使得轉(zhuǎn)換比例有所增加[42-43]。在6 種突變類型中，同屬于轉(zhuǎn)換類型的C/T和A/G含量最高，分別占總數(shù)的32.34%和29.15%，這與蛇足石杉[7]、火龍果[9]和李府貢棗[8]等植物的研究結(jié)果相同。

鑒于甘薯的遺傳背景較為復雜，DNA分子標記以其高穩(wěn)定性、高多態(tài)性等特點已成為甘薯種質(zhì)資源研究及遺傳鑒定的一種重要手段。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，結(jié)合生物信息學分析等方法，在甘薯中挖掘到大量SSR和SNP位點，豐富了甘薯分子標記類型。在對這些分子標記位點的特征分析中發(fā)現(xiàn)，本研究獲得的SSR 和SNP 數(shù)量較豐富，出現(xiàn)頻率較高，分布密度較大，具有較高的多態(tài)性。此外，獲得的這些SSR 和SNP 標記均來自甘薯轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)錄組來源的SSR和SNP多位于基因編碼區(qū)，可獲得與植物抗逆、生長發(fā)育等直接相關(guān)的功能基因表達信息，這也為甘薯功能基因的挖掘鑒定、分子標記輔助育種、甘薯遺傳結(jié)構(gòu)分析以及遺傳圖譜的構(gòu)建奠定了理論基礎(chǔ)。