蔣雅玲 胡學(xué)麗 陳 輝 段 智 劉 景 范先成 （長沙市第一醫(yī)院乳甲外科，長沙 410005）

乳腺癌是臨床常見癌癥之一，同樣也是導(dǎo)致女性腫瘤相關(guān)死亡的主要原因。隨著人口老齡化與生活方式改變，過去十幾年我國乳腺癌發(fā)病率急劇上升，且發(fā)病人群呈明顯年輕化趨勢［1］。盡管近年乳腺癌診療技術(shù)顯著提高，但局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移仍是影響患者預(yù)后的主要因素。因此，積極探究乳腺癌侵襲及轉(zhuǎn)移的潛在機制具有重要意義［2］。

人黑色素瘤分化相關(guān)基因-7（melanoma differentiation associated gene 7，MDA-7）是近年被發(fā)現(xiàn)并報道的抑癌基因IL-10家族成員，根據(jù)其生物學(xué)特性和染色體定位又被命名為IL-24。內(nèi)源性IL-24多表達于外周血單個核細胞、T細胞、B細胞及黑色素細胞等，但其在多種腫瘤細胞中呈缺失狀態(tài)［3］。臨床前研究表明，外源性IL-24在體內(nèi)體外均具有廣譜抗腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移活性，如黑色瘤、肺癌及乳腺癌等［3-5］。但IL-24在各種腫瘤中的具體作用機制不盡相同，其在乳腺癌中的抗癌機制尚未完全闡明。

趨化因子是一類具有趨化活性的龐大家族，研究證實趨化因子不僅參與炎癥反應(yīng)及免疫監(jiān)控過程，還參與調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展。大量數(shù)據(jù)表明乳腺癌組織中存在多種趨化因子受體及配體表達，其中以CX-C趨化因子受體4（CX-Cchemokine receptor 4，CXCR4）及其配體CXCL12表達最為顯著［6］。同時，多中心回顧性研究證實CXCR4表達增加與腫瘤高復(fù)發(fā)率、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較短生存期相關(guān)［7］。此外，在其他實體腫瘤中同樣證實CXCR4及其配體CXCL12可促進腫瘤細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移［8］。細胞中CXCR4/CXCL12主要通過PI3K/AKT/mTOR信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用，而IL-24可直接調(diào)控該信號通路抑制腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移［4，9］。因此課題組猜測，在乳腺癌中IL-24可能通過抑制高表達的CXCR4而發(fā)揮抑癌作用。AMD3100作為CXCR4/CXCL12軸的阻滯劑，可特異性地與CXCR4結(jié)合阻斷該軸信號傳導(dǎo)，從而有效抑制其生物學(xué)效應(yīng)［10］。鑒于以上研究背景，本研究擬采用慢病毒過表達乳腺癌細胞中IL-24以探究其對CXCR4的影響及相關(guān)作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 臨床資料 收集2018年1月至2019年12月于長沙市第一醫(yī)院乳甲外科行乳腺癌手術(shù)治療的乳腺癌組織50例，術(shù)后病理證實為乳腺癌，其中TNM分型Ⅰ期28例，Ⅱ期19例，Ⅲ期3例；病理分型：浸潤性導(dǎo)管癌33例，浸潤性小葉癌14例，混合癌3例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例，未見腋窩淋巴結(jié)28例。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療或免疫治療，年齡25～63歲，中位年齡42歲。另取距腫瘤邊緣＞3 cm的正常乳腺組織作為對照。本研究經(jīng)長沙市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準，患者或家屬知情同意。

1.1.2 細胞系及主要試劑 人正常乳腺上皮細胞MCF-10A、乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-231（美國ATCC細胞庫）；RPMI1640、L-15培養(yǎng)基、MCF-10A細胞專用培養(yǎng)基（美國Hyclone）；CXCR4/CXCL12軸阻滯劑AMD3100（美國Sigma公司）；胎牛血清（FBS，英國Gbico公司）；TRIzol（美國Thermo公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Abcam公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time PCR（北京天根生化科技有限公司）；IL-28過表達慢病毒（LV-IL-28）和陰性對照慢病毒（LV-NC）由上海吉凱基因生物公司構(gòu)建；Matrigel基質(zhì)膠（美國BD公司）；Transwell小室（8μm，美國Millipore公司）；大鼠抗p-mTOR、mTOR單克隆抗體（美國CST公司）；大鼠抗p-AKT、AKT、Bax、cleaved-Caspase-3、GAPDH單克隆抗體（美國Acris公司）；大鼠抗CXCR4單克隆抗體（美國Pierce Biotech公司）；HRP標記的兔抗大鼠二抗、Annexin V-FITC凋亡試劑盒（武漢博士德生物公司）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、慢病毒感染及分組 MCF-10A細胞采用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，MDA-MB-453與MDAMB-231細胞采用含10%FBS的L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-7細胞采用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均為：37℃、5%CO2，隔日更換培養(yǎng)液。取第3代以后且生長狀況良好的MDA-MB-231細胞用于感染慢病毒：調(diào)整細胞密度為1×105個/ml，接種于6孔板，待細胞生長融合至50%時，加入預(yù)先用Opti-MEM稀釋的病毒液（MOI=15），24 h后于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達情況，將培養(yǎng)基更換為含2μg/ml嘌呤霉素與10%FBS的L-15培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日更換培養(yǎng)基，3 d后得到穩(wěn)定傳代的感染細胞。取慢病毒感染后的MDA-MB-231細胞，按處理條件不同分為5組：LV-IL-24組（感染過表達IL-24慢病毒）、LV-NC組（感染陰性對照慢病毒）、AMD3100組（給予100 ng/ml AMD3100）、LV-IL-24+AMD3100組（采用含100 ng/ml AMD3100培養(yǎng)的感染過表達IL-24慢病毒的細胞）、陰性對照組（正常培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞）。將上述細胞置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，若無特殊說明，以下實驗均取培養(yǎng)24 h的各組MDA-MB-231細胞進行。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色（immuno-histochemical staining，IHC） 取石蠟包埋的乳腺癌組織，切片（4μm），常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫孵育，微波加熱恢復(fù)抗原，山羊血清封閉，分別滴加抗CXCL12（1∶1 000）與CXCL4（1∶800）的一抗，4℃孵育過夜，添加HRP標記的二抗，DAB染色液染色，中性樹脂封片，光鏡下拍照觀察。

1.2.3 RT-PCR 取慢病毒感染后的MDA-MB-231細胞，TRIzol法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，參考SYBR Green Real-time PCR試劑說明進行RTPCR，引物序列為IL-24 F：5＇-AAGCCTGTGGACTTTAGCCAGACC-3＇，IL-24 R：5＇-GCACTCGTGATGTTATCCTGAGC-3＇；GAPDH F：5＇-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3＇，GAPDH R：5＇-AGTACACCCATCGAATTCCAGT-3＇，以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法分析。實驗單獨重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA 按照IL-24 ELISA試劑盒說明檢測感染慢病毒后MDA-MB-231細胞上清中IL-24表達。實驗單獨重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell實驗 預(yù)先采用稀釋的Martrigel基質(zhì)膠包被Transwell上室，取轉(zhuǎn)染后的MDA-MB-231細胞，常規(guī)消化，以不含F(xiàn)BS的L-15培養(yǎng)液重懸細胞，2×105個/孔接種至Transwell上室，加入200μl無血清培養(yǎng)基。分組處理按1.2.1進行。下室加入600μl含10%FBS的常規(guī)L-15培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。取出上室，無水乙醇固定，結(jié)晶紫染色，雙蒸水沖洗，顯微鏡下隨機選取5個視野觀察拍照，計數(shù)各組穿膜細胞數(shù)。每組設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實驗 以2×105個/孔將上述感染的MDA-MB-231細胞接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞生長融合至70%時，用移液器槍頭垂直培養(yǎng)皿底部劃2條間隔為5 mm的橫線，按1.2.1分組干預(yù)，并將培養(yǎng)基更換為含2%FBS的L-15繼續(xù)培養(yǎng)24 h，倒置顯微鏡下觀察拍照，NIS-Elements軟件測量細胞間距離并分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.7 Annexin V-FITC細胞凋亡實驗 取1.2.1中各組細胞，800 g離心5 min，棄上清，收集細胞沉淀，按Annexin V-FITC試劑盒說明進行染色、孵育。過濾細胞團塊后上機分析。實驗重復(fù)3次。

1.2.8 Western blot 取待測細胞，預(yù)冷PBS洗滌，聯(lián)合使用RIPA細胞裂解液與蛋白酶抑制劑提取總蛋白。BCA法進行蛋白定量，加熱變性。取適量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗：CXCR4（1∶600）、AKT（1∶1 000）、p-AKT（1∶800）、mTOR（1∶1 000）、p-mTOR（1∶800）、Bax（1∶1000）、cleaved-Caspase-3（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）4℃搖床孵育過夜。TBST清洗，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST再次清洗，均勻滴加ECL發(fā)光液后于凝膠成像儀曝光拍照。Bio-Rad圖像軟件分析，以GAPDH為內(nèi)參。實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）的LSD-t檢驗，免疫組化陽性率比較采用χ2檢驗；采用秩相關(guān)分析進行相關(guān)性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌中CXCL12與CXCR4表達 IHC結(jié)果顯示，CXCL12和CXCR4在癌旁正常乳腺組織中的表達陽性率分別為12.0%（6/50）、18.0%（9/50），在乳腺癌組織中的陽性表達率分別為82.0%（41/50）、78.0%（39/50）。與正常乳腺組織相比，乳腺癌組織中CXCL12與CXCR4表達顯著增加（P＜0.01，圖1）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CXCL12與CXCR4表達呈正相關(guān)（rs=0.613，P＜0.05，表1）。

表1 乳腺癌組織CXCL12與CXCR4表達的相關(guān)性Tab.1 Correlation between CXCL 12 and CXCR4 expressions in breast cancer tissue

2.2 乳腺癌細胞中CXCR4表達 Western blot結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮細胞MCF-10A相比，乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231中CXCR4表達顯著增加（P＜0.01），MDA-MB-231細胞變化最為顯著，故選擇該細胞進行后續(xù)實驗（圖2）。

圖2 乳腺癌細胞系中CXCR4表達Fig.2 Expression of CXCR4 in breast cancer cell lines

2.3 慢病毒感染后乳腺癌細胞IL-24表達 熒光顯微鏡觀察感染72 h后的感染效率，結(jié)果顯示感染LV-NC與LV-IL-24的MDA-MB-231細胞可見明顯綠色熒光信號表達，且轉(zhuǎn)染效率達80%以上，而陰性對照組細胞無綠色熒光信號產(chǎn)生（圖3A）；RT-PCR和ELISA結(jié)果表明，與陰性對照組相比，感染LVIL-24慢病毒的乳腺癌細胞IL-24 mRNA及蛋白表達均顯著增加（P＜0.05），而感染LV-NC的細胞IL-24mRNA及蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖3B、C）。

圖3 慢病毒感染后乳腺癌細胞中IL-24表達Fig.3 IL-24 expression in breast cancer cells after lentivirus infection

2.4 過表達IL-24對乳腺癌細胞侵襲的影響 Transwell檢測過表達IL-24對乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲的影響，結(jié)果顯示與陰性對照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細胞侵襲能力顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低最為顯著（P＜0.01），LV-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖4）。

圖4 過表達IL-24對乳腺癌細胞侵襲的影響Fig.4 Effects of overexpression of IL-24 on invasion of breast cancer cells

2.5 過表達IL-24對乳腺癌細胞遷移的影響 劃痕實驗檢測過表達IL-24對乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移能力的影響，結(jié)果表明：與陰性對照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細胞遷移能力顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低最為顯著（P＜0.01），LV-NC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖1乳腺癌組織與癌旁正常組織CXCL12與CXCR4表達（IHC，×400）Fig.1 Expressions of CXCL 12 and CXCR4 in breast cancer and para-carcinoma tissues（IHC，×400）

圖5 過表達IL-24對乳腺癌細胞遷移的影響Fig.5 Effects of overexpression of IL-24 on migration of breast cancer cells

圖7過表達IL-24對乳腺癌細胞CXCR4與AKT/mTOR信號通路及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase-3表達的影響Fig.7 Effects of overexpression of IL-24 on expressions of CXCR4 and AKT/mTOR signaling pathways and apoptosis-related proteins Bax and Caspase-3 in breast cancer cells

2.6 過表達IL-24對乳腺癌細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC細胞流式檢測過表達IL-24對乳腺癌細胞MDA-MB-231凋亡的影響，結(jié)果表明：與Control組細胞相比，LV-IL-24組，AMD3100組，LV-IL-24+AMD3100組細胞凋亡率均顯著升高（P＜0.05），其中以LV-IL-24+AMD3100組升高最為顯著（P＜0.01），LV-NC組無明顯變化（P＞0.05，圖6）。

圖6 過表達IL-24促進乳腺癌細胞發(fā)生凋亡Fig.6 Overexpression of IL-24 promotes apoptosis of breast cancer cells

2.7 過表達IL-24對CXCR4、AKT/mTOR信號通路和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot結(jié)果如圖7所示，與陰性對照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細胞CXCR4蛋白表達與AKT和mTOR磷酸化水平顯著降低（P＜0.05），LV-IL-24+AMD3100組降低趨勢最為顯著（P＜0.01），LV-NC組細胞上述蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與陰性對照組相比，LV-IL-24組、AMD3100組、LV-IL-24+AMD3100組細胞凋亡相關(guān)蛋白Bax與Caspase-3表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），IL-24+AMD3100組升高趨勢最為顯著（P＜0.01，P＜0.001），LV-NC組細胞Bax與Caspase-3蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

研究表明，腫瘤轉(zhuǎn)移模擬了正常生理過程的多種機制，如由趨化因子系統(tǒng)參與調(diào)節(jié)的白細胞轉(zhuǎn)運及歸巢，即腫瘤細胞能夠通過其表達的趨化因子受體向分泌該配體的組織或器官進行特定轉(zhuǎn)移［11］。而眾多趨化因子受體中，CXCR4在乳腺癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)CXCR4與其配體CXCL12相互作用后能夠促進乳腺癌細胞遷移、侵襲并抑制其凋亡，而臨床研究同樣證實高表達CXCR4的乳腺癌患者具有更高的腫瘤復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移活性［6-7］。本研究通過IHC檢測CXCR4與CXCL12在乳腺癌與癌旁正常乳腺組織中的表達結(jié)果同樣表明，CXCR4與CXCL12在乳腺癌中的表達較健康人群明顯升高，且兩者表達呈正相關(guān)。

近年IL-24因其對人黑色瘤生長及分化的影響而備受關(guān)注。大量數(shù)據(jù)顯示，IL-24可誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，但其對正常細胞卻無明顯毒性，且內(nèi)源性IL-24多表達于免疫相關(guān)組織與細胞，如脾臟、胰腺及T細胞、B細胞，但多數(shù)人類起源的癌細胞中，IL-24表達呈缺失狀態(tài)，同樣提示IL-24可能具有抑癌活性［12-13］。但IL-24抑制腫瘤的機制較為復(fù)雜，其在不同腫瘤類型中涉及的信號通路也可能存在差異。如在黑色素瘤中，IL-24能夠通過p38MAPK與ERK信號通路促進核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)所誘導(dǎo)的細胞凋亡［14］；而膠質(zhì)瘤中IL-24能夠活化JNK信號通路促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終通過線粒體途徑下調(diào)腫瘤細胞存活率［15］。此外，研究表明IL-24還能夠通過抑制口腔鱗癌與肺腺癌細胞中CXCR4表達抑制腫瘤進展［16-17］。最新研究表明IL-24能夠通過磷脂酰肌醇-3（phosphatidyl inositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）/雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路在體內(nèi)外抑制乳腺癌細胞周期進展，從而促進其凋亡［18］。PI3K/AKT/mTOR信號通路是細胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其中PI3K是一種異質(zhì)二聚體，通過其跨膜受體的胞外結(jié)構(gòu)域與環(huán)境中的各種受體，如生長因子、G蛋白偶聯(lián)受體等相互作用，引起自身構(gòu)象改變而被激活，進而誘導(dǎo)下游AKT磷酸化，并使其與胞膜分離，釋放進入細胞質(zhì)，活化一系列底物并使后者發(fā)生磷酸化，其中最重要的為mTOR［19］。而PI3K/AKT/mTOR是CXCR4/CXCL12在乳腺癌中的主要作用機制。CXCR4與CXCL12特異性結(jié)合后可激活腫瘤細胞內(nèi)域G蛋白偶聯(lián)受體，從而啟動上述信號通路［8，20］。本研究首先選取CXCR4表達最為顯著的乳腺癌細胞系MDAMB-231進行研究，隨后采用慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達細胞中的IL-24，驗證感染效率后，體外實驗結(jié)果表明過表達IL-24能夠顯著抑制乳腺癌細胞侵襲、遷移，促進其凋亡，且聯(lián)合使用AMD3100時，IL-24對腫瘤細胞上述生物學(xué)行為的影響更為顯著。Western blot進一步表明，IL-24在乳腺癌中同樣能夠抑制CXCR4表達，同時下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路，促進乳腺癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax與Caspase-3表達。提示在乳腺癌中IL-24一方面能夠通過抑制CXCR4表達，一方面能通過PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮對CXCR4/CXCL12軸的抑制作用，且聯(lián)合應(yīng)用AMD3100后其抑癌效果更為顯著，與其在肺癌中的作用途徑相似，即均能通過抑制CXCR4表達及下游PI3K/AKT/mTOR通路發(fā)揮作用，而聯(lián)合應(yīng)用CXCR4拮抗劑AMD3100療效更佳［21］。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞中過表達IL-24可抑制CXCR4表達，通過下調(diào)PI3K/AKT/mTOR信號通路降低腫瘤細胞侵襲、遷移能力，促進其凋亡，且聯(lián)合使用CXCR4/CXCL12阻滯劑AMD3100可顯著提高IL-24的上述抑癌效應(yīng)。本研究結(jié)果進一步證實IL-24在乳腺癌發(fā)展進程中具有潛在保護作用，而IL-24有望成為乳腺癌治療的新策略。