劉峰宇，韓 薇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150000)

心力衰竭(heart failure)是各種心臟疾病的終末期階段，其病死率和再住院率居高不下。近年來心力衰竭治療藥物和設(shè)備不斷取得進(jìn)展，但中國心力衰竭患病率依然呈持續(xù)升高趨勢[1]。心力衰竭的機(jī)制復(fù)雜多樣，至今尚未完全闡明，因此，迫切需要進(jìn)一步的認(rèn)知及新的治療方案。本綜述從分子水平上闡述心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)機(jī)制及其與心力衰竭的關(guān)系，識別在發(fā)病過程中影響鈣穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵蛋白，為心力衰竭的診療提供潛在靶點和新的策略。

1 心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)的生理特性

鈣作為第二信使，具有多種信號傳導(dǎo)作用，參與從肌肉收縮到細(xì)胞死亡的各種過程。這些過程的發(fā)生，依賴于通過鈣通道、ATP酶泵、離子轉(zhuǎn)運(yùn)體和交換器與鈣結(jié)合蛋白等協(xié)同工作。心肌細(xì)胞的收縮功能受興奮-收縮耦聯(lián)(excitation-contraction coupling,ECC)的調(diào)控。收縮過程中，動作電位引起細(xì)胞膜去極化，使少量的細(xì)胞外鈣通過電壓門控的L型鈣通道(L-type calcium channel，LTCC)進(jìn)入胞質(zhì)。這種鈣與2型蘭尼堿受體(ryanodine receptor 2,RyR2)結(jié)合，形成鈣火花，引發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)內(nèi)鈣通過RyR2短時間大量外流入胞質(zhì)，產(chǎn)生鈣瞬變，這個過程被稱為鈣誘導(dǎo)鈣釋放(calcium induced calcium release,CICR)。細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增加約10倍，激活鈣敏感的收縮蛋白(肌鈣蛋白C，troponin C,Tn-C)，Tn-C利用線粒體所產(chǎn)生的ATP產(chǎn)生肌肉收縮。舒張期鈣主要通過鈉鈣交換器(sodium-calcium exchanger，NCX)和質(zhì)膜鈣ATP酶(plasma membrane calcium ATPase,PMCA)從胞質(zhì)中排出，約30%被轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞，70%通過心臟肌/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2a(sarco-endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a,SERCA2a)泵回SR。

心肌細(xì)胞線粒體供能對維持鈣穩(wěn)態(tài)，以保障正常的收縮功能至關(guān)重要。此外，線粒體在介導(dǎo)細(xì)胞信號和細(xì)胞死亡途徑方面也發(fā)揮重要作用。線粒體的功能需要線粒體內(nèi)鈣的參與[2]，線粒體鈣單轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrial Ca2+uniporter，MCU)是線粒體鈣攝取的主要途徑，其活性依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣濃度；線粒體鈣從基質(zhì)中排出是通過線粒體鈉鈣(Na+/Ca2+)交換器(MNCX)、MCU的反轉(zhuǎn)和/或線粒體內(nèi)膜的通透性轉(zhuǎn)變來完成的。

2 心力衰竭時鈣穩(wěn)態(tài)的病理性改變

鈣處理和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白障礙導(dǎo)致細(xì)胞鈣瞬變振幅降低，持續(xù)時間延長，其結(jié)果是心肌收縮性降低，心輸出量減少。鈣處理蛋白的改變也會損害心臟傳導(dǎo)性，導(dǎo)致致命性心律失常[3]。下文從過量鈣進(jìn)入胞質(zhì)、肌質(zhì)網(wǎng)膜鈣攝取降低、肌質(zhì)網(wǎng)鈣含量減少以及鈣從肌質(zhì)中滲漏等方面討論心肌細(xì)胞在心力衰竭過程中的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)。

2.1 細(xì)胞膜鈣轉(zhuǎn)運(yùn)障礙

2.1.1 L型鈣通道:在人類心肌細(xì)胞中，胞質(zhì)鈣內(nèi)流幾乎全部通過LTCC發(fā)生。在心力衰竭期間，LTCC的磷酸化增加，衰竭的心肌細(xì)胞中結(jié)構(gòu)組織喪失導(dǎo)致功能性LTCC從T管重新分布到肌膜[4]。Junctophilin-2(JPH2)是心肌細(xì)胞膜橫向T管與RyR2間形成的膜耦聯(lián)復(fù)合物(JMCs)的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，在JPH2連接區(qū)域中誘導(dǎo)突變的JPH2(mutPG1JPH2)引起T管重塑，表明LTCC和JPH2之間的相互作用對于T管穩(wěn)定至關(guān)重要[5]。在心臟病動物模型中，使用鈣通道阻滯劑可防止或逆轉(zhuǎn)病理性心臟重構(gòu)。然而，臨床實驗中，非二氫吡啶類鈣通道阻滯劑增加射血分?jǐn)?shù)減低型心力衰竭患者病死率和遲發(fā)性心力衰竭的發(fā)生率，這與鈣通道阻滯劑的負(fù)性肌力作用及神經(jīng)內(nèi)分泌的激活相關(guān)。

2.1.2 鈉鈣交換器:NCX是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是真核細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的主要分子之一。生理情況下以正向模式工作，3個Na+進(jìn)入細(xì)胞，1個Ca2+排出細(xì)胞。在心力衰竭期間，心肌細(xì)胞內(nèi)Na+濃度上升，使NCX反向工作，導(dǎo)致在舒張期細(xì)胞內(nèi)鈣外流減少，同時減緩鈣瞬變衰減速率，繼而導(dǎo)致胞質(zhì)鈣超載。NCX的體外過表達(dá)損害心肌細(xì)胞的收縮功能。在心力衰竭動物模型中，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白(neuroglin-1β)的應(yīng)用抑制NCX1的增加[6]，NCX慢性抑制劑SEA0400及ORM-11035的應(yīng)用可維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)，改善離體及在體心臟的舒張功能，抑制心室重構(gòu)的發(fā)生[7]。

2.1.3 鈣庫操作性鈣離子通道:鈣庫操作性鈣離子通道((store-operated calcium entry，SOCE)是介導(dǎo)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重要通道之一，其核心由定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的基質(zhì)相互作用分子(stromal interaction molecule，STIM)和定位于細(xì)胞膜上的Ca2+選擇性通道Orai蛋白構(gòu)成[8]。SOCE可以感知細(xì)胞內(nèi)鈣耗竭并開放通道允許細(xì)胞外鈣內(nèi)流，這一過程在心力衰竭的病理重塑過程中被加強(qiáng)。在主動脈縮窄所致心力衰竭的小鼠模型中，Orai1表達(dá)增加并出現(xiàn)Orai1依賴性SOCE開放，Orai1抑制劑的應(yīng)用對心力衰竭小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用[9]。表明抑制SOCE過度開放是治療心臟收縮功能障礙的一種潛在的有效治療方法。

2.2 肌質(zhì)網(wǎng)與鈣穩(wěn)態(tài)

2.2.1 肌/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2a:SERCA2a是心肌細(xì)胞鈣循環(huán)過程的關(guān)鍵蛋白，在心力衰竭的動物模型和患者中，SERCA2a的表達(dá)和活性均降低。SERCA2a敲除大鼠表現(xiàn)出明顯收縮功能障礙。

SERCA2a的生理功能受到多種蛋白的調(diào)控。PLN對SERCA2a活性的調(diào)控至關(guān)重要，PLN是肌漿網(wǎng)中的一種小磷蛋白，在心肌細(xì)胞中可逆地抑制SERCA2a，從而減少鈣離子流入SR。PLN可被鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)或蛋白激酶B(Akt)磷酸化。當(dāng)PLN一或兩個位點被磷酸化時，其對SERCA2a的抑制作用減輕。心力衰竭期間心臟PLN蛋白的表達(dá)沒有變化，由于SERCA2a表達(dá)減少致PLN/SERCA2a比值升高，導(dǎo)致PLN對SERCA2a抑制增強(qiáng)。SERCA2a的翻譯后修飾對其活性影響同樣重要，小的泛素樣修飾物1(SUMO1)過表達(dá)可增加SERCA2a的SUMO蛋白質(zhì)修飾化，改善心力衰竭小鼠及豬的心臟功能[10]。

2.2.2 蘭尼堿受體(RyR2):RyR2介導(dǎo)的鈣從SR釋放到胞質(zhì)是興奮收縮耦聯(lián)過程中的關(guān)鍵事件。在肌肉舒張過程中，RyR2通道必須保持緊密閉合，以便SR鈣庫得到補(bǔ)充。在心力衰竭期間，RyR簇被破壞，導(dǎo)致較慢的Ca2+釋放動力學(xué)和舒張期Ca2+泄漏[11]。增加的β-腎上腺素能信號導(dǎo)致cAMP依賴性蛋白激酶(PKA)在Ser28088及Ser2030位點過度磷酸化RyR2，導(dǎo)致其與通道穩(wěn)定蛋白FKBP12.6的結(jié)合受損，RyR2的開放概率增加并在舒張期從SR泄漏鈣。在消融PKA心臟中，RyR2在兩位點均不能被磷酸化[12]。依賴于CaMKII的RyR2磷酸化也是心力衰竭中鈣通道活性的重要調(diào)節(jié)器。心力衰竭患者CaMKII水平升高以及依賴CaMKII的RyR2磷酸化增加，可能是舒張期SR鈣釋放增加的另一種機(jī)制。

2.2.3 肌質(zhì)網(wǎng)鈣緩沖蛋白:肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣緩沖蛋白在EC耦聯(lián)過程中起重要作用。心肌肌質(zhì)網(wǎng)中主要的鈣緩沖蛋白是鈣固縮蛋白異構(gòu)體2(calsequestrin 2，CASQ2)，其通過降低肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)游離鈣離子濃度來促進(jìn)SERCA2a在舒張期攝取鈣離子，保證收縮期時肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)有足夠的鈣儲備。CASQ2在mRNA和蛋白水平在心力衰竭中沒有改變，但在CASQ2敲除小鼠中上調(diào)肌質(zhì)網(wǎng)對鈣的攝取導(dǎo)致心肌肥厚、收縮功能障礙與早期死亡率增加。

另一種認(rèn)為在鈣吸收和釋放中起作用的肌質(zhì)網(wǎng)鈣結(jié)合蛋白，是組氨酸豐富鈣結(jié)合蛋白(histidine rich calcium binding protein,HRC)。在心臟肌質(zhì)網(wǎng)的管腔中發(fā)現(xiàn)的HRC已經(jīng)被證明通過連接素(一種輔助膜蛋白)與SERCA2a和RyR2相互作用，這表明它與鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。在心力衰竭動物模型中，非典型激酶Fam20C可以介導(dǎo)HRC、CASQ2及STIM1磷酸化，在維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)中起重要作用[13-14]。

2.2.4 線粒體與鈣穩(wěn)態(tài):線粒體是心肌收縮所需的ATP形式的主要能量來源，Ca2+對線粒體功能調(diào)控至關(guān)重要。線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)會損害線粒體功能，從而加重心力衰竭。線粒體基質(zhì)中的[Ca2+]受MCU嚴(yán)格調(diào)控[15]。在衰竭的人類心臟和心力衰竭動物模型中，MCU水平升高[16-17]。但心力衰竭中線粒體鈣如何變化尚有爭議。

一方面認(rèn)為線粒體鈣在心力衰竭中減少，其觀點主要包括以下4方面：1)心力衰竭心肌細(xì)胞SR鈣釋放速率和幅度的降低，降低線粒體對鈣的攝?。?)心力衰竭時NCX反向工作，但NCX介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流在觸發(fā)線粒體Ca2+攝取方面效率較低。3)MNCX活性的決定因素是跨線粒體膜的鈉濃度梯度，在衰竭的心肌細(xì)胞中，升高的[Na+]加速線粒體Ca2+排出。4)心力衰竭時SR-線粒體Ca2+微域本身的結(jié)構(gòu)也受到干擾，包括T管重塑，線粒體的異常聚集和連接SR的無序結(jié)構(gòu)。

另一方面認(rèn)為心力衰竭時線粒體鈣超載，在心肌梗死心力衰竭小鼠模型中，線粒體Ca2+超載，通過抑制線粒體Ca2+外流加重心力衰竭，而過表達(dá)NCLX可改善心力衰竭。這種相悖的理論及實驗結(jié)果可能是因為不同動物種類離子通道生理特性的差異，或各類心力衰竭模型中線粒體鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)與心力衰竭發(fā)生的先后順序的不同，其潛在機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)的治療

對正常和病理狀態(tài)心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和信號的理解使得針對鈣處理蛋白治療的發(fā)展成為可能。治療的方向主要集中在通過增加肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取或防止肌質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏，以改善肌質(zhì)網(wǎng)功能以維持鈣穩(wěn)態(tài)。

3.1 增加肌質(zhì)網(wǎng)鈣攝取

在心力衰竭期間，SERCA2a的表達(dá)和活性降低。在阿霉素誘導(dǎo)的大鼠心力衰竭模型中，應(yīng)用比索洛爾可提高SERCA2a活性從而改善心功能[18]。將SERCA2a基因轉(zhuǎn)移到衰竭的人心肌細(xì)胞中可改善其收縮功能，在多種心力衰竭模型動物應(yīng)用腺相關(guān)病毒(AAV)心臟特異性過表達(dá)SERCA2a治療取得療效并評估安全性后后，2008年進(jìn)行了首項人轉(zhuǎn)基因治療心力衰竭臨床實驗。CUPID(calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease)是第一項應(yīng)用AAV1過表達(dá)SERCA2a治療晚期心力衰竭患者的臨床實驗，SERCA2a過表達(dá)可改善患者心力衰竭癥狀和/或延緩心力衰竭的進(jìn)展，且對心臟的保護(hù)作用與治療的劑量呈正相關(guān)。然而，在后來的CUPID2及AGENT-HF實驗結(jié)果顯示，AAV1/SERCA2a并沒有改善心力衰竭和射血分?jǐn)?shù)降低的患者的臨床病程[19]。這一陰性結(jié)果可能是源于研究納入的患者心臟對載體的傳遞和攝取不足。后續(xù)SERCA-LVAD研究在應(yīng)用左室輔助裝置患者心臟中應(yīng)用AAV1過表達(dá)SERCA2a，在CUPID2報告中性結(jié)果后試驗終止，同樣取得陰性結(jié)果[20]。SERCA2a基因過表達(dá)治療心力衰竭領(lǐng)域，安全性已得到證實，其治療方案及后續(xù)效果有待進(jìn)一步探索。

針對SERCA2a的翻譯后修飾，近年不斷取得進(jìn)展。SUMO1和S100A1的基因轉(zhuǎn)移均能促進(jìn)SERCA2的活性，改善心力衰竭嚙齒動物和豬的心臟功能。SIRT1(sirtuin-1，III類組蛋白去乙?；?)與p300(一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶)在賴氨酸493位點去乙?；?，可恢復(fù)SERCA2a活性[21]。硝基氧基(HNO)通過直接翻譯后修飾靶蛋白(尤其是心肌細(xì)胞中的SERCA2a，PLN)上的巰基殘基，提高心臟收縮能力[22]。BMS-986231是一種HNO供體，其臨床應(yīng)用安全性及治療效果在StandUP-AHF，StandUP-Imaging和StandUP-Kidney等II期臨床實驗中初步驗證[23]。

3.2 防止肌質(zhì)網(wǎng)鈣泄漏

過度磷酸化或不穩(wěn)定的RyR2通道導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)在舒張期鈣滲漏，導(dǎo)致SR鈣含量降低和收縮期鈣瞬變減少，進(jìn)而導(dǎo)致收縮性降低和心輸出量減少。抑制PKA或CaMKII過度磷酸化RyR2的一種治療策略是過表達(dá)RyR2調(diào)節(jié)蛋白FKBP12.6。FKBP12.6在小鼠心臟特異性過表達(dá)，或腺病毒介導(dǎo)的離體兔心肌細(xì)胞導(dǎo)致RyR2穩(wěn)定，增加肌質(zhì)網(wǎng)鈣含量，并改善心肌細(xì)胞收縮性。

一些部分抑制RyR2活性的藥物(氟卡胺、卡維地洛)可以減少舒張期鈣滲漏。丹曲林作為一種惡性高熱急性期治療藥物，用于心力衰竭期間，可選擇性地減少舒張期Ca2+泄漏，且不會抑制收縮期間的Ca2+釋放，驗證其對慢性心力衰竭患者的安全性和有效性的臨床實驗“SHO-IN”(日本臨床試驗注冊證標(biāo)識符61180059)正在進(jìn)行[24]。與丹曲林同屬于海因衍生物的苯妥英鈉亦可有效抑制RyR2介導(dǎo)的Ca2+釋放，其抑制作用與丹曲林相當(dāng)，且具有更好的安全性[25]，但其在心力衰竭以及心律失?；颊咧械膽?yīng)用仍需臨床研究進(jìn)一步驗證。一種新型藥物Rycals，可通過變構(gòu)機(jī)制阻止RyR2的解離以穩(wěn)定RyR2通道，從而減少SR的Ca2+泄漏。Rycals治療RyR1相關(guān)性肌病的臨床試驗(clinicaltrials.gov標(biāo)識符NCT04141670)正在進(jìn)行中，鑒于其特殊的藥理作用，今后有望應(yīng)用于心力衰竭治療領(lǐng)域。

4 問題與展望

鈣穩(wěn)態(tài)的維持受復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，而鈣穩(wěn)態(tài)受損是心力衰竭的一個關(guān)鍵特征，其導(dǎo)致心肌收縮功能障礙和心律失常的發(fā)生。心力衰竭時鈣穩(wěn)態(tài)缺陷最常見的原因為鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、離子通道以及酶的表達(dá)及功能改變，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)鈣超載，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣含量減少。許多實驗結(jié)果促進(jìn)了對這些途徑的理解，針對改善鈣穩(wěn)態(tài)缺陷的治療方法近年來不斷發(fā)展，目前在動物模型和臨床實驗中已取得成效，但由于藥物不良反應(yīng)的影響，以及對鈣穩(wěn)態(tài)機(jī)制認(rèn)識不足，限制了部分實驗結(jié)果向臨床的進(jìn)一步轉(zhuǎn)化。隨著對機(jī)制的認(rèn)識深入以及治療方法的探索，維持心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)在未來對心力衰竭的治療中將取得更大進(jìn)展。